一种纳米佐剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种纳米佐剂及其制备方法和应用 (Nanometer adjuvant and preparation method and application thereof ) 是由 梁兴杰 王永超 宫宁强 张宇轩 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种纳米佐剂及其制备方法和应用,所述纳米佐剂包括两亲性树形化合物的组装体,以及包载于所述组装体中的光敏剂。所述纳米佐剂具有可控激活的特点,在正常生理条件下为球形纳米颗粒,在肿瘤的局部被近红外光激活发挥免疫佐剂的效应,促进肿瘤抗原的提呈,提高特异性的肿瘤免疫反应；同时,这种在肿瘤局部激活的免疫佐剂效应大大降低了所述纳米佐剂的系统性毒性,赋予其安全、高效的特性。所述纳米佐剂通过薄膜分散法得到,制备方法简单、成本低,易于大规模推广,具有广阔的应用前景。(The invention provides a nano adjuvant and a preparation method and application thereof, wherein the nano adjuvant comprises an assembly of an amphiphilic tree compound and a photosensitizer encapsulated in the assembly. The nano adjuvant has the characteristic of controllable activation, is spherical nano particles under normal physiological conditions, is activated by near infrared light at the local part of a tumor to play the effect of the immune adjuvant, promotes the presentation of tumor antigens, and improves the specific tumor immune response; meanwhile, the immune adjuvant effect activated locally on the tumor greatly reduces the systemic toxicity of the nano adjuvant and endows the nano adjuvant with safe and efficient characteristics. The nano adjuvant is obtained by a film dispersion method, and the preparation method is simple, low in cost, easy to popularize on a large scale and wide in application prospect.)
技术领域
本发明属于纳米材料
技术领域
，具体涉及一种纳米佐剂及其制备方法和应用。背景技术
免疫治疗被认为是一种有效的治疗肿瘤的方法，其通过激活或提高机体的免疫功能去识别并攻击肿瘤，具有特异性高和毒副作用小的优势；同时，免疫治疗具有免疫记忆效应，可以持久地识别并杀伤肿瘤细胞，从而有效抑制肿瘤的转移和复发。肿瘤的免疫治疗手段包括免疫检查点抑制剂、过继性免疫细胞疗法和肿瘤疫苗等。其中，肿瘤疫苗由于疗效高、特异性强等优势展现出了较大的应用前景，得到研究人员的广泛关注。
肿瘤疫苗通常由肿瘤相关性抗原和免疫佐剂组成，免疫佐剂通过增强抗原的免疫原性来提高疫苗的免疫效果。但是，由于免疫佐剂通常会进入到人体血液循环中，带来严重的系统性毒副反应，如发热、过敏，严重的甚至会导致死亡。因此，实现免疫佐剂在肿瘤部位的可控激活以降低其毒副作用是肿瘤疫苗面临的一个关键性科学问题。
近年来，纳米技术的发展为解决上述问题带来了希望，纳米佐剂的研究和应用成为肿瘤疫苗中的热点课题。目前，纳米佐剂按照组分可分为无机纳米佐剂、生物分子纳米佐剂以及复合物新型纳米佐剂等。例如CN109395075A公开了一种结晶度可控的AlOOH纳米佐剂及其制备方法，所述AlOOH纳米佐剂是以无机铝盐作为前驱物、通过化学沉淀的方法制备得到，其结晶度可控，形貌均一，粒径分布窄；然而，无机的纳米铝佐剂可能导致不同程度的炎症反应，因此极大地限制了其在疫苗中的应用。CN101565726A公开了一种使用纳米脂质体免疫佐剂制备抗小分子物质抗体的方法，所述纳米脂质体免疫佐剂由大豆卵磷脂和胆固醇组成，能够包封抗原形成抗小分子物质抗体；但是，脂质体类的纳米佐剂稳定性不好，在包封抗原时易发生融合而造成抗原的丢失，从而影响免疫效果。
在提高疫苗效果、降低疫苗的毒副作用方面，研究人员提出了很多解决方案，包括采用PLGA载体注射到肿瘤部位，将放疗产生的肿瘤相关性抗原递送至淋巴结，增强抗原的递呈；采用化疗产生肿瘤相关性抗原，并在原位刺激机体的免疫系统；采用纳米颗粒包载光热试剂和免疫佐剂R837，利用光热治疗杀死肿瘤细胞的同时，原位产生肿瘤相关性抗原，联合包载的免疫佐剂产生更佳的免疫治疗效果；采用脂质体包载免疫佐剂CpG，将免疫佐剂靶向递送至淋巴结，激起机体的免疫反应。但是，上述策略仍然存在制备工艺复杂，疗效欠佳等缺陷。
因此，开发一种毒副作用低、特异性高且易于制备的纳米佐剂，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米佐剂及其制备方法和应用，通过光敏剂和两亲性树形化合物的结合，使所述纳米佐剂具有光可控激活的特性，能够在肿瘤局部发挥高特异性的肿瘤免疫效应，同时毒副作用低，能够充分满足免疫佐剂和疫苗的高效和安全的要求。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种纳米佐剂，所述纳米佐剂包括两亲性树形化合物的组装体，以及包载于所述组装体中的光敏剂。
所述两亲性树形化合物具有如式I所示结构：
式I中，Z为赖氨酸缩合肽。
所述Z为具有分支结构的赖氨酸缩合肽，其与之相连的-NH-形成酰胺键，实现了赖氨酸缩合肽与式I结构的连接。
式I中，m选自2～18的整数，例如3、4、6、8、10、12、14、16或17，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅和出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明通过深入研究现有免疫佐剂的优缺点，结合纳米科技的优势，制备了以两亲性树形化合物为基础的纳米佐剂。所述纳米佐剂可通过薄膜分散法自组装形成球状纳米颗粒，并包载光敏剂，形成光控激活的纳米佐剂。本发明所述的纳米佐剂，可以在肿瘤的局部被近红外光激活发挥免疫佐剂效应，促进肿瘤抗原的提呈，引起特异性的肿瘤免疫反应，同时，这种在肿瘤局部激活的免疫佐剂效应大大降低了佐剂的系统性毒性。
本发明所述的纳米佐剂具有可控激活的特点，在正常生理条件下为球形纳米颗粒，不具有免疫佐剂效应。在近红外光照射下，所述纳米佐剂疏水端的硝基还原为氨基，带有氨基的树形分子具有免疫佐剂效应，能够刺激体内抗原提呈细胞表面共刺激分子的表达和免疫因子的释放，从而促进抗原的提呈，激起特异性的肿瘤免疫反应。
本发明中，所述光敏剂为近红外光敏剂。
优选地，所述光敏剂包括二氢卟吩和/或吲哚菁绿。
本发明所述的纳米佐剂在正常生理条件下为球形纳米颗粒，在近红外光照射下，纳米颗粒解散，形成单体。
优选地，所述光敏剂为二氢卟吩，所述近红外光波长优选为665nm。
优选地，所述m选自4～10的整数，例,4、5、6、7、8、9或10，进一步优选为6。
优选地，所述赖氨酸缩合肽由2～20个赖氨酸缩合而成，例如由3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18或19等的赖氨酸缩合而成，进一步优选由3～7个赖氨酸缩合而成。
优选地，所述两亲性树形化合物具有如式I-1、式I-2、式I-3或式I-4中任一项所示结构：
本发明中，所述两亲性树形化合物的制备方法包括如下步骤：
(1)2-硝基咪唑与化合物1进行缩合反应，得到中间体1
(2)步骤(1)得到的中间体1与叠氮化试剂进行叠氮反应，得到中间体2
(3)炔丙胺和N,N'-双叔丁氧羰基-L-赖氨酸进行缩合反应，得到中间体3
(4)步骤(2)得到的中间体2与步骤(3)得到的中间体3进行点击化学反应，得到所述两亲性树形化合物；
m、Z各自独立地具有与式I中相同的限定范围。
优选地，步骤(1)所述2-硝基咪唑与化合物1的摩尔比为1:(1～1.5)，例如1:1.01、1:1.03、1:1.05、1:1.08、1:1.1、1:1.15、1:1.2、1:1.25、1:1.3、1:1.35、1:1.4或1:1.45等，进一步优选为1:1.05。
优选地，步骤(1)所述缩合反应的温度为25～80℃，例如28℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、75℃、77℃或79℃等。
优选地，步骤(1)所述缩合反应的时间为4～24h，例如5h、6h、8h、10h、12h、15h、18h、20h、22h或23h等。
优选地，步骤(1)所述缩合反应在有机溶剂存在下进行。
优选地，所述有机溶剂为乙腈。
优选地，步骤(1)所述缩合反应完成后进行叔丁氧羰基的脱除。
优选地，所述脱除的试剂为三氟乙酸(TFA)。
优选地，步骤(2)所述叠氮化试剂为1H-咪唑-1-磺酰基叠氮。
优选地，步骤(2)所述中间体1与叠氮化试剂的摩尔比为1:(1～5)，例如1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.3、1:2.5、1:2.8、1:3、1:3.3、1:3.8、1:4、1:4.2、1:4.5或1:4.8等，进一步优选为1:2。
优选地，步骤(2)所述叠氮反应在催化剂的作用下进行。
优选地，所述催化剂为CuSO4·5H2O。
优选地，步骤(2)所述叠氮反应的温度为25～80℃，例如28℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、75℃、77℃或79℃等。
优选地，步骤(2)所述叠氮反应的时间为12～24h，例如13h、15h、17h、19h、20h、22h或23h等。
优选地，步骤(3)所述缩合反应的缩合剂为HOBT和HBTU的混合物。
优选地，步骤(3)所述炔丙胺、HOBT和HBTU的摩尔比为1:(1～2):(1～2)。
其中，2个所述1～2各自独立地包括1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2等。
优选地，步骤(3)所述缩合反应的时间为12～48h，例如13h、15h、17h、19h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、33h、35h、36h、38h、40h、42h、45h或47h等，进一步优选为24h。
优选地，步骤(3)所述缩合反应的温度为25～50℃，例如28℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、47℃或49℃等，进一步优选为25℃。
优选地，步骤(3)所述缩合反应在溶剂存在下进行。
优选地，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
优选地，所述Z为由3个赖氨酸缩合而成的赖氨酸缩合肽，步骤(3)所述炔丙胺和N,N'-双叔丁氧羰基-L-赖氨酸的摩尔比1:(1～1.5)，例如1:1.01、1:1.03、1:1.05、1:1.08、1:1.1、1:1.15、1:1.2、1:1.25、1:1.3、1:1.35、1:1.4或1:1.45等，进一步优选为1:1.2。
优选地，步骤(3)所述缩合反应的具体步骤为：炔丙胺和N,N'-双叔丁氧羰基-L-赖氨酸首先在缩合剂的作用下进行缩合反应；然后加入三氟乙酸(TFA)脱除叔丁氧羰基(Boc保护基)；再继续加入N,N'-双叔丁氧羰基-L-赖氨酸和缩合剂进行缩合反应，直至得到目标赖氨酸数目的缩合肽。
优选地，步骤(4)所述中间体2和中间体3的摩尔比为1:(1～2)，例如1:1.01、1:1.05、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8或1:1.9等，进一步优选为1:1.02。
优选地，步骤(4)所述点击化学反应的温度为40～80℃，例如42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、75℃、77℃或79℃等，进一步优选为50℃。
优选地，步骤(4)所述点击化学反应的时间为2～16h，例如3h、5h、7h、9h、10h、12h、14h或15h等，进一步优选为12h。
优选地，步骤(4)所述点击化学反应在催化剂的作用下进行。
优选地，所述催化剂为CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠(NaAsc)的混合物。
优选地，步骤(4)所述点击化学反应在溶剂存在下进行。
优选地，所述溶剂为四氢呋喃(THF)。
优选地，步骤(3)和步骤(4)还包括保护基叔丁氧羰基(Boc)的脱除步骤，所述脱除的试剂为TFA。
优选地，步骤(1)～(4)各自独立地包括产物的纯化步骤。
其中，步骤(1)得到的中间体1的纯化方法优选为沉淀法，所述沉淀法中的溶剂为乙醚。步骤(2)得到的中间体2的纯化方法优选为硅胶柱层析法，所用硅胶的细度为200～300目。步骤(3)得到的中间体3的纯化方法优选为沉淀法，所述沉淀法中的溶剂为乙醚。步骤(4)得到的两亲性树形化合物的纯化方法优选为透析，所述透析的透析袋的截留分子量为500～1000Da，例如500Da、600Da、700Da、800Da、900Da或1000Da等，优选为500Da；透析时间为12～48h。
本发明中，所述纳米佐剂中两亲性树形化合物与光敏剂的质量比为(1.5～15):1，例如1.6:1、1.8:1、2:1、2.2:1、2.5:1、2.8:1、3:1、3.2:1、3.5:1、3.8:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1、12:1、14:1或14.5:1等，优选为(1.5～5):1，进一步优选为3:1。
本发明中，所述纳米佐剂中两亲性树形化合物与光敏剂的质量比是包载光敏剂的载药量和包封率的考虑而设计的。在上述优选的质量比范围内，可使所述纳米佐剂的载药量、包封率以及纳米佐剂的粒径达到最优。
优选地，所述纳米佐剂的粒径为20～50nm，例如22nm、25nm、28nm、30nm、32nm、35nm、38nm、40nm、42nm、45nm、47nm或49nm等。
优选地，所述纳米佐剂包括两亲性树形化合物的组装体，以及包载于所述组装体中的二氢卟吩；所述两亲性树形化合物具有如式I-1所示结构。
另一方面，本发明提供一种如上所述的纳米佐剂的制备方法，所述制备方法为：将两亲性树形化合物、光敏剂与溶剂混合分散，然后除溶剂得到薄膜；将所述薄膜与水混合，得到所述纳米佐剂。
本发明中，所述两亲性树形化合物与光敏剂的质量比为(1.5～15):1，例如1.6:1、1.8:1、2:1、2.2:1、2.5:1、2.8:1、3:1、3.2:1、3.5:1、3.8:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1、12:1、14:1或14.5:1等，优选为(1.5～5):1，进一步优选为3:1。
优选地，以所述两亲性树形化合物与光敏剂的质量和为1mg计，所述溶剂的用量为1～10mL，例如1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL、8mL、8.5mL、9mL或9.5mL等。
优选地，所述溶剂为氯仿和甲醇的混合溶剂。
优选地，所述氯仿和甲醇的体积比为3:(1～10)，例如3:1.5、3:2、3:2.5、3:3(即1:1)、3:3.5、3:4、3:4.5、3:5、3:5.5、3:6(即1:2)、3:6.5、3:7、3:7.5、3:8、3:8.5、3:9(即1:3)或3:9.5等，进一步优选为3:2。
优选地，所述混合分散在避光条件下进行。
优选地，所述除溶剂的方法为旋蒸。
优选地，所述旋蒸的时间为15～60min，例如20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min等，进一步优选为30min。
优选地，以所述薄膜的质量为1mg计，所述水的用量为1～5mL，例如1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL或5mL等。
优选地，所述水为三蒸水。
另一方面，本发明提供一种疫苗，所述疫苗包括如上所述的纳米佐剂。
另一方面，本发明提供一种如上所述的纳米佐剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的纳米佐剂包括两亲性树形化合物形成的自组装体和光敏剂，具有可控激活的特点，在正常生理条件下为球形纳米颗粒，在肿瘤的局部被近红外光激活发挥免疫佐剂的效应，促进肿瘤抗原的提呈，提高特异性的肿瘤免疫反应；同时，这种在肿瘤局部激活的免疫佐剂效应大大降低了所述纳米佐剂的系统性毒性，赋予其安全、高效的特性。所述纳米佐剂通过薄膜分散法得到，制备方法简单、成本低，易于大规模推广，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1提供的纳米佐剂的透射电镜图；
图2为实施例1提供的纳米佐剂的动态光散射表征图；
图3为实施例1提供的纳米佐剂对抗原递呈细胞的激活结果图；
图4为实施例1提供的纳米佐剂的活体抑瘤实验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种纳米佐剂，制备方法如下：
两亲性树形化合物的制备方法包括如下步骤：
称取2-硝基咪唑(0.88mmol)和碳酸钾(1.34mmol)，于乙腈中搅拌溶解，溶液呈淡黄色混浊溶液；缓慢滴加6-(Boc-氨基)溴己烷(0.95mmol)的DMF溶液，滴加完毕后于25℃搅拌反应24h，得到化合物HAD 1-1，然后加入三氟乙酸(TFA)脱去叔丁氧羰基，得到6-(2-硝基咪唑)己胺，即HAD 1-2。
以步骤(1)得到的HAD 1-2(0.5mmol)为原料，加入催化剂CuSO4·5H2O(0.012mmol)和1H-咪唑-1-磺酰基叠氮(1.0mmol)，并溶解在甲醇中，25℃搅拌反应16h，将6-(2-硝基咪唑)己胺的氨基替换为叠氮基，即HAD 1-3。
取Boc-Lys(Boc)-OH(1.12mmol)，HBTU(1.12mmol)，HOBT(1.12mmol)依次加入支口反应瓶，用氮气保护，加入DMF，使固体溶解；在冰浴条件下缓慢滴加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应30min，此时反应液呈浅黄色；随后加入炔丙胺(1.00mmol)，25℃避光反应；24h反应完全，将粗品进行硅胶柱层析纯化得白色固体，即HAD 2-1。将上一步得到的HAD 2-1置于支口反应瓶中，加入TFA(20.0mmol)，脱除叔丁氧羰基(Boc保护基)，得到HAD 2-2。将得到的HAD 2-2置于支口反应瓶中，并加入Boc-Lys(Boc)-OH(2.24mmol)，HBTU(2.24mmol)，HOBT(2.24mmol)，在氮气保护下加入DMF，使固体溶解；在冰浴条件下缓慢滴加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应30min，后置于25℃避光反应；24h反应完全，将粗品进行硅胶柱层析纯化得白色固体，即HAD 2-3。
将步骤(2)得到的叠氮化合物HAD 1-3(0.164mmol)和步骤(3)得到赖氨酸聚合肽HAD 2-3(0.168mmol)溶解在THF中，加入催化剂CuSO4·5H2O和NaAsc，随后加入1mL的H2O，溶液变为黄绿色；将反应温度升至50℃避光条件下反应2h，通过薄层色谱TLC监测反应进程；反应结束后硅胶柱层析得到白色固体HAD 1，加入TFA脱除叔丁氧羰基，得到两亲性树形化合物HAD。
HAD的结构测试：1H-NMR(CD3OD/CDCl3＝3/1，300MHz)：δ7.82(s,1H),7.43(d,J＝1.0Hz,1H),7.13(d,J＝1.0Hz,1H),4.57-4.21(m,7H),3.93(t,J＝6.6Hz,1H),3.83(t,J＝6.6Hz,1H),3.28-3.12(m,2H),3.05-2.85(m,4H),1.99-1.22(m,26H)。
纳米佐剂的制备：
将步骤(4)得到的两亲性树形化合物HAD溶解于5mL氯仿和甲醇的混合溶剂(氯仿和甲醇的体积比为3:2)中，加入光敏剂二氢卟吩，避光搅拌溶解；通过旋转蒸发仪旋蒸30min除去溶剂，获得薄膜，然后加入3mL三蒸水，获得纳米佐剂。
使用透射电子显微镜(TEM，HITACHI-7700)和动态光散射测量仪(DLS，Zetasizernano SZ90，Malvern)测试实施例1提供的纳米佐剂的表面形貌。所述纳米佐剂的透射电镜图如图1所示，从图1可知，所述纳米佐剂的颗粒均匀，分散性良好；所述纳米佐剂的动态光散射表征图如图2所示，从图2可知，所述纳米佐剂的粒径分布窄，其粒径为20～50nm。
实施例2
本实施例提供一种纳米佐剂，制备方法如下：
两亲性树形化合物的合成路线与实施例1相同，具体制备方法包括如下步骤：
(1)称取2-硝基咪唑(0.88mmol)和碳酸钾(1.34mmol)，于乙腈中搅拌溶解，溶液呈淡黄色混浊溶液；缓慢滴加6-(Boc-氨基)溴己烷(1.056mmol)的乙腈溶液，滴加完毕后于40℃搅拌反应18h，反应结束后加入三氟乙酸脱去叔丁氧羰基，得到6-(2-硝基咪唑)己胺；
(2)以步骤(1)得到的6-(2-硝基咪唑)己胺(0.5mmol)为原料，加入催化剂CuSO4·5H2O(0.012mmol)和叠氮化试剂1H-咪唑-1-磺酰基叠氮(1.5mmol)，并溶解在甲醇中，40℃搅拌反应12h，将6-(2-硝基咪唑)己胺中的氨基转化为叠氮基；
(3)取Boc-Lys(Boc)-OH(1.68mmol)，HBTU(1.68mmol)，HOBT(1.68mmol)依次加入支口反应瓶，用氮气保护，加入DMF，使固体溶解；在冰浴条件下缓慢滴加DIPEA，反应30min，此时反应液呈浅黄色；随后加入炔丙胺(1.12mmol)，25℃避光反应，12h反应完全，将粗品进行硅胶柱层析纯化得白色固体HAD 2-1；在HAD 2-1中加入TFA(20.0mmol)脱除Boc保护基，得到HAD 2-2；将HAD 2-2置于支口反应瓶中，并加入Boc-Lys(Boc)-OH(3.36mmol)，HBTU(3.36mmol)，HOBT(3.36mmol)，在氮气保护下加入DMF使固体溶解；在冰浴条件下缓慢滴加DIPEA，反应30min，后置于25℃避光反应；24h反应完全，将粗品进行硅胶柱层析纯化得白色固体的赖氨酸聚合肽；
(4)将步骤(2)得到的叠氮化合物(0.164mmol)和步骤(3)得到赖氨酸聚合肽(0.177mmol)溶解在THF中，加入催化剂CuSO4·5H2O和NaAsc，随后加入1mL的H2O，溶液变为黄绿色，将反应温度升至40℃避光条件下反应6h，通过TLC监测反应进程。反应结束后硅胶柱层析得到白色固体，加入TFA脱除叔丁氧羰基，得到两亲性树形化合物。
纳米佐剂的制备：
将步骤(4)得到的两亲性树形化合物溶解于5mL氯仿和甲醇的混合溶剂(氯仿和甲醇的体积比为3:1)中，加入光敏剂二氢卟吩，避光搅拌溶解；通过旋转蒸发仪旋蒸20min除去溶剂，获得薄膜，然后加入2mL三蒸水，获得纳米佐剂。
实施例3
本实施例提供一种纳米佐剂，制备方法如下：
两亲性树形化合物的合成路线与实施例1相同，具体制备方法包括如下步骤：
(1)称取2-硝基咪唑(0.88mmol)和碳酸钾(1.34mmol)，于乙腈中搅拌溶解，溶液呈淡黄色混浊溶液；缓慢滴加6-(Boc-氨基)溴己烷(1.232mmol)的乙腈溶液，滴加完毕后于60℃搅拌反应4h，反应结束后加入三氟乙酸脱去叔丁氧羰基，得到6-(2-硝基咪唑)己胺；
(2)以步骤(1)得到的6-(2-硝基咪唑)己胺(0.5mmol)为原料，加入催化剂CuSO4·5H2O(0.012mmol)和叠氮化试剂1H-咪唑-1-磺酰基叠氮(2.0mmol)，并溶解在甲醇中，40℃搅拌反应14h，将6-(2-硝基咪唑)己胺中的氨基转化为叠氮基；
(3)取Boc-Lys(Boc)-OH(1.44mmol)，HBTU(1.44mmol)，HOBT(1.44mmol)依次加入支口反应瓶，用氮气保护，加入DMF，使固体溶解；在冰浴条件下缓慢滴加DIPEA，反应30min，此时反应液呈浅黄色；随后加入炔丙胺(1.44mmol)，40℃避光反应，10h反应完全，将粗品进行硅胶柱层析纯化得白色固体HAD 2-1；在HAD 2-1中加入TFA(20.0mmol)脱除Boc保护基，得到HAD 2-2；将HAD 2-2置于支口反应瓶中，并加入Boc-Lys(Boc)-OH(2.88mmol)，HBTU(2.88mmol)，HOBT(2.88mmol)，在氮气保护下加入DMF使固体溶解；在冰浴条件下缓慢滴加DIPEA，反应30min，后置于25℃避光反应；24h反应完全，将粗品进行硅胶柱层析纯化得白色固体的赖氨酸聚合肽；
(4)将步骤(2)得到的叠氮化合物(0.164mmol)和步骤(3)得到赖氨酸聚合肽(0.170mmol)溶解在THF中，加入催化剂CuSO4·5H2O和NaAsc，随后加入1mL的H2O，溶液变为黄绿色，将反应温度升至60℃避光条件下反应4h，通过TLC监测反应进程。反应结束后硅胶柱层析得到白色固体，加入TFA脱除叔丁氧羰基，得到两亲性树形化合物。
纳米佐剂的制备：
将步骤(4)得到的两亲性树形化合物溶解于6mL氯仿和甲醇的混合溶剂(氯仿和甲醇的体积比为3:4)中，加入光敏剂二氢卟吩，避光搅拌溶解；通过旋转蒸发仪旋蒸40min除去溶剂，获得薄膜，然后加入3mL三蒸水，获得纳米佐剂。
实施例4
本实施例提供一种纳米佐剂，制备方法如下：
两亲性树形化合物的合成路线与实施例1相同，具体制备方法包括如下步骤：
(1)称取2-硝基咪唑(0.88mmol)和碳酸钾(1.34mmol)，于乙腈中搅拌溶解，溶液呈淡黄色混浊溶液；缓慢滴加6-(Boc-氨基)溴己烷(0.968mmol)的乙腈溶液，滴加完毕后于30℃搅拌反应22h，反应结束后加入三氟乙酸脱去叔丁氧羰基，得到6-(2-硝基咪唑)己胺；
(2)以步骤(1)得到的6-(2-硝基咪唑)己胺(0.5mmol)为原料，加入催化剂CuSO4·5H2O(0.012mmol)和叠氮化试剂1H-咪唑-1-磺酰基叠氮(2.5mmol)，并溶解在甲醇中，50℃搅拌反应8h，将6-(2-硝基咪唑)己胺中的氨基转化为叠氮基；
(3)取Boc-Lys(Boc)-OH(1.792mmol)，HBTU(1.793mmol)，HOBT(1.792mmol)依次加入支口反应瓶，用氮气保护，加入DMF，使固体溶解；在冰浴条件下缓慢滴加DIPEA，反应30min，此时反应液呈浅黄色；随后加入炔丙胺(1.12mmol)，35℃避光反应，20h反应完全，将粗品进行硅胶柱层析纯化得白色固体HAD 2-1；在HAD 2-1中加入TFA(20.0mmol)脱除Boc保护基，得到HAD 2-2；将HAD 2-2置于支口反应瓶中，并加入Boc-Lys(Boc)-OH(3.584mmol)，HBTU(3.584mmol)，HOBT(3.584mmol)，在氮气保护下加入DMF，使固体溶解；在冰浴条件下缓慢滴加DIPEA，反应30min，后置于25℃避光反应；24h反应完全，将粗品进行硅胶柱层析纯化得白色固体的赖氨酸聚合肽；
(4)将步骤(2)得到的叠氮化合物(0.164mmol)和步骤(3)得到赖氨酸聚合肽(0.184mmol)溶解在THF中，加入催化剂CuSO4·5H2O和NaAsc，随后加入1mL的H2O，溶液变为黄绿色，将反应温度升至55℃避光条件下反应4h，通过TLC监测反应进程。反应结束后硅胶柱层析得到白色固体，加入TFA脱除叔丁氧羰基，得到两亲性树形化合物。
纳米佐剂的制备：
将步骤(4)得到的两亲性树形化合物溶解于5mL氯仿和甲醇的混合溶剂(氯仿和甲醇的体积比为3:7)中，加入光敏剂二氢卟吩，避光搅拌溶解；通过旋转蒸发仪旋蒸55min除去溶剂，获得薄膜，然后加入4mL三蒸水，获得纳米佐剂。
实施例5
本实施例为实施例1提供的纳米佐剂对树突状细胞表面共刺激因子表达影响的测试例，方法如下：
将4T1细胞以10万个/孔的密度接种于transwell板的上层，孵育12h后，加入实施例1提供的纳米佐剂，4h后分别进行光照或不光照处理。随后在下层加入事先提取的骨髓来源原代树突状细胞，孵育12h后，加入实施例1提供的纳米佐剂，处理12h；分别以生理盐水、光敏剂二氢卟吩、聚乙二醇磷脂包载二氢卟吩作为对照。然后用树突状细胞表面成熟因子抗体标记细胞，用流式细胞仪检测树突状细胞在纳米佐剂光照前和光照后的成熟状态，得到纳米佐剂对抗原递呈细胞的激活结果图，如图3所示，本发明实施例1提供的纳米佐剂在光照后可显著刺激树突细胞的成熟，从而进一步促进抗原的递呈。
实施例6
本实施例为实施例1提供的纳米佐剂形成的原位疫苗抑制肿瘤生长情况的测试例，方法如下：
在BALB/c小鼠的左后背皮下接种1×106个4T1细胞，在小鼠肿瘤达到80mm3时，将小鼠随机分为6组，每组8只，分别为：第一组，生理盐水；第二组，光照；第三组，纳米佐剂；第四组，二氢卟吩+光照；第五组，聚乙二醇磷脂包载二氢卟吩+光照；第六组，纳米佐剂+光照。
对上述6组小鼠经尾静脉给药3mg/kg，注明光照的第二组、第四组、第五组和第六组在给药6h后进行光照，每隔1天给药并光照一次，共给药照射3次。之后每隔1天用游标卡尺检测各组小鼠肿瘤的体积，肿瘤体积通过以下计算公式进行统计：体积＝长×宽×宽/2。
以肿瘤体积为纵轴、实验天数为横轴绘图，得到纳米佐剂活体抑瘤实验结果图，如图4所示，实施例1提供的纳米佐剂+光照组的肿瘤生长得到了有效的抑制，而其他组的肿瘤体积在24天时均超过了800mm3，说明本发明所述纳米佐剂在光照后可以联合光动力治疗形成原位疫苗，有效抑制了肿瘤的生长。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种纳米佐剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。