一种筛选对肠道微生态具有促进作用的提取物方法及将其用于靶向筛选益生菌的应用
阅读说明：本技术 一种筛选对肠道微生态具有促进作用的提取物方法及将其用于靶向筛选益生菌的应用 (Method for screening extract with effect of promoting intestinal micro-ecology and application of extract in targeted screening of probiotics ) 是由 李亚峰 董丽娜 张洵 孙龙 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种调控肠道微生态的益生元组合物及其制备方法和应用。组合物中包含白头翁提取物。本发明首次证实了白头翁提取物可降低肠道微生物群的多样性,并且具有促进人体双歧杆菌生长的作用。并且,本发明首次建立了体外发酵体系,能更好的模拟人体内真实环境,从整体丰度,到定量再到菌种水平检测和人粪便来源菌株验证,精准筛选出中药靶向促进生长的益生菌种类,解决了当前的盲目配伍和非人体来源的问题。(The invention relates to a prebiotic composition for regulating and controlling intestinal microecology and a preparation method and application thereof. The composition comprises Pulsatillae radix extract. The invention proves that the pulsatilla chinensis extract can reduce the diversity of intestinal microbiota and has the effect of promoting the growth of human bifidobacteria for the first time. In addition, the invention establishes an in-vitro fermentation system for the first time, can better simulate the real environment in a human body, accurately screen out the probiotic species for promoting the growth of the traditional Chinese medicine in a targeted way from the whole abundance, to the quantification, to the strain level detection and the verification of the human excrement source strain, and solves the problems of blind compatibility and non-human body source at present.)
技术领域
本发明涉及生物提取领域，特别涉及一种筛选对肠道微生态具有促进作用的提取物的方法及将其用于靶向筛选益生菌的应用。
背景技术
肠道微生态与人类的健康与疾病密切相关，肠道正常菌群在人体防御感染、调节免疫、营养物质吸收、延缓衰老等方面具有重要的作用。近年来，越来越多的研究表明，中药可调节肠道微生态，可用于治疗肠道微生态失衡引发的疾病。一方面，中药可能作为潜在的益生元，促进肠道有益菌的生长；另一方面，肠道微生物群可能诱发中药活性成分的生物转化。
白头翁(Pulsatilla Radix，PR)是一种传统中药材，具有清热解毒，凉血止痢的功效，通常与其他中药配伍使用。研究表明，PR中含有三萜皂苷、三萜酸、木脂素、白头翁灵、白头翁英、白头翁素、原白头翁素、胡萝卜苷以及糖蛋白等多种成分，PR提取物具有抗菌、抗肿瘤等多种药理活性。目前少有白头翁与肠道微生态菌群关联的报道。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明通过建立体外发酵体系，证实白头翁提取物可改变肠道微生物群的多样性，并且，白头翁提取物可显著促进双歧杆菌的生长。本发明首次证实了白头翁与肠道微生态菌群之间的关联，建立的体外发酵体系，有助于靶向筛选益生菌的种类。
有鉴于此，本发明一方面请求保护筛选靶向益生菌的体外发酵方法，所述方法包括如下步骤：采集新鲜粪便；将粪便稀释，稀释后的粪便添加到提前放置在厌氧培养系统中的培养基中；在培养基中加入待测中药样品，发酵一定时间，优选的0h、8h、24h，分别吸取液体，离心，沉淀置于-80℃，通过分析沉淀中的菌群变化，筛选出生长促进的益生菌种类。
优选地，分析沉淀中的菌群变化通过如下步骤进行：提取DNA，以提取的DNA为模板，PCR扩增16S rRNA基因区，分离纯化扩增片段并进行测序，对测序结果进行统计分析，筛选出生长促进的益生菌种类。
优选地，待测中药样品为白头翁提取物；更优选的，所述提取物为水提取物或醇提取物。
本发明第二方面请求保护白头翁提取物在调控肠道微生态方面的应用；或在制备调控肠道微生态制剂中的应用。
优选地，所述调控肠道微生态具体为降低肠道微生物群的多样性、或者促进双歧杆菌生长；进一步优选地，所述双歧杆菌为长双歧杆菌、青春双歧杆菌、假小链双歧杆菌。优选地，白头翁提取物为白头翁水提取物或白头翁醇提取物；进一步优选地，醇提取物选自甲醇提取物、乙醇提取物；所述乙醇提取物进一步优选为70％-95％的乙醇提取物。
所述的白头翁水提取物采用如下步骤制备：称取一定重量的干燥的白头翁药材，在料液比为1:4-10的条件下加热回流提取2次，每次1-2h，用纱布过滤，收集并合并两次滤液，将提取液减压浓缩至1/4体积后进行冷冻干燥。优选地，料液比为1:4，加热回流时间为1h。
所述的白头翁醇提取物采用如下步骤制备：称取一定重量的干燥的白头翁药材，在料液比为1:4-10的条件下加热回流提取2次，每次1-2h，用纱布过滤，收集并合并两次滤液，将提取液减压浓缩，使醇蒸干后加蒸馏水溶解，进行冷冻干燥。优选地，料液比为1:4，加热回流时间为1h。、
本发明一方面提供了可以调控肠道微生态菌群的益生元组合物，组合物中至少包含白头翁提取物。
优选地，组合物中仅含有白头翁提取物，或者组合物中可进一步包含药学上可接受的载体或辅料。
本发明具有如下突出的效果：
现阶段，很多产品都是基于动物的研究，由于动物与人体菌群差异非常大，并且，人体体内评估又由于人体的复杂性无法避免内源因素的干扰。为此，本发明首次建立了体外发酵体系，从整体丰度，到定量再到菌种水平检测和人粪便来源菌株验证，能更好的模拟人体内真实环境，精准筛选出中药靶向促进生长的益生菌种类。解决了当前的盲目配伍和非人体来源的问题。
另外，利用本发明构建的体外发酵体系，本发明首次证实了白头翁提取物可降低肠道微生物群的多样性，并且具有促进人体双歧杆菌生长的作用。该研究的发现可为以后通过双歧杆菌治疗相关疾病提供一定的研究基础。
附图说明
图1PRE对肠道微生物群多样性的影响。图1A和1B显示了在8小时和24小时对照组和PRE之间α-多样性的Shannon指数差异，图1C和1D显示了在8小时和24小时对照组和PRE之间α-多样性的Simpson指数差异，图1E和1F显示了在8小时和24小时对照组和PRE之间β-多样性的Anonim指数差异，图1G显示PCoA分析结果。
图2PRW和PRE对门、属水平微生物菌群相对丰度的影响；
图3白头翁提取物促进双歧杆菌的盒子图；
图4qPCR检测的引物体系；
图5白头翁提取物对双歧杆菌的生长促进作用；
图6白头翁醇提取物对长双歧杆菌的生长促进作用。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
下面为具体的实施方法。
实施例1、白头翁提取物制备
白头翁购自同仁堂，其提取物采用水提和醇提两种方法进行。
白头翁水提取物(PRW)的具体制备步骤为：称取干燥的白头翁药材500g，在料液比为1:6下加热回流提取2次，每次1h，用纱布过滤，收集并合并两次滤液。将提取液减压浓缩至1/4体积后进行冷冻干燥。
白头翁醇提取物(PRE)的具体制备步骤为：PRE采用95％乙醇提取。称取干燥的白头翁药材500g，在料液比为1:4下加热回流提取2次，每次1h，用纱布过滤，收集并合并两次滤液。将提取液减压浓缩，使乙醇蒸干后加蒸馏水溶解，进行冷冻干燥。
实施例2、白头翁提取物对肠道微生态影响
1、粪便接种发酵
采集新鲜粪便：三名健康成人，未患有任何代谢和胃肠疾病，在粪便样本捐献前三个月未服用抗生素、益生菌或益生元。所有受试者在研究中均给予书面知情同意。本研究经山西省医院研究伦理委员会批准。
取一份180ml培养基(培养基组成如下表所示)，提前一天于厌氧培养系统中放置过夜。在粪便排泄后15分钟内，按照0.1g新鲜粪便/1ml厌氧PBS的比例(即10％)进行稀释，并均匀化2分钟。将20ml稀释后的样品添加到提前放置在厌氧培养系统中的培养基中。在培养基中按照1g/100ml的比例加入PRW或PRE。0h、8h、24h分别吸取液体3ml，4000rpm离心10min，沉淀立即置于-80℃待分析。
2、提取DNA、PCR扩增、16S rDNA测序
采用DNeasy Power Soil Pro Kit(Qiagen，Hiden，Germany)提取待分析样品中的基因组DNA。以基因组DNA为模板，PCR扩增16S rRNA基因的V4区。纯化扩增的PCR片段并进行定量。采用KAPA Hyper Prep Kit(Roche)试剂盒构建16S rDNA扩增子文库。采用IlluminaNovaSeq 600系统对文库进行双末端测序。
3、生物信息及统计分析
采用Dix-seq pipeline(version 0.0.1)用于原始16S测序分析。采用基于weighted_unifrac、unweighted_unifrac以及bray_curtis distances的主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)和非度量多维尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling，NMDS)评估样本之间的差异。原始计数表用于不同分类水平(门、目、类、科、属、ZOTU)的差异丰度分析。
4、结果分析
PRW和PRE降低了肠道微生物群的多样性
反映物种丰富度的香农指数(Simpson index)表明，各组之间存在显著差异(F＝6.708，p＝0.004)。分析结果显示，在发酵24小时后，PRW和PRE的细菌种类显著低于对照组(P＝0.037<0.05，P＝0.000<0.01)，在发酵8小时，PRW组的细菌种类也显著低于对照组。PRE的物种丰富度下降程度取决于发酵时间，8小时显著低于0小时，24小时显著低于8小时。Simpson指数还表明，三组在发酵24小时时存在显著差异。进一步分析表明，各组之间的β多样性存在显著差异。主成分分析(PCoA)图显示，样本是基于PRE分离的，PRW补充来自对照组的数据，两个补充组一起聚类。图1显示了对照组和PRE组在发酵8小时和24小时时的差异。
PRW和PRE对门、属水平微生物菌群相对丰度的影响
在门的水平上可以看到组间相对丰度的差异(图2A)。PRW和PRE，尤其是PRE诱导的放线菌门(actinobacteria phylum)在8h和24h时增加，而厚壁菌门(Firmicutes)和梭杆菌门(Fusobacteria phylum)显著减少，且呈时间依赖性。在属水平上可以看到一些属在类群之间相对丰度的差异(图2B)。与对照组和PRW组相比，PRE组的双歧杆菌属(bifidobacterialgenus)在8小时显著增加。埃格泰拉(Eggerthella)和梭状芽孢杆菌属(clostridium_XIVb)减少(图3)。
放线菌是革兰氏阳性细菌，具有广泛的次级代谢活性，目前临床使用的天然衍生抗生素中约三分之二是由放线杆菌产生的，其还可以用于生产抗癌、驱虫和抗真菌化合物。双歧杆菌即属于放线菌门，被广泛用作益生菌，双歧杆菌及其代谢产物，特别是短链脂肪酸，对于向上皮细胞转化提供能量和有效的抗菌活性至关重要，在许多病理条件下显示出有益的效果。梭杆菌在许多混合性感染中均存在，许多潜在的致病菌属于埃格泰拉和梭杆菌。因此推测，白头翁提取物可能是通过对上述肠道菌群的影响发挥疾病治疗作用。
实施例3、白头翁提取物对双歧杆菌影响
PRW和PRE对双歧杆菌丰度和生长的影响
采集健康人新鲜粪便，按照前述粪便接种发酵方法，研究白头翁提取物PRW或PRE对菌群变化的影响。通过16s高通量测序的方法对比发酵0小时、8小时和24小时菌群的动态变化。
在体外对受试健康人的粪便进行了体外培养组学检测，分离到的双歧杆菌主要为青春双歧杆菌、假小链双歧杆菌和长双歧杆菌。进一步使用qPCR进行检测参见图4，可见白头翁醇提物能够双歧杆菌丰度产生显著影响。而且由图5和图6可知，白头翁醇提物对长双歧杆菌的生长促进作用最为显著。
进一步购买人粪便来源的ATCC15707 Bifidobacterium longum标准菌株，以PRE代替葡萄糖的BBL液体培养基进行培养，加入5mg/ml PRE进行验证。结果表明长双歧杆菌确实能够利用PRE为碳源生长。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
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