含有环丙基骨架的化合物在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的应用
阅读说明：本技术 含有环丙基骨架的化合物在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的应用 (Application of compound containing cyclopropyl skeleton in preparation of medicine for treating and/or preventing coronavirus infection ) 是由 岑山 吕凯 刘明亮 赵建元 于 2021-03-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及含有环丙基骨架的化合物在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的应用,该类含有环丙基骨架的化合物为GSK-LSD1·2HCl,ORY-1001·2HCl,DDP-38003·2HCl,OG-L002,体外抗冠状病毒活性和酶活性水平评价显示该类化合物具有较好的抗冠状病毒活性。(The invention relates to application of a compound containing a cyclopropyl skeleton in preparation of a medicine for treating and/or preventing coronavirus infection, wherein the compound containing the cyclopropyl skeleton is GSK-LSD1 & 2HCl, ORY-1001 & 2HCl, DDP-38003 & 2HCl and OG-L002, and evaluation of in vitro coronavirus resistant activity and enzyme activity level shows that the compound has better coronavirus resistant activity.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及含有环丙基骨架的化合物在制备治疗和/或预防药物中的应用。
背景技术
当前爆发的新型冠状病毒肺炎疫情(SARS-CoV-2)以及2002年爆发的SARS疫情，均由以前未知的冠状病毒(Coronavirus,CoV)引起。冠状病毒由于其不可预测性，可通过飞沫以及接触呼吸道分泌物等途径传播，带来严重后果，已成为影响人类健康的重大威胁之一。
SARS-CoV-2基因组长度为29.8kb-29.9kb，编码16个非结构蛋白(nsp1-nsp16)。这16种nsps中的一些是SARS-CoV-2复制所必需的酶。其中包括木瓜样蛋白酶(nsp3)、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(3CL蛋白酶，nsp5)、引物酶复合物(nsp7-nsp8)、RNA依赖的RNA聚合酶RdRp(nsp12)、解旋酶(nsp13)和外切酶(nsp14)，这些都是抗SARS-CoV-2药物开发的潜在靶点。
本研究通过本申请人化合物库进行筛选，发现含有环丙基骨架结构的多个化合物具有优秀的抗冠状病毒活性，以及抑制SARS-CoV-2RdRp的活性。这些化合物是潜在的用于治疗新冠感染的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一类含有环丙基骨架的化合物在制备抗冠状病毒药物中的应用
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明提供了一类含有环丙基骨架的化合物在制备抗冠状病毒药物中的应用，所述含有环丙基骨架的化合物具备如下任一种结构：
作为本发明的一些实施方案，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2，SARS-CoV,MERS-CoV,HCoV-OC43，HCoV-NL63。
作为本发明的一些实施方案，所述含有环丙基骨架的化合物作为唯一活性成分在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的应用。
作为本发明的一些实施方案，所述含有环丙基骨架的化合物与其他药物共同作为活性成分在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的应用。
基于其对冠状病毒治疗的有效性，其可以和另一种或多种其它活性成分联合用于治疗、预防、抑制或者改善疾病或者病状，其中药物的联合使用比任何一种药物的单独使用更为安全或者更为有效。
作为本发明的一些实施方案，所述含有环丙基骨架的化合物包括其以及其可药用的盐和酯、溶剂合物、异构体、多晶型物、同位素标记的化合物、代谢物或前药。
作为本发明的一些实施方案，所述可药用的盐包括无机酸盐和有机酸盐。
所述无机酸包括例盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸或硝酸。
所述有机酸包括甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、巴莫酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、胺基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、D-葡萄糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水杨酸。
优选的，所述可药用的盐为盐酸。
优选的，具体为如下结构：
作为本发明的一些实施方案，所述抗冠状病毒药物含有至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。其剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、混悬剂、乳剂、粉剂、口服液、凝胶剂、糖浆剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、锭剂、合剂、栓剂、注射剂、吸入剂或喷雾剂。
如本文所用，“药学上可接受的载体或赋形剂”包括：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、粒化剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、增甜剂、调味剂、掩味剂、着色剂、防结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂，本领域技术人员将理解，某些药学上可接受的赋形剂可以以多于一种功能和以替代性功能来使用，取决于所述赋形剂在制剂中存在多少和在制剂中存在何种其它成分。
例如：当用于口服时，可以制成口服制剂，如片剂、胶囊剂、颗粒剂和丸剂等，包含填充剂(例如糖类衍生物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和山梨糖醇；淀粉衍生物如玉米淀粉、土豆淀粉、糊精和羧甲基淀粉；纤维素衍生物如结晶纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠；阿拉伯胶；右旋糖酐；硅酸盐衍生物如偏硅酸镁铝；磷酸盐衍生物如磷酸钙；碳酸盐衍生物如碳酸钙；硫酸盐衍生物如硫酸钙等)、粘合剂(例如明胶、聚乙烯吡咯烃酮和聚乙二醇)、崩解剂(例如纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烃酮)、润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、鲸蜡、硼酸、苯甲酸钠、亮氨酸)、稳定剂(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、矫味剂(例如常用的甜味剂、酸味剂和香料等)。当用于肠胃外时，可以制成注射剂，包括注射用无菌粉末与注射用溶剂，所用载体或赋形剂包含无菌水、林格氏液和等渗氯化钠溶液，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。当用于直肠给药时，所述药物可以制成栓剂等。用于经肺给药时，所述药物可以制成吸入剂或喷雾剂等。
有许多本领域技术人员可用的资源，这些资源描述了药学上可接受的赋形剂且其可用于选择合适的药学上可接受的赋形剂，例如《雷明登药学大全》、《中国药学年鉴》、《药剂学》等书籍。
在本发明的技术方案中，所述冠状病毒感染包括冠状病毒所致的呼吸道感染、肺部感染或并发症。
发明的有益效果：
本发明经验证证实了所提供的一类含有环丙基骨架的化合物对冠状病毒具备抑制作用，可以用作治疗和/或预防冠状病毒感染所致疾病方面的药物，具备良好的开发前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例2中DDP-38003·2HCl对HCoV-NL63的抗病毒活性结果图；
图2是本发明实施例3中细胞水平CoV-RdRp-Gluc报告系统的建立图；
图3是本发明实施例3中Western Blot检测nsp12，nsp7和nsp8表达量图；
图4是本发明实施例3中Gasussia荧光素酶活性检测结果图；
图5是本发明实施例3中oV-RdRp-Gluc报告系统用于高通量筛选的Z’因子检测结果图；
图6为本发明实施例3中DDP-38003·2HCl对SARS-CoV-2 RdRp的抑制活性结果图。
具体实施方式
以下结合结合具体实施例阐述本发明，这些实施例不旨在限制本发明的范围，而是为本领域技术人员了解和实施本发明应用提供指导。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明具体实施方式部分所记载的真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp7、真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp8、真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp10、真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp12、真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp14为将nsp7、nsp8、nsp10、nsp12、nsp14基因分别通过XhoI无缝克隆到pCMV6-entry(购自ORIGEN)载体所获得的质粒。
nsp7、nsp8、nsp10、nsp12、nsp14基因参见Chin.Med.J.2020；00:00–00.doi:10.1097/CM9.0000000000000722。
本实施例所用的含环丙基骨架化合物GSK-LSD1·2HCl,ORY-1001·2HCl,DDP-38003·2HCl,OG-L002均可通过市售获得，本研究所述化合物购自Medchemexpress，结构如表1：
表1含环丙基骨架化合物结构
实施例1含有环丙基骨架的化合物对HCoV-OC43的抗病毒活性
HCT-8细胞按1.0×104个/ml接种于96孔板，每孔100μL，细胞培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养48小时。弃上清，更换为含2％FBS的新鲜DMEM培养基，以MOI＝0.1感染HCoV-OC43(ATCC：VR-1558)病毒。每孔加入梯度稀释的含有环丙基骨架的化合物(终浓度从25μM按2倍稀释，稀释7个梯度)1μL，阴性对照组每孔加入1μL DMSO(二甲基亚砜)，采用广谱抗病毒核苷类抑制剂瑞德西韦作为阳性对照(终浓度从25μM按2倍稀释，稀释7个梯度)每孔加入1μL，接着在33℃下继续培养60小时。加入20μL Cell Proliferation ColorimetricAssay(MTS)试剂37℃作用3小时。最后检测490nm波长下产生的吸收峰。抑制率(相对感染性)的计算公式：抑制率＝(病毒组–样品组)/(病毒组–空白组)×100％，使用GraphPadPrism 5.0进行作统计学分析得到EC50，结果见表2。
表2对HCoV-OC43的EC50
编号
EC<sub>50</sub>(μM)
GSK-LSD1·2HCl
28.54
ORY-1001·2HCl
24.35
DDP-38003·2HCl
1.59
OG-L002
10.34
瑞德西韦
1.05
实施例2DDP-38003·2HCl对HCoV-NL63的抗病毒活性
LLC-MK2细胞按1.0×104个/ml接种于96孔板，每孔100μL，细胞培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养48小时。弃上清，更换为含2％FBS的新鲜DMEM培养基，以MOI＝0.01感染HCoV-NL63病毒。每孔加入梯度稀释的DDP-38003·2HCl(终浓度从25μM按2倍稀释，稀释7个梯度)1μL，阴性对照组每孔加入1μL DMSO(二甲基亚砜)，采用广谱抗病毒核苷类抑制剂瑞德西韦作为阳性对照(终浓度从25μM按2倍稀释，稀释7个梯度)每孔加入1μL，接着在33℃下继续培养60小时。加入20μL Cell Proliferation Colorimetric Assay(MTS)试剂37℃作用3小时。最后检测490nm波长下产生的吸收峰。抑制率(相对感染性)的计算公式：抑制率＝(病毒组–样品组)/(病毒组–空白组)×100％，使用GraphPad Prism 5.0进行作统计学分析得到EC50,结果如图1所示。
实施例3DDP-38003·2HCl对新冠病毒外切酶nsp12的抗性实验
步骤1：细胞水平CoV-RdRp-Gluc报告系统的建立
新冠病毒SARS-CoV-2RdRp特异启动的荧光素酶报告系统，简称CoV-RdRp-Gluc。在新冠病毒5′UTR和3′UTR之间插入Gaussia luciferase(Gluc)编码序列(如SEQ ID NO.1所示)，然后将其插入pRetroX-Tight-Pur(Clontech)载体BamHI-HF(#R3136L，NEB)和Notl(NotI-HF，NEB)位点之间，引物为正向(5'-GGC GGA TCC ATT AAA GGT TTA TAC-3'，如SEQID NO.2所示)和反向(5'-TTA GCG GCC GCG TCA TTC TCC TAA GAA-3'，如SEQ ID NO.3所示)，构建了pCoV-Gluc质粒。在CMV启动子的作用下，正链的Gluc(mRNA)发生转录，经翻译产生Gluc蛋白。当在系统中同时表达新冠病毒RNA依赖的RNA聚合酶(nsp12)时，RdRp首先以正链的Gluc为模板合成负链的vRNA，随后vRNA被转录为正链Gluc(mRNA)，最终翻译成Gluc蛋白。因此，加入RdRp后增加的Gluc反映了SARS-CoV-2RdRp的活性。构建原理示意图见图2。
鉴于nsp12发挥功能时需要nsp7和nsp8的参与，本实施例分别设置了三组试验进行比较：单独表达CoV-Gluc(上述构建的pCoV-Gluc质粒)(10ng)，共表达CoV-Gluc(10ng)和真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp12(nsp12)(200ng)以及共表达CoV-Gluc(10ng)、nsp12(200ng)、真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp7(nsp7)(600ng)和真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp8(nsp8)(600ng)，实验中为了保证质粒总的转染量相同，各组中添加空载体质粒pCMV6-entry补齐。表达结果检测方法如下：
(1)Western Blot实验
将2.5×105个/mL的HEK 293T细胞悬液，按照每孔2mL接种于6孔板中。HEK 293T细胞所用培养基分别为含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基；将细胞在37℃含5％二氧化碳恒温培养箱培养。待细胞长至80％时，HEK 293T细胞组每孔按上述实验组设计进行质粒转染。转染后4小时将培养基换成含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基；继续培养24小时。弃培养基，每孔加入80μL的RIPA裂解液，将裂解液转移至1.5ml EP管中冰上裂解20分钟，每管加入20μL的5X蛋白上样缓冲液(loading buffer)，100摄氏度金属浴煮30分钟。SDS-PAGE凝胶电泳分离，Western Blot检测nsp12，nsp7和nsp8表达量。检测结果见图3。
(2)Gasussia荧光素酶活性检测
将250μg的底物Coelenterazine-h冻干粉末溶解于600μL的无水乙醇中，制成浓度为1.022mM的底物母液，保存在-20℃；测量前，将母液以1:60的比例稀释于PBS中，制成底物工作液。在室温静置30min以稳定工作液，由于底物见光不稳定，全程需要避光处理；取10μL细胞培养上清(上述Western Blot实验中转染后培养24小时后的细胞上清)到白色不透明96孔板中，利用酶标仪Centro XS3 LB 960自动进样器将避光孵育的底物工作液按每孔60μL的进样量逐孔加入，持续收集信号0.5秒，测量结果以相对光单位Relative Light Units(RLU)表示。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，其中，**P<0.01，***P<0.001是以单独表达CoV-Gluc组为参照。实验数据以表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图和统计学分析。检测结果见图4。
实验结果显示，共表达CoV-Gluc和nsp12组以及CoV-Gluc、nsp12、nsp7和nsp8组分别是单独表达CoV-Gluc组Gluc的2倍和38倍。上述结果说明本发明所构建的CoV-RdRp-Gluc系统中Gluc蛋白的表达特异性地依赖于新冠病毒RdRp。
对上述CoV-RdRp-Gluc报告系统进行了Z’因子检测，检测方法如下：
将2.5×105个/mL的HEK 293T细胞悬液，按照每孔2ml接种于6孔板中，培养24h后转染。分两组进行：表达质粒CoV-Gluc(10ng)的细胞为阴性对照(补加1.4μg质粒pCMV6-entry，购自ORIGEN),共表达质粒CoV-Gluc(10ng)、nsp12(200ng)、nsp7(600ng)和nsp8(600ng)的细胞为阳性对照组。转染12h后，分别将两组细胞用胰酶消化，加入DMEM培养基制成细胞悬液，接种于96孔板(1×105个/mL)，每孔100μl。培养24h后检测荧光素酶活性。计算公式为：Z′因子＝1-(3×阳性对照组相对荧光值SD+3×阴性对照组相对荧光值SD)/(阳性对照组相对荧光值平均值-阴性对照组相对荧光值平均值)，结果见图5，从中可知Z’因子为0.73，符合高通量筛选的要求。
步骤2：利用CoV-RdRp-Gluc报告系统对本发明的DDP-38003·2HCl进行测试实验
将2.5×105个/mL的HEK 293T细胞悬液，按照每孔2ml接种于6孔板中。待细胞长至80％时，HEK 293T细胞组每孔共转染10ng实施例1构建的pCoV-Gluc，200ng真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp12，600ng真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp7和600ng真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp8质粒。转染后4小时将培养基换成含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，继续培养12小时。将六孔板中的细胞消化后制成细胞悬液，按1.0×104个/ml的HEK293T细胞接种于96孔板，每孔100μL。每孔分别加入1μL浓度为10μM的化合物DDP-38003·2HCl和瑞德西韦，接着培养24小时进行处理。其中阴性对照组每孔加入1μL DMSO(二甲基亚砜)。最后按照步骤1的方法检测荧光值。
化合物DDP-38003·2HCl和瑞德西韦的终浓度分别为0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10，20，40μM。实验组进行了三次，每次实验以每组的DMSO组为参照。实验数据以表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图和统计学分析。结果参见图6中的B。实验结果表明，化合物DDP-38003·2HCl抑制SARS-CoV-2 RdRp的EC50为1.43μM，而阳性化合物瑞德西韦的EC50值为1.08μM，两者EC50(DDP-38003·2HCl/瑞德西韦)相当。实验结果表明，小分子DDP-38003·2HCl可通过抑制SARS-CoV-2 RdRp从而发挥潜在的抗新冠病毒作用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
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