一种防止和/或延缓口腔白斑病癌变的核苷水凝胶及其制备方法及用途
阅读说明：本技术 一种防止和/或延缓口腔白斑病癌变的核苷水凝胶及其制备方法及用途 (Nucleoside hydrogel for preventing and/or delaying oral leukoplakia canceration and preparation method and application thereof ) 是由 赵行 丁婷婷 但红霞 曾昕 陈谦明 于 2021-10-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种防止和/或延缓口腔白斑病癌变的核苷水凝胶及其制备方法及用途,属于医药技术领域。该核苷水凝胶是由原料鸟嘌呤核苷、硼酸盐、碱金属离子和单宁酸在溶剂中交联而成。本发明基于DG和TA,通过硼酸二酯键成功构建了集载体与药效为一体的DG-TA水凝胶。该水凝胶具有良好的氧化特性,能够有效防止和/或延缓口腔白斑病癌变,效果优异。同时,该水凝胶具有优异的体内降解性能、良好的可注射性能,以及优异的皮肤黏附性能；不仅可以注射给药,同时还可以通过涂抹的方式给药,用药更加安全,效果更加优异。此外,该水凝胶制备简单,具有良好的应用前景。(The invention provides a nucleoside hydrogel for preventing and/or delaying oral leukoplakia canceration and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of medicines. The nucleoside hydrogel is formed by cross-linking raw materials of guanosine, borate, alkali metal ions and tannic acid in a solvent. The DG-TA hydrogel integrating the carrier and the drug effect is successfully constructed on the basis of DG and TA through a boric acid diester bond. The hydrogel has good oxidation characteristic, can effectively prevent and/or delay oral leukoplakia canceration, and has excellent effect. Meanwhile, the hydrogel has excellent in-vivo degradation performance, good injectability and excellent skin adhesion performance; not only can inject and administer, but also can administer by smearing mode simultaneously, and the medicine is safer to use, and the effect is more excellent. In addition, the hydrogel is simple to prepare and has a good application prospect.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种防止和/或延缓口腔白斑病癌变的核苷水凝胶及其制备方法及用途。
背景技术
口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤。尽管近年来恶性肿瘤的诊断和治疗取得了重要进展，但OSCC患者的预后并没有明显改善。OSCC通常始于一种或多种预先存在的疾病，即所谓的口腔潜在恶性疾患(OPMDs)。因此，将OSCC治疗的重点转移到OPMD阶段应该会大大提高患者的生活质量。口腔白斑病(OLK)是OPMDs中最常见、最具代表性的一种，OLK微环境与肿瘤中的环境相似，是一种高氧化应激环境。OLK具有较高的癌变风险。
对于OLK，目前尚无标准干预方法。尽管鉴于OLK位于口腔表面部位，局部化学药物预防其癌变是一种重要的治疗选择，但其在临床研究中的给药如维生素AD滴剂、维A酸等多为软膏或糊剂，缺乏黏附性，在口腔内存留时间较短，且效果有限。探究一种效果好、在口腔内存留时间长、针对局部高活性氧微环境的新型抗氧化剂，对延缓OLK癌变、预防癌症发生具有重大临床意义。
专利CN111557948A公开了一种防止或延缓口腔黏膜潜在恶性疾患癌变的核苷水凝胶。该水凝胶由异鸟嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷和硼酸盐溶于去离子水后交联而成，能够有效抑制人口腔黏膜癌前病变细胞增殖，延缓口腔白斑病癌变。但是，该核苷水凝胶缺乏黏附性及靶向性，注射方式可能会导致舌部二次伤害，凝胶在降解前可能阻碍局部血流造成局部供血不足及影响进食。
因此，研究一种黏附性好，同时具有靶向性，使用方便，二次伤害小的防止或延缓口腔黏膜潜在恶性疾患癌变的药物具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种防止和/或延缓口腔白斑病癌变的核苷水凝胶及其制备方法及用途。
本发明提供了一种核苷水凝胶，它是由原料鸟嘌呤核苷、硼酸盐、碱金属离子和单宁酸在溶剂中交联而成。
进一步地，所述鸟嘌呤核苷、硼酸盐、碱金属离子和单宁酸的摩尔比为(5～20)：(5～20)：(5～20)：1。
进一步地，所述鸟嘌呤核苷、硼酸盐、碱金属离子和单宁酸的摩尔比为10：10：10：1。
进一步地，所述鸟嘌呤核苷的浓度为1～2％w/v。
进一步地，所述鸟嘌呤核苷的浓度为1.4％w/v。
进一步地，所述鸟嘌呤核苷为D构型的鸟嘌呤核苷，结构式如下：
进一步地，所述硼酸盐为对苯二硼酸或硼酸；
和/或，所述碱金属离子选自KOH、LiOH、NaOH、RbOH或CsOH；
和/或，所述溶剂为去离子水。
本发明还提供了前述的核苷水凝胶的制备方法，它包括如下步骤：
将鸟嘌呤核苷、硼酸盐、碱金属离子、单宁酸加热溶于去离子水中，冷却后即得。
进一步地，前述的制备方法包括如下步骤：
(1)配制鸟嘌呤核苷水溶液；
(2)在鸟嘌呤核苷水溶液中加入硼酸盐和碱金属离子，加热溶解；
(3)在步骤(2)得到的溶液中加入单宁酸，加热溶解；
(4)将溶液冷却，即得水凝胶。
本发明还提供了前述的核苷水凝胶在制备防止和/或延缓口腔白斑病癌变的药物中的用途。
防止口腔白斑病癌变的含义为预防口腔白斑病癌变，避免口腔白斑病癌变发生。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明基于DG和TA，通过硼酸二酯键成功构建了集载体与药效为一体的DG-TA水凝胶。该水凝胶具有良好的氧化特性，能够有效防止和/或延缓口腔白斑病癌变，效果优异。同时，该水凝胶具有优异的体内降解性能、良好的可注射性能，以及优异的皮肤黏附性能；不仅可以注射给药，同时还可以通过涂抹的方式给药，用药更加安全，效果更加优异。此外，该水凝胶制备简单，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为核苷水凝胶(DG-TA水凝胶)的制备过程示意图。
图2为本发明核苷水凝胶的流变学性能、宏观成胶结果以及可注射结果。
图3为DG-TA水凝胶的体外黏附性及抗氧化特性：A为体外黏附性；B为抗氧化特性，*表示p＜0.05。
图4为OLK模型的建立及用药后组织病理学分析：A为模型建立流程；B为用药后各组舌背宏观结果；C为各组缓解率结果。
具体实施方式
本发明核苷水凝胶(DG-TA水凝胶)的制备过程如图1所示。
DG核苷为D构型的鸟嘌呤核苷，结构式如下：
实施例1、核苷水凝胶的制备
首先配制浓度为1.4％w/v的DG核苷水溶液，然后加入对苯二硼酸(PBA)及浓度为0.5M的KOH溶液，其中DG核苷、对苯二硼酸和KOH的摩尔当量为1:1:1，加热至充分溶解后得到澄清透明的液体。向澄清透明的液体中加入DG核苷1/10摩尔当量的单宁酸(TA)，加热至充分溶解，室温下溶液自然逐渐冷却后得到透明黄色的DG-TA水凝胶。
实施例2、核苷水凝胶的制备
首先配制浓度为1.4％w/v的DG核苷水溶液，然后加入对苯二硼酸(PBA)及浓度为0.5M的KOH溶液，其中DG核苷、对苯二硼酸和KOH的摩尔当量为1:1:1，加热至充分溶解后得到澄清透明的液体。向澄清透明的液体中加入DG核苷1/5摩尔当量的单宁酸(TA)，加热至充分溶解，室温下溶液自然逐渐冷却后得到透明黄色的DG-TA水凝胶。
实施例3、核苷水凝胶的制备
首先配制浓度为1.4％w/v的DG核苷水溶液，然后加入对苯二硼酸(PBA)及浓度为0.5M的KOH溶液，其中DG核苷、对苯二硼酸和KOH的摩尔当量为1:1:1，加热至充分溶解后得到澄清透明的液体。向澄清透明的液体中加入DG核苷1/15摩尔当量的单宁酸(TA)，加热至充分溶解，室温下溶液自然逐渐冷却后得到透明黄色的DG-TA水凝胶。
实施例4、核苷水凝胶的制备
首先配制浓度为1.4％w/v的DG核苷水溶液，然后加入对苯二硼酸(PBA)及浓度为0.5M的KOH溶液，其中DG核苷、对苯二硼酸和KOH的摩尔当量为1:1:1，加热至充分溶解后得到澄清透明的液体。向澄清透明的液体中加入DG核苷1/20摩尔当量的单宁酸(TA)，加热至充分溶解，室温下溶液自然逐渐冷却后得到透明黄色的DG-TA水凝胶。
实施例5、核苷水凝胶的制备
首先配制浓度为2％w/v的DG核苷水溶液，然后加入对苯二硼酸(PBA)及浓度为0.5M的KOH溶液，其中DG核苷、对苯二硼酸和KOH的摩尔当量为1:1:1，加热至充分溶解后得到澄清透明的液体。向澄清透明的液体中加入DG核苷1/10摩尔当量的单宁酸(TA)，加热至充分溶解，室温下溶液自然逐渐冷却后得到透明黄色的DG-TA水凝胶。
实施例6、核苷水凝胶的制备
首先配制浓度为2％w/v的DG核苷水溶液，然后加入对苯二硼酸(PBA)及浓度为0.5M的KOH溶液，其中DG核苷、对苯二硼酸和KOH的摩尔当量为1:1:1，加热至充分溶解后得到澄清透明的液体。向澄清透明的液体中加入DG核苷1/5摩尔当量的单宁酸(TA)，加热至充分溶解，室温下溶液自然逐渐冷却后得到透明黄色的DG-TA水凝胶。
实施例7、核苷水凝胶的制备
首先配制浓度为2％w/v的DG核苷水溶液，然后加入对苯二硼酸(PBA)及浓度为0.5M的KOH溶液，其中DG核苷、对苯二硼酸和KOH的摩尔当量为1:1:1，加热至充分溶解后得到澄清透明的液体。向澄清透明的液体中加入DG核苷1/15摩尔当量的单宁酸(TA)，加热至充分溶解，室温下溶液自然逐渐冷却后得到透明黄色的DG-TA水凝胶。
实施例8、核苷水凝胶的制备
首先配制浓度为2％w/v的DG核苷水溶液，然后加入对苯二硼酸(PBA)及浓度为0.5M的KOH溶液，其中DG核苷、对苯二硼酸和KOH的摩尔当量为1:1:1，加热至充分溶解后得到澄清透明的液体。向澄清透明的液体中加入DG核苷1/20摩尔当量的单宁酸(TA)，加热至充分溶解，室温下溶液自然逐渐冷却后得到透明黄色的DG-TA水凝胶。
实施例1～8中对苯二硼酸(PBA)可替换为硼酸；KOH可替换为LiOH、NaOH、RbOH或CsOH。
以下通过具体实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、核苷水凝胶的体内应用潜能研究
1、实验方法
将实施例1制备的核苷水凝胶通过流变学实验研究其剪切稀化特性；成胶后利用小瓶倒置试验验证核苷水凝胶是否形成，即在室温下将装载水凝胶的小瓶倒置，若未观察到样品流动，即可确定水凝胶形成；同时，通过体外可视化的注射实验研究该凝胶的可注射性。
2、实验结果
如图2所示：本发明成功通过硼酸二酯键建立了DG-TA水凝胶，该DG-TA水凝胶具有随剪切率增大而黏度降低的特性，即剪切稀化特性。利用小瓶倒置试验证实凝胶成功形成。体外通过可视化的注射实验证明了该凝胶可以注射应用于局部，且注射后能继续保持凝胶状态。
上述结果说明：本发明制备的核苷水凝胶具有良好的可注射性能，具有体内应用潜能。
实验例2、核苷水凝胶的体外黏附性及抗氧化特性
1、实验方法
从雄性BALB/cJ Gpt小鼠获得新鲜背部皮肤组织，将实施例1制备的水凝胶(DG-TA水凝胶)注射到皮肤上(10点，20μL/点)，以DG水凝胶为对照。将皮肤固定并浸入聚苯乙烯盒中的磷酸盐缓冲液中，同时在37℃以100转/分钟振荡。在特定时间间隔记录DG-TA水凝胶和DG水凝胶在体外皮肤上的保留率，以表征其黏附特性。
抗氧化特性的实验方法：DG-TA水凝胶的总抗氧化活性使用三价铁还原/抗氧化能力(FRAP)检测试剂盒(Abcam)测定样品被添加到FRAP工作液中，在96孔板中常温(22℃)静置反应0.5h，然后在酶标仪中测量593nm处的吸光度。标准曲线是用不同浓度的FeSO4溶液制作，然后用于校准每个样品的抗氧化活性。
DG水凝胶的制备方法如下：首先配制浓度为1.4％w/v的DG核苷水溶液，然后加入对苯二硼酸(PBA)及浓度为0.5M的KOH溶液，其中DG核苷、对苯二硼酸和KOH的摩尔当量为1:1:1，加热至充分溶解后得到澄清透明的液体，室温下溶液自然逐渐冷却后得到DG水凝胶。
2、实验结果
如图3A所示：TA的引入显著增强了水凝胶的黏附性，DG-TA水凝胶在皮肤表面可保持长达12小时以上的黏附性；即DG-TA水凝胶在皮肤表面黏附直至12小时，仍然显示较好的黏附性。而未引入TA的DG水凝胶在皮肤表面黏附2.5小时后，黏附性开始下降，部分凝胶脱落，7.5小时后实验中所有凝胶全部脱落。
铁离子还原/抗氧化能力法测定水凝胶各组分的抗氧化性能。结果如图3B所示：原料DG、PBA、KOH均无抗氧化性能，使用DG制备得到的核苷水凝胶也无抗氧化性能；而原料TA具有显著的抗氧化性能，可见DG-TA水凝胶的抗氧化性能是来源于TA的引入。且将DG-TA水凝胶在体外放置10天后，其抗氧化性能未见明显损失。
上述实验结果说明：本发明制备的DG-TA水凝胶在皮肤表面的黏附性能以及抗氧化性能均显著优于DG水凝胶。
实验例3、核苷水凝胶体内防止OLK癌变的研究
1、实验方法
OLK模型是通过用含有100μg/mL 4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)的饮用水喂养C57小鼠来生成的。每周将小鼠置于异氟醚吸入麻醉下以检查小鼠的口腔黏膜。在喂养第12周时，所有小鼠的舌背都出现了白色病变。取一只小鼠进行舌组织病理学分析，证实OLK模型成功建立。
随后，将小鼠随机分组(n＝7)：
对照组(Control)：模型组，不给药治疗。
TA注射组：每周在口腔白斑处多点注射一次TA，每次TA的给药剂量为8.5mg/kg；
DG水凝胶注射组：每周在口腔白斑处多点注射一次DG水凝胶，每次DG水凝胶的DG给药剂量为14mg/kg(与DG-TA水凝胶给药组中的DG剂量保持一致)；
DG-TA水凝胶注射组：每周在口腔白斑处多点注射一次DG-TA水凝胶，每次DG-TA水凝胶中TA的给药剂量为8.5mg/kg；
DG-TA水凝胶涂抹组：每天在口腔白斑处涂抹一次DG-TA水凝胶，每次DG-TA水凝胶中TA的给药剂量为8.5mg/kg。
给药6周后进行H&E组织学检查，确定舌病变的发展情况，病变分为无异常增生、异常增生(轻度、轻度-中度、中度、中-重度、重度)和OSCC(口腔鳞状细胞癌)。口腔黏膜癌变的过程就是正常上皮-轻度异常增生—中度异常增生—重度异常增生—口腔癌。轻度异常增生为口腔白斑早期病变，随着异常增生越严重，口腔白斑逐渐进入晚期病变，最终导致白斑癌变。因此延缓口腔白斑的异常增生，可以有效延缓白斑癌变。
HE显示：实验中所有小鼠造模后均呈现轻度及以上异常增生，将轻度异常增生的OLK比例记作缓解率(Response rate，％)。缓解率越大说明处于早期的病变(轻度异常增生)小鼠比例越多，进一步说明延缓白斑癌变进程的效果更好。
缓解率(％)＝轻度异常增生小鼠只数(n1)/总小鼠只数(n)*100％
2、实验结果
实验结果见图4：可知与模型组一样，单独注射DG水凝胶或TA的缓解率均为0％，说明单独注射DG水凝胶或TA后小鼠口腔白斑全部出现轻度以上异常增生，单独注射DG水凝胶或TA对口腔白斑异常增生无缓解作用，进一步说明单独注射DG水凝胶或TA对口腔白斑癌变无延缓作用。而本发明制备得到的DG-TA水凝胶无论是注射给药还是涂抹给药，均能有效缓解小鼠口腔白斑异常增生，说明本发明制备得到的DG-TA水凝胶对口腔白斑癌变有显著的延缓作用。其中，本发明制备得到的DG-TA水凝胶注射给药的缓解率为20％，涂抹给药的缓解率为42.8％，说明涂抹给药对口腔白斑癌变的延缓作用更优。此外，研究发现DG-TA水凝胶采用注射方式给药导致28％的小鼠死亡，这可能是因为凝胶注射在局部阻塞了舌头的血流，影响了小鼠的进食；而DG-TA水凝胶涂抹组小鼠未出现明显消瘦或死亡。可见DG-TA水凝胶采用涂抹方式更能有效延缓口腔白斑癌变，且安全性更好。
上述结果表明基于DG和TA制备的DG-TA水凝胶具有防止OLK恶变的潜力，且可以采用安全性更好的涂抹方式治疗。
综上，本发明基于DG和TA，通过硼酸二酯键成功构建了集载体与药效为一体的DG-TA水凝胶。该水凝胶具有良好的抗氧化特性，能够有效防止和/或延缓口腔白斑病癌变，效果优异。同时，该水凝胶具有优异的体内降解性能、良好的可注射性能，以及优异的皮肤黏附性能；不仅可以注射给药，同时还可以通过涂抹的方式给药，用药更加安全，效果更加优异。此外，该水凝胶制备简单，具有良好的应用前景。
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