洛美他派在制备用于治疗脑卒中引起的神经损伤药物中的新用途
阅读说明：本技术 洛美他派在制备用于治疗脑卒中引起的神经损伤药物中的新用途 (New application of lomitapide in preparation of medicines for treating nerve injury caused by cerebral apoplexy ) 是由 郑仰民 罗玉敏 韩子萍 赵海苹 闫峰 王荣亮 陶真 范俊芬 张斯佳 于 2021-01-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供洛美他派的药物新用途。为：洛美他派在制备如下1)-4)产品中的应用：1)预防和/或治疗缺血性脑血管病的药物；2)预防和/或治疗脑卒中的药物；3)用于缺血性脑血管病的神经保护药物；4)用于缺血性脑血管病的神经修复治疗药物；本发明通过实验表明洛美他派对脑卒中特别是缺血性脑卒中导致的神经损伤具有优异的治疗作用。(The invention provides a new application of lometasdep. Comprises the following steps: the application of the lomitapide in preparing the following products 1) to 4): 1) drugs for the prevention and/or treatment of ischemic cerebrovascular diseases; 2) drugs for the prevention and/or treatment of stroke; 3) neuroprotective agents for ischemic cerebrovascular diseases; 4) a nerve repair therapeutic agent for ischemic cerebrovascular diseases; experiments show that the lometasapine has an excellent treatment effect on nerve injury caused by stroke, particularly ischemic stroke.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及洛美他派在制备用于治疗脑卒中引起的神经损伤药物中的新用途。
背景技术
洛美他派，2012年美国食品与药品管理局(FDA)批准用于治疗纯合子型家族性高胆固醇血症，它通过抑制微粒体甘油三酯转移蛋白抑制剂的活性，从而防止载脂蛋白B(apoB)在肠上皮细胞和肝细胞的组装，抑制乳糜微粒和极低密度脂蛋白的合成，进而降低血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。但是尚未见其在治疗缺血性脑血管病导致的神经损伤方面具有活性的报道和专利，因此在此基础上，继续研究洛美他派的新用途，扩展其应用领域。
脑血管病是世界性难题，其发病率、致残率、致死率、复发率居高不下，尤其高致残率给社会及家庭均造成极大负担，即使进行康复训练，仍有很大比率患者伴随着偏瘫、吞咽困难、失语等，导致生活无法自理。因此，神经功能修复是脑血管病急需攻克的一个科学难题。近二十年来，世界上许多国家对脑血管病的基础研究投入了大量人力、物力，然而收效甚微，神经保护防治策略亟待进一步加强。缺血性脑血管病占脑血管病发病的80％左右，目前在缺血性脑血管病的药物研究中，除了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)之外，其他药物的临床实验几乎全部失败。而tPA受严格的时间窗限制，接受治疗的患者极其有限，仅有不到5％的患者能接受此治疗疗法。因此，研发安全有效的神经保护和神经修复治疗药物，对于防治或减轻神经损伤病情，促进神经功能恢复，降低致死率、致残率，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种洛美他派的药物新用途。
本发明所提供的洛美他派的药物新用途，为：洛美他派在制备如下1)-4)产品中的应用：
1)预防和/或治疗缺血性脑血管病的药物；
2)预防和/或治疗脑卒中的药物；
3)用于缺血性脑血管病的神经保护药物；
4)用于缺血性脑血管病的神经修复治疗药物；
所述2)中，所述脑卒中具体可为缺血性脑卒中。
所述洛美他派包括洛美他派原药及其盐、酯、水合物。
本发明还提供一种预防和/或治疗缺血性脑血管病的药物，所述药物含有洛美他派原药及其盐、酯、水合物。
本发明还提供一种预防和/或治疗脑卒中的药物，所述药物含有洛美他派原药及其盐、酯、水合物。
本发明还提供一种用于缺血性脑血管病的神经保护药物，所述药物含有洛美他派原药及其盐、酯、水合物。
本发明还提供一种用于缺血性脑血管病的神经修复治疗药物，所述药物含有洛美他派原药及其盐、酯、水合物。
上述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明实验结果表明，洛美他派可以显著改善细胞糖氧剥夺导致的神经细胞活性抑制；并显著降低大脑中动脉闭塞小鼠脑组织萎缩程度，提高小鼠神经功能评分。以上结果提示洛美他派对脑卒中特别是缺血性脑卒中引起的神经损伤具有优异的治疗作用。
附图说明
图1为洛美他派对SH-SY5Y神经细胞活力的影响。
图2为洛美他派预处理显著改善糖氧剥夺导致的SH-SY5Y神经细胞活性抑制，与OGD模型组相比，#P<0.05。
图3为洛美他派对小鼠皮层原代神经元细胞活力的影响，与对照组相比，*P<0.05。
图4为洛美他派预处理显著改善糖氧剥夺导致的原代小鼠神经元细胞活性抑制，与OGD模型组相比，#P<0.05。
图5为神经功能评分—贴条实验(感觉运动能力)，胶带粘在小鼠左爪示意图。
图6表明洛美他派降低了大脑中动脉闭塞(MCAO)模型小鼠脑组织萎缩程度百分比，与MCAO模型组相比，#P<0.05。
图7为神经功能评分—贴条实验(感觉运动能力)，小鼠被粘附胶带后的反应时间(A)和移除时间(B)，与MCAO模型组相比，###P<0.001。
图8为神经功能评分—平衡木实验(行走运动能力)，检测小鼠运动能力恢复，与MCAO模型组相比，###P<0.001。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供洛美他派的药物新用途。
本发明所提供的洛美他派的药物新用途，为：洛美他派在制备如下1)-4)产品中的应用：
1)治疗缺血性脑血管病的药物；
2)治疗脑卒中的药物；
3)用于缺血性脑血管病的神经保护药物；
4)用于缺血性脑血管病的神经修复治疗药物；
所述2)中，所述脑卒中具体可为缺血性脑卒中。
本发明实验结果表明，洛美他派可以显著改善糖氧剥夺导致的神经细胞活性抑制；并显著降低大脑中动脉闭塞小鼠脑组织萎缩程度，提高小鼠神经功能评分。以上结果提示洛美他派对脑卒中特别是缺血性脑卒中导致的神经损伤具有优异的治疗作用。
实施例1、利用细胞OGD模型考察洛美他派对神经元的保护作用
实验对象：体外实验部分使用的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系来源于ATCC，由首都医科大学宣武医院脑血管病研究室保藏；皮层原代神经元取自孕16-18天的C57BL/6J小鼠，清洁级别为SPF级，本研究中所用的孕鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
细胞糖氧剥夺(OGD)模型的建立：细胞糖氧剥夺模型是验证药物防治缺血性脑卒中作用的常用细胞模型。将细胞培养于96孔板，待细胞贴壁后，PBS清洗细胞两次，清除孔板内的残留的糖，加入无糖培养基后，放入密闭盒子内，向盒子内持续通入5％CO2+95％N2的混合气体，持续10分钟后关闭密闭盒子的阀门，将密闭盒放入37℃条件下继续培养8(SH-SY5Y神经细胞)或2.5(小鼠皮层原代神经元细胞)小时后，将所有处理组细胞的培养基均换成完全培养基，用于后续实验。
小鼠皮层原代神经元细胞的分离培养：取16-18天C57孕胎小鼠，分离出两侧大脑皮层，仔细剥去脑膜，将大脑皮层夹碎成小块，放入0.05％胰酶中，37℃条件下消化3分钟，期间震荡几次，使脑组织与胰酶充分接触，将脑组织吹至单细胞状态，过滤细胞悬液，900rpm离心5分钟，弃上清，加适量的Neurobasal培养基(来源于GibcoTM，货号21103049)重悬细胞，按照24000-36000个细胞/cm2的密度接种于孔板中，6小时后换液，以后按照细胞状态每2-3天半量换液，直至细胞汇合度达到80-90％可用于后续实验。
细胞活力检测(Luminescent细胞活力检测试剂盒，来源于promega，货号G7570)：每孔换入100μL新的培养基，在室温下平衡30分钟，然后每孔加入等体积的试剂，摇床震动混匀2分钟诱导细胞裂解后，将96孔板置于室温下孵育10分钟，以稳定发光信号，最后在酶标仪上于450nm处读取细胞的吸光度。
(1)人源SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系检测洛美他派的神经保护作用
①洛美他派对SH-SY5Y神经细胞活力的影响
SH-SY5Y细胞给予0.01μM、0.1μM、1μM浓度的洛美他派(来源于selleck，货号：S7635，分子量692.71，化学式C39H37F6N3O2,CAS号，182431-12-5)处理24h，检测细胞活力，结果如图1，表明在此浓度下洛美他派对细胞活力并未有显著影响。
②洛美他派预处理可以显著改善糖氧剥夺导致的SH-SY5Y神经细胞活性抑制
OGD处理前，给予0.01μM、0.1μM、1μM浓度的洛美他派培养细胞24h，然后OGD处理8h后，利用Luminescent细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。如图2，与OGD模型组相比，洛美他派0.1μM、1μM浓度预处理组可以缓解OGD导致的SH-SY5Y细胞损伤，且具有统计学差异。
(2)小鼠皮层原代神经元细胞检测洛美他派的神经保护作用
①洛美他派对小鼠皮层原代神经元细胞活力的影响
原代神经元细胞给予0.01μM、0.1μM、1μM浓度的洛美他派处理24h，检测细胞活力，结果如图3所示，洛美他派对小鼠原代神经元细胞具有轻微的促进增殖作用，并在0.1μM浓度处理下具有显著促进细胞增殖作用。
②洛美他派预处理可以显著改善糖氧剥夺导致的原代小鼠神经元细胞活性抑制
OGD处理前，给予0.01μM、0.1μM、1μM浓度的洛美他派培养细胞24h，然后OGD处理2.5h后，利用Luminescent细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。如图4，与OGD模型组相比，洛美他派0.01μM、0.1μM浓度预处理组可以缓解OGD导致的原代小鼠神经元细胞损伤，且具有统计学差异，这与SH-SY5Y细胞中的结果一致。
实施例2、利用小鼠MCAO模型考察洛美他派的神经保护作用
实验对象：本研究体内实验部分以健康成年C57BL/6J雄性小鼠为研究对象，小鼠周龄为12-14周，体重为21～23g，清洁级别为无特定病原体级(Specific pathogen Free，SPF级)。实验动物均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
洛美他派给药方案：C57BL/6J雄性小鼠0.5mg/kg，缺血再灌注后立即给药，每日一次，持续14天，药物溶于DMSO溶液配置为高浓度母液储存，小鼠灌胃给药时，生理盐水稀释到所需浓度。
小鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO)：小鼠大脑中动脉闭塞模型是验证药物防治缺血性脑卒中作用的常用动物模型。小鼠称重后用4％恩氟烷诱导麻醉，1％-2％恩氟烷混合70％N2O和30％O2维持麻醉。将小鼠仰卧于手术台上，取颈部正中切口，分离出右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。电凝切断甲状腺动脉和枕动脉。在颈外动脉结扎两条9/0尼龙缝合线，其中近心端不做紧密结扎，远心端做紧密结扎。并在颈总动脉的近心端结扎缝合线，不做紧密结扎。颈内动脉的远心端用小鼠动脉夹夹闭血管。在颈外动脉结扎的远心端电凝切断。用显微剪在颈外动脉的两结扎处之间剪一小口，插入头端直径0.25mm的线栓，松开近心端的结扎线，使线栓经颈内动脉进入大脑中动脉直至遇到轻微阻力，进栓长度约12mm。拉紧颈外动脉近心端的结扎线以固定线栓，解开颈总动脉上的缝合线。用0.9％生理盐水润湿无菌纱布，覆盖手术区域并继续监测肛温，45min后拔出线栓恢复血流。缝合皮肤。术后小鼠饲养于SPF级动物实验室14天，自由进食饮水。
脑组织萎缩程度计算：各组小鼠脑缺血再灌注14天，麻醉后用生理盐水经心脏灌注，至肝脏变白，剥离脑组织放入脑膜，以视交叉为标线冠状切片，向前切2片向后切4片，每片厚1mm。按照顺序摆放后数码相机拍照。通过ImageJ软件测量并计算脑组织丢失比列，脑组织丢失比例(％)＝(正常侧大脑半球面积-梗死侧大脑半球面积)/正常侧大脑半球面积×100％。
行为学评分：
①为明确小鼠运动恢复能力，采用平衡木评分的方法进行评估。实验所用平衡木的长度为1米，宽度为7毫米，平衡木距离试验台的高度为40厘米，横木下方铺泡沫板以防止动物跌落摔伤。评分之前提前训练3天，让所有小鼠可以非常熟练的通过平衡木(15秒以内)，不符合条件的小鼠剔除本研究。训练满3天后行小鼠MCAO手术，手术后1天，3天，5天，7天，10天，14天，分别进行平衡木评分，每天评分3次。具体评分标准如下：0分：小鼠不能在横木上停留；1分：小鼠不动，但是可以在横木上停留；2分：小鼠试图穿过横木，但是失败了；3分：小鼠爬过横木，病灶对侧后肢几乎不起作用，滑下横木次数超过50％；4分：小鼠爬过横木，病灶对侧后肢滑下横木次数大于1次小于50％；5分：小鼠爬过横木，病灶对侧后肢滑下横木1次；6分：小鼠正常通过横木。
②为评价小鼠感觉运动能力，采用贴条实验的方法进行评估。所用贴条面积为(3mm×3mm)、容器为(透明圆柱体，高20cm，直径10cm)。方法：Ⅰ.将小鼠放入圆柱体中适应5min(若检测场地与饲养场地不同，检测前需要让动物适应新环境30min)；Ⅱ.小拇指夹住小鼠的尾巴，从后背抓住皮，固定好上肢，将贴条黏在小鼠前爪掌部(如图5，无毛部分)，放入容器中(一般贴病灶对侧前肢，亦可双侧都贴)；Ⅲ.计时器记录两个时间：小鼠嘴部第一次接触贴条的时间(Contact time)、将贴条撕掉的时间(Remove time)，如果超过120s没撕掉贴条，按照120s记录结果，撕条前踩到尿要重新评分；Ⅳ.操作过程中动作要轻柔，避免长时间提着小鼠尾巴使其处于悬空状态；Ⅴ.可以通过全程录像，双人观测、记录。
(1)洛美他派降低了MCAO模型小鼠脑组织萎缩程度百分比
脑缺血后14天我们对小鼠脑组织进行形态学检查。用连续冠状脑切片计算脑组织萎缩的百分比。如图6，结果表明模型组小鼠具有明显的脑组织萎缩，而洛美他派治疗显著减少了缺血后14天脑组织的萎缩程度(n＝8，P<0.05)。说明洛美他派对小鼠脑缺血再灌注引起的神经损伤具有显著的改善作用。
(2)洛美他派对MCAO模型小鼠的神经功能保护
缺血再灌注后1、3、7、10、14天分别进行神经功能测试。我们利用贴条实验来评估小鼠缺血性中风后的感觉运动功能。与模型组小鼠相比，洛美他派处理组小鼠从接触，到从左前爪撕下胶带所用的时间显著缩短，表现出更好的感觉运动功能(P<0.001)(图7A，B)。此外，为明确小鼠运动恢复能力，如图8，我们通过平衡木实验发现洛美他派可显著改善缺血再灌注后脑损伤小鼠的运动功能，与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.001)。以上结果说明洛美他派可以明显改善脑缺血再灌注导致的神经功能损伤症状。
综上，从细胞实验结果可以看出SH-SY5Y神经细胞系和小鼠皮层原代神经元细胞糖氧剥夺后，都会抑制细胞活性，而给予洛美他派预处理可以显著改善糖氧剥夺导致的细胞活性抑制；进一步从动物实验结果可以看出假手术组小鼠并未表现出任何异常症状，模型组小鼠出现脑组织丢失、神经功能受损，而在给予洛美他派后可以显著降低小鼠脑组织萎缩程度，提高小鼠神经功能评分；表明洛美他派对脑卒中特别是缺血性脑卒中导致的神经损伤具有优异的治疗作用。
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