具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

发明人为了将磷酸氯喹与吴茱萸碱共同用于协同抗乳腺癌肿瘤，研究了如何将EVO、CQ高效准确的递送入肿瘤部位，并尽量克服EVO在体内生物利用度低、CQ对正常组织细胞有较强的杀伤作用的缺点。

本实施例所使用的仪器如下：SW-CJ-2F超净工作台(苏净集团安泰公司)，BB15细胞培养箱(美国Thermo公司)，IX73-U倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)，ELX800通用酶标仪(美国Bio-tek公司)，Milli-Q Elix 15Advantage超纯水系统(美国millipore公司)，RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，81-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)，TG16W高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)，PSAC12R-120型pH计(东莞达宏电子有限公司)，超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，720型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，F-380荧光分光光度计(天津港东科技发展有限公司)。

试剂如下：胆固醇(Cholesterol，CHOL，批号：111618-200301，美仑生物)、氢化大豆卵磷脂(Lecithin hydrogenated，HSPC，批号：525600-2130493-01，美仑生物)、吴茱萸碱(Evodiam，EVO，批号：PS0075-0025，成都普思生物科技有限公司)、磷酸氯喹(Chloroquine，CQ，批号：100421-200401，索莱宝生物试剂有限公司)、四甲基偶氮唑蓝(MTT，批号：CO41004，美国Sigma公司)，二甲基亚砜等常规试剂(DMSO，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

本实施例所使用的细胞为人乳腺癌细胞(MCF-7)，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

测定波长的选择：精密称取干燥至恒重的EVO及CQ原料药0.25mg及5mg，加1mL甲醇溶解后，置于100mL溶量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为2.5μg/mL的EVO及2.5μg/mL的CQ对照品溶液，以蒸馏水为空白，在200-600nm范围内进行波长扫描，结果表明在EVO在λ＝225nm，CQ在λ＝343nm处有最大吸收峰；分别取破乳后的空白脂质体溶液，破乳后EVO-CQ-Lips脂质体溶液同法扫描，结果表明样品溶液同样在225nm及343nm处分别有最大吸收，而空白脂质体溶液在该两个波长处无吸收，说明辅料和溶剂对药物测定没有干扰。

绘制标准曲线：精密称取一定质量的EVO并用容量瓶精密配置浓度(μg/mL)为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μg/mL，用720型紫外分光光度计在λ＝225nm测定其吸光度(A值)，以吸光度(A值)对浓度(C)线性回归，得回归方程：A＝0.1744C+0.0504(R²＝0.9991)，结果表明EVO质量浓度在1-3μg/mL范围内与吸光度线性拟合度较好；

精密称取一定质量的CQ并用容量瓶精密配置浓度(μg/mL)为10、15、20、25、30，用720型紫外分光光度计在λ＝343nm测定其吸光度(A值)以吸光度(A值)对浓度(C)线性回归，得回归方程：A＝0.0212C+0.0962(R²＝0.9994)，结果表明CQ质量浓度在1-3μg/mL范围内与吸光度线性拟合度较好。

精密度实验，日内精密度：分别对EVO(1.0、2.0、3.0μg/mL)及CQ(10.0、20.0、30.0μg/mL)于一天内平行测定5组吸光度，计算吸光度的相对标准偏差(RSD％)，EVO、CQ吸光度的日内精密度RSD<5.0％，结果表明EVO、CQ的日内精密度良好；日间精密度：分别对EVO(1.0、2.0、3.0μg/mL)及CQ(10.0、20.0、30.0μg/mL)于1、2、3、4、5天内平行测定5组吸光度，计算吸光度的相对标准偏差(RSD％)，EVO、CQ吸光度的日间精密度RSD<5.0％，结果表明EVO、CQ的日间精密度良好。

加样回收率实验：分别对EVO(1.0、2.0、3.0μg/mL)及CQ(10.0、20.0、30.0μg/mL)进行回收率(％)的计算，EVO、CQ的回收率(％)在95％-105％之间，本法测定EVO、CQ的包封率准确度良好。

EVO-CQ-Lips的制备方法如下：

S1：EVO-Lips的制备

按处方比例称取EVO、HSPC、CHOL，用适量氯仿超声溶解EVO、HSPC、CHOL后，将其加至20mL圆底烧瓶中，在减压旋转蒸发仪上进行旋转除去有机溶剂氯仿，使其成稳定的脂质体膜；将制备好的脂质体膜加至1.5mL硫酸铵缓冲溶液中水合1h，然后将水合之后的溶液转移至4mL EP管中，用超声波细胞破碎仪超声，超声时变幅杆先用ddH₂O超声30s，再通无水乙醇超声30s，超声脂质体时按处方设置超声功率，超声时间设置为超声5s停顿5s；

S2：EVO-CQ-Lips的制备

步骤S1超声完成后，将溶液加入透析袋中，用PBS缓冲液(pH 7.4)透析12h，透析液为0.01moL PBS缓冲液1L(2.38g Na₂HPO₄·12H₂O+0.38gNaH₂PO₄加入到2L的ddH₂O)，透析12h后加入200uL磷酸氯喹(50mg/mL)，按孵育温度(65℃)在恒温水浴锅上孵育30min，即得EVO-CQ-Lips。

本实施例按照上述制备方法对EVO-CQ-Lips的最优处方进行了筛选，溶剂筛选及结果如下：根据HSPC、CHOL、EVO三种物质的性质，先按基本处方(HSPC:CHOL:EVO＝6:3:1)进行溶剂筛选，对成膜较好且均匀，真空减压旋蒸不起泡的溶剂进行处方筛选，结果见附表1，可见溶剂为氯仿时成膜均匀且不易起泡；

附表1处方溶剂筛选结果

注：HSPC:CHOL:EVO为质量比。+++表示很好、++表示好、+表示一般、-表示差

最优处方比例筛选及结果：通过单因素处方筛选方法，以氢化大豆卵磷脂：胆固醇：吴茱萸碱(HSPC:CHOL:EVO)比例、超声功率(％)、硫酸铵浓度(pH 4.5)为影响因素，探讨其对胆固醇和氢化大豆卵磷脂影响粒径(nm)、包封率(％)的影响；以设定的基本处方(HSPC：CHOL：EVO为6:3:1、硫酸铵浓度(pH 4.5)为3M、超声功率为40％)为基准，孵育温度65℃、超声时间3min为固定值，处方筛选指标如附表2所示；

附表2处方筛选指标

注：HSPC：CHOL：EVO为质量比

接着以氯仿为处方溶剂、按处方比例制备了1-9个处方的EVO-CQ-Lips，测定其粒径(nm)、PDI、EVO包封率％(EE％)、CQ包封率％(EE％)，结果如附表3所示；

附表3处方筛选

注：HSPC：CHOL：EVO为质量比

综合以上9个处方的结果可见，处方2及处方5均获得较好粒径，再通过正交筛选，得出最终最优处方为HSPC：CHOL：EVO为7：2：1(确切质量为7mg、2mg、1mg)、硫酸铵浓度(pH)为1M、超声功率为40％为最优处方配比，用最优处方制备的纳米粒的粒径、电位及包封率如表4所示。

表4最优处方纳米粒特征

本实施例对EVO-CQ-Lips的形态粒径及分布进行了测定。TEM观察外观形态，采用磷钨酸负染法：按最优处方制备EVO-CQ-Lips，双蒸水重悬后，滴至专用铜丝上，静置风干后，再滴加2％(w/v)磷钨酸负染2min，于透射电子显微镜(TEM)下观察其外观形态；结果如附图1所示，由图可见，EVO-CQ-Lips由于包裹了一层胆固醇和大豆磷脂酰胆碱成分，故呈不规则类球形；采用粒度仪测定其粒径(nm)及分布，粒度分布如附图1和附图2所示，由图可知，最优处方所制备的EVO-CQ-Lips的粒径在170±6.24nm，其粒度分布较为均匀。

本实施例采用超速离心法测脂质体包封率，取制备好的脂质体混悬液，于0.8μm滤头过滤除去未包封于脂质体的EVO及CQ，将过滤后的脂质体溶液加入1.5mL离心管中，以1300r/min离心90min，收集脂质体，加入适量甲醇超声破乳，用PBS稀释定容至适当浓度后测定吸光度，计算脂质体中药物含量为W_EVO及W_CQ，设总投药量为M_EVO，M_CQ。按下式计算包封率：EE％＝W_EVO/CQ/M_EVO/CQ×100％用甲醇消解EVO-CQ-Lips，使其释放出已经包封的EVO及CQ，采用紫外分光光度计在(λmax(EVO)＝225nm和λmax(CQ)＝343nm)分别测定EVO、CQ的包封率，根据测出的粒径和包封率筛选出最优处方。本实施例超速离心法加样回收率考察:精密称取EVO、CQ原料于量瓶中，甲醇溶解后，加蒸馏水稀释成浓度EVO为1.0、2.0、3.0μg/mL CQ为10、20、30μg/mL 10.0mg/mL的溶液，分别取不同质量浓度药物溶液0.1mL与0.2mL空白脂质体混匀，同上方法离心处理加入到超滤管中，离心超滤后收集滤液，稀释后测定吸光度，计算回收率，结果表明，超滤离心法的平均回收率EVO可达97.4％，CQ可达98.1％，且RSD＜5％，因此包封率的测定可采用超速离心法。所测得包封率为EE(EVO)％＝60.03％，EE(CQ)％＝9.31％。

本实施例还对EVO-CQ-Lips的稳定性及体外释放进行了研究，稳定性考察：按最优处方制备脂质体8份，均分为A、B两组，A组静置于4℃、B组静置于室温25℃条件下，于制备好脂质体后的0、0.5、1、2、4、8、16、28、32(d)用粒度仪测定其粒径(nm)，粒径(nm)的稳定性结果见附图3，最优处方脂质体在4℃和25℃条件下0-2d时粒径(nm)较为稳定，在2-8d时有所波动但粒径(nm)变化并不大，可能是因为90plus PALS粒度仪趋于稳定，因而从整体来看最优处方EVO-CQ-Lips稳定性在4℃和25℃储存0-32d都较为良好；EVO-CQ-Lips呈光滑类球形且分散很不均匀，EVO-CQ-Lips由于包裹了一层胆固醇和大豆磷脂酰胆碱成分，故呈不规则类球形；EVO-CQ-Lips由于外壳连接一层CQ亲水层，可见一层颜色较深的阴影层，因胆固醇含量较高，形态较稳定。

体外释放结果考察：最优处方制备的脂质体在1mL磷酸盐缓冲盐溶液中(PBS，A组用pH 4.0、B组用pH 7.4)重悬后放置于37℃、120rpm的恒温摇床中，在预设时间点(0h、0.5h、2h、4h、6h、18h、1d、2d、4d、7d、14d、21d、28d)测定释放率，释放率曲线结果如附图4所示，体外释放结果显示在低pH时，CQ较EVO释放快，而pH接近中性时两者释放速率相当，释放率均能达到80％以上。

本实施例对EVO-CQ-Lips细胞体外抗肿瘤活性进行了研究，采用MTT法测定EVO-CQ-Lips体外抗MCF-7增殖作用：取对数生长期的MCF-7细胞用细胞计数板计数后用培养基混匀，以每孔4000个/mL的密度铺于4块96孔板中，放入CO₂孵箱24h后吸出96孔板中的培养基，每个96孔板依次加入系列浓度药EVO-CQ-Lips以及其对应浓度的游离EVO和CQ药物培养基溶液200uL，继续培养48h后，加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，于4h后从孵箱中取出96孔板中，将其液体吸出，加入150uL的二甲基亚砜(DMSO)溶液后立即用酶标仪于570nm测定其吸光值。结果如附图5所示，其中图5A显示了游离EVO对MCF-7细胞的生长有抑制作用，图5B显示了游离CQ对MCF-7细胞的生长有抑制作用，图5C显示了EVO-CQ-Lips对MCF-7细胞的生长有抑制作用；通过游离EVO组、游离CQ组、EVO-CQ-Lips组的抑制率计算IC50，结果见附表5，结果显示，EVO-CQ-Lips较游离EVO及CQ具有更强的体外抗乳腺癌细胞增值能力，差异具有统计学意义(P<0.05)。EVO-CQ-Lips较游离EVO及CQ具有更强的体外乳腺癌增殖抑制作用，可能与脂质体包载后显著提高药物溶解性有显著关系。

附表5游离EVO、游离CQ及EVO-CQ-Lips对乳腺癌细胞的IC50值

“*”较EVO-CQ-Lips组，差异具有统计学意义P<0.05

本实施例还对细胞活死染色对抗癌效果进行了研究，取对数期生长MCF-7细胞，以8×10⁴/孔接种于24孔细胞培养板，24h后加入终浓度梯度的EVO-CQ-Lips的纳米粒细胞培养液0.05、5、100μM；每个浓度设置三个复孔，空白孔中只更换新鲜培养基，24h后加入配制好的Calcein-AM/PI染液；37℃孵育30min，吸弃染色工作液，终止孵育，加入10μL抗荧光淬灭封片液，复以细胞爬片，指甲油封片，于490nm激发波长下观察黄绿色活细胞，并于545nm处激发波长下观察红色的死细胞，结果见附图6，由图可见，随着纳米粒药物浓度增加，钙黄绿素着色细胞量显著减少，表明活细胞急剧减少，而PI着色的凋亡细胞核荧光逐渐增强，表明死细胞数量显著增加。因而表明纳米粒对巨噬细胞MCF-7具有显著的杀伤作用。

综上所述，本实施例的最优配方可高效准确的作用于乳腺癌细胞，可在癌症部位协同发挥持久的作用，协同杀死肿瘤细胞，使治疗作用更加迅速、高效。本发明首次采用纳米载药系统将吴茱萸碱中药小分子包载并用于抗癌作用研究，首次采用纳米载药系统将抗疟疾药物磷酸氯喹用于抗癌作用研究，副作用小，进一步推动了吴茱萸碱及抗疟疾药物磷酸氯喹的进一步应用及发展。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。