一类化合物促皮肤损伤修复的用途
阅读说明：本技术 一类化合物促皮肤损伤修复的用途 (Application of compound in promoting skin injury repair ) 是由 李英杰 骆衍新 白亮亮 蔡都 王小琳 禹汇川 唐冠楠 黄美近 汪建平 于 2020-06-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及聚醚化合物在在制备促皮肤修复和/或再生药物或药物组合物中的用途。本发明证实,包括莫能霉素(Monensin A)、南昌霉素(Nanchangmycin)、拉沙里菌素(Lasalocid A)、尼日利亚菌素(Negericin)、沙利霉素(Salinomycin)、马杜拉霉素(Maduramycin)、甲基盐霉素(Narasin)在内的聚醚化合物体外能显著促进人表皮角质细胞和人胚肾上皮细胞的增殖。其中,莫能霉素(Monensin A)还能明显促进小鼠表皮成纤维细胞的增殖,并在BALB/C小鼠以及糖尿病和肥胖模型小鼠皮肤损伤模型中显著促进损伤愈合,疗效优于相同浓度的人重组EGF。(The invention relates to an application of polyether compound in preparing a medicine or a pharmaceutical composition for promoting skin repair and/or regeneration. The invention proves that polyether compounds including Monensin (Monensin A), nanchanmycin (Nanchangmycin), Lasalocid (Lasalocid A), nigericin (Negericin), Salinomycin (Salinomycin), Maduramycin (Maduramycin) and Narasin (Narasin) can remarkably promote the proliferation of human epidermal keratinocytes and human embryonic kidney epithelial cells in addition. Wherein, the Monensin A can also obviously promote the proliferation of epidermal fibroblasts of mice, and obviously promote the injury healing in BALB/C mice and mice skin injury models of diabetes and obesity models, and the curative effect is better than that of human recombinant EGF with the same concentration.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及聚醚化合物在促上皮组织修复和/或再生方面的用途。
发明背景
人体皮肤面积大，且直接和外界接触，是最容易受到外界侵害的器官。皮肤创伤的正常愈合是维持机体稳态至关重要，若愈合异常，如大面积创伤或烧伤、慢性疾病导致的慢性创伤面愈合困难、药物性创面愈合缓慢、以及感染导致的创面愈合受阻等，不仅会造成皮肤结构和功能的缺失，其所带来的疼痛和美观破坏往往对患者造成沉重的心理负担，严重影响患者的身心健康。促进急性和慢性皮肤伤口的愈合达到组织功能的最大恢复，是目前研究的主要关注点之一。
重组细胞因子和多肽是治疗皮肤损伤的常用生物制剂。临床上，我国Ⅰ类新药重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)临床上应用于创伤、烧烫伤的治疗；另一创伤治疗的临床药物—康复新，其主要成分为美洲大蠊的活性多肽。另外，一些已申请发明专利的短片段皮肤修复肽，如蜥蜴来源的多肽Tylotoin、无指盘臭蛙中分离的修复多肽AH90和CW49、以及靶向成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的小分子重塑肽等，均具有皮肤损伤修复的疗效。然而，多肽和重组蛋白治疗皮肤损伤面临挑战：1)通过基因工程或工业合成方法制备蛋白或多肽，制备成本高；2)蛋白和多肽分子量大，不稳定，需较为苛刻的运输条件；3)在体内容易被水解酶水解，疗效不稳定。相比而言，小分子化合物则具有天然的优势：1)分子量小，不易降解；2)制备成本低；3)可在体内持续作用等。到目前为止，还没有小分子化合物用于皮肤创伤的临床治疗。寻求能增强皮肤内源性再生能力的先导化合物成为社会的巨大需求。
聚醚类化合物是一类含有一个羧酸基团以及多个五元或六元醚环的聚醚多酮类化合物。莫能霉素(Monensin A)、南昌霉素(Nanchangmycin)、拉沙里菌素(Lasalocid A)、尼日利亚菌素(Negericin)、沙利霉素(Salinomycin)、甲基盐霉素(Narasin)、马杜拉霉素(Maduramycin)是这类化合物的代表，已经相继作为抗球虫和抗菌药物用于饲料添加剂，并能促进动物的生长发育。此类化合物可与金属阳离子结合，并能携带金属阳离子化合物穿过细胞膜进入细胞。其杀球虫作用机理主要是高亲和Na+离子，使大量Na+进入细胞，从而干扰球虫细胞Na+的正常渗透。此类化合物的制备主要是通过生物发酵法，利用生产菌的次级代谢作用合成，其提取和分离工艺成熟、制备成本低。
已有研究表明，细胞内Na+离子的提高在组织修复和再生中发挥重要作用。TsengAS等观察到爪蟾(Xenopus laevis)尾巴损伤部位Na+离子的累积，莫能霉素可通过提高细胞内Na+离子，显著促进爪蟾损伤尾巴的修复与再生[4]。然而，目前尚未有此类化合物应用于哺乳动物组织损伤修复治疗的报道，也未见相关专利申请。这类抗生素作用机制明确、毒副作用低、制备工艺成熟，但目前仅局限应用于畜牧业的饲料添加剂。进一步研究、开发此类化合物在组织修复与再生发面的应用，拓展其应用范围，将具有重要的意义。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
目前，聚醚化合物，尤其是聚醚类抗生素被报道的应用主要有以下几点：1)在畜牧业上主要用于抗球虫病；2)增加至牲畜饲料，能够明显促生长，提高饲料利用率，控制疾病；3)抑制乳腺癌细胞活性；4)对疟原虫有杀灭作用。
一方面，本发明提供了聚醚化合物或其衍生物、其螯合形式、水合形式或其药学上可接受的盐或酯在制备促上皮组织修复和/或再生药物或药物组合物中的用途。
在一些实施方案中，所述聚醚化合物包含2-12个醚氧原子和1个一元有机酸基。
在一些实施方案中，包含2-10个醚氧原子。
在一些实施方案中，包含2-8个醚氧原子。
在一些实施方案中，包含2-7个醚氧原子。
在一些实施方案中，包含2-6个醚氧原子。
在一些实施方案中，包含2-5个醚氧原子。
在一些实施方案中，包含2个醚氧原子。
在一些实施方案中，所述聚醚化合物包含环醚结构。
在一些实施方案中，包括至少1个四氢呋喃和/或1个四氢吡喃基团。
在一些实施方案中，包括至少1个四氢呋喃基团和1个四氢吡喃基团。
在一些实施方案中，所述四氢呋喃基团和四氢吡喃基团通过碳碳单键直接连接。
在一些实施方案中，所述四氢呋喃基团和四氢吡喃基团其中任意一个以2号位的碳与另外一个基团连接。
在一些实施方案中，所述四氢呋喃基团和四氢吡喃基团均以2号位的碳彼此连接。
在一些实施方案中，所述聚醚化合物为式I、式II、式III、式IV、式V、式VI或式VII结构中的至少一种，
其中R101至R139、R201至R251、R301至R333、R401至R445、R501至R543、R601至R643、R701至R753各自独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、羟基、甲氧基、羟甲基、羟基或卤素中的一种或多种。
在一些实施方案中，X选自氢、甲基、乙基、丙基中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述聚醚化合物选自莫能霉素(Monensin A)、南昌霉素(Nanchangmycin)、拉沙里菌素(Lasalocid A)、尼日利亚菌素(Negericin)、沙利霉素(Salinomycin)、甲基盐霉素(Narasin)马杜拉霉素(Maduramycin)中的至少一种。
在一些实施方案中，所述所述莫能霉素(Monensin A)、南昌霉素(Nanchangmycin)、拉沙里菌素(Lasalocid A)、尼日利亚菌素(Negericin)、沙利霉素(Salinomycin)、甲基盐霉素(Narasin)、马杜拉霉素(Maduramycin)分别具有以下结构式：
哺乳动物皮肤的表皮是一个连续的、多层次的上皮，其再生能力强。在生理状态下，表皮不断衰老和脱落，同时不断有基底细胞分裂、增生和分化进行替代[1]。因此，皮肤拥有一套精密、复杂、有序的机制来保护自身并在受损时恢复组织完整性，是多种细胞和细胞因子共同协调完成的过程[2]。皮肤损伤修复的过程可分为四个阶段：止血→炎症→表皮组织再生→表皮重塑。其中，表皮组织再生是整套修复机制中最重要的一个阶段。在这一阶段，新生的毛细血管萌芽处由成纤维细胞组成的肉芽组织从伤口边缘和底部长出，并向缺损中央及表面伸展，填满凹陷的伤口，成为后期角质形成细胞(keratinocytes)迁移的新基底。随后，基底的角质形成细胞开始增生，在凝块下面从伤口边缘向伤口中心迁移，在肉芽组织上形成单层上皮细胞，并最终增生、分化成为鳞状上皮。期间，伤口周边和骨髓来源的成纤维细胞被巨噬细胞活化，分泌胶原，形成伤疤；其中一部分成纤维细胞分化成肌成纤维细胞，促进伤口边缘缩合。实际上，表皮自我更新、修复的能力主要由基底的干细胞维持。表皮干细胞拥有强大的自我更新能力，通过不对称分裂完成自我更新，同时形成一个新的子代细胞—短暂扩增细胞。短暂扩增细胞继续分裂、扩增、上移从而形成其他各细胞层，如刺细胞层、颗粒细胞层等[1]。在创伤修复过程中，参与修复的细胞分泌多种细胞因子，包括EGF、TGF-β、FGF和VEGF等，这些细胞因子反过来调节细胞的增殖、迁移和分化[3]。然而，皮肤伤口常因组织缺损严重或修复机制不全而愈合困难。针对这一问题，除了预防创面感染，目前缺乏有效的临床治疗手段。寻找皮肤损伤修复的关键靶标，阐明修复机制，有利于我们找到安全、有效的皮肤损伤治疗方案。
在本发明的一个实施例中，证实了聚醚化合物莫能霉素(Monensin A)、南昌霉素(Nanchangmycin)、拉沙里菌素(Lasalocid A)、尼日利亚菌素(Negericin)、沙利霉素(Salinomycin)、甲基盐霉素(Narasin)、马杜拉霉素(Maduramycin)能显著促进人表皮角质形成细胞(HACAT)和人胚肾上皮细胞(HEK293)细胞的增殖，并呈剂量依赖性关系。
在本发明的一个实施例中，证实了莫能霉素(Monensin A)对小鼠表皮成纤维细胞(MDF)有显著的促增殖作用，并呈剂量依赖性关系。
在一些实施方案中，所述聚醚化合物为合成的或从微生物发酵液中提取分离得到的。
在一些实施方案中，所述聚醚化合物的使用浓度为1-1000nM。
在一些实施方案中，所述促上皮组织修复和/或再生包括促皮肤伤口或瘢痕的修复和/或再生。
在一些实施方案中，所述皮肤伤口选自创伤、烧烫伤、溃疡。
在一些实施方案中，所述创伤选自切除伤口、切割、刺伤或穿刺伤口。
在一些实施方案中，所述药物或药物组合物配制为局部或经皮给药。
在一些实施方案中，所述药物或药物组合物配制为凝胶、喷雾剂、糊剂、膏剂、霜剂、洗剂、油膏、油、水溶液、悬浮液、分散液、贴片、胶粘剂、绷带、敷料、长效剂或储液囊。
附图说明
图1为在一些实施方案中，一些聚醚化合物的结构式，其中：图1A为莫能霉素(Monensin A)，图1B为南昌霉素(Nanchangmycin)，图1C为拉沙里菌素(Lasalocid A)，图1D为尼日利亚菌素(Negericin)，图1E为沙利霉素(Salinomycin)，图1F为甲基盐霉素(Narasin)，图1G为马杜拉霉素(Maduramycin)；
图2A和图2B分别显示莫能霉素(Monensin A)、南昌霉素(Nanchangmycin)、拉沙里菌素(Lasalocid A)、尼日利亚菌素(Negericin)、沙利霉素(Salinomycin)、马杜拉霉素(Maduramycin)和甲基盐霉素(Narasin)显著促进人表皮角质细胞(HACAT)和人胚肾上皮细胞(HEK293)的增殖；
图3显示莫能霉素(Monensin A)显著促进小鼠表皮成纤维细胞(MDF)的增殖；
图4A显示第0-14天莫能霉素(Monensin A)和EGF促BALB/C小鼠皮肤损伤愈合作用代表性图片，图4B显示各组小鼠伤口面积的定量结果；
图5A显示第0天、第16天、第24天莫能霉素(Monensin A)和EGF促BSK-Leprem2Cd479/Gpt小鼠皮肤损伤愈合作用代表性图片，图5B显示各组小鼠伤口面积的定量结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明在体外细胞和小鼠动物模型上试验，其试验方案为常规方法。
实施例1在人表皮角质细胞(HACAT)和人胚肾上皮细胞(HEK293)上评价7个聚醚化合物体外促细胞增殖活性
取处于对数生长的HACAT和HEK293细胞接种于96孔板，每孔5000个细胞，待细胞完全贴壁后按照表1的浓度加入聚醚化合物培养3天。往细胞培养板中加入20μL/孔的MTS检测试液，37℃孵育4小时。使用酶标仪，于490nm波长处检测吸光度(OD值)。相对细胞存活率(relative cell viability)＝(OD加药组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)*100％。
表1不同细胞中加入的聚醚化合物的浓度(单位：nM)
结果如图2所示，莫能霉素(Monensin A)、南昌霉素(Nanchangmycin)、拉沙里菌素(Lasalocid A)、尼日利亚菌素(Negericin)、沙利霉素(Salinomycin)、马杜拉霉素(Maduramycin)、甲基盐霉素(Narasin)对HACAT和HEK293细胞的促增殖作用，并呈剂量依赖效应，剂量范围在1-1000nM之间。
实施例2莫能霉素(Monensin A)对小鼠表皮成纤维细胞(MDF)的促增殖作用
取处于对数生长的小鼠表皮成纤维细胞(MDF)接种于96孔板，每孔5000个细胞，待细胞完全贴壁后加入含不同浓度莫能霉素(Monensin A)培养3天。使用MTS法检测细胞活力，计算相对细胞存活率(relative cell viability)。
结果如图3所示，莫能霉素(Monensin A)能显著促进MDF细胞的增殖，并呈剂量依赖性关系。莫能霉素(Monensin A)促进MDF的最佳浓度在1-2nM之间。
实施例3莫能霉素(Monensin A)对BALB/C小鼠皮肤损伤模型的修复作用
BALB/C小鼠(雌性，6-8周龄，体重20-25g)经麻醉后，小鼠背部剃毛，使用脱毛膏脱毛干净。使用6mm口径活检打孔器在小鼠背部打孔，以10mm孔径硅胶片为参照，数码相机记录伤口。小鼠随机分为4组，分别为生理盐水组(Vehicle)、Monensin A高剂量组(MonensinA250nM)、Monensin A低剂量组(Monensin A125nM)和人重组EGF(Epidermal GrowthFactor)组(EGF 250nM)。每两天给药一次，连续给药7次，每次20μL，每次使用数码相机以10mm孔径硅胶片为参照记录伤口。给药后，伤口使用3M医用透明贴粘贴整个背部，防止伤口皮肤皱缩和药物外溢。使用Image J测量伤口和硅胶孔面积，计算伤口相对面积和伤口面积相对值。伤口相对面积＝伤口面积/硅胶孔面积*100％；伤口面积相对值(relative areaof wound)＝第N天伤口相对面积/第0天伤口相对面积*100％。
结果如图4所示，莫能霉素(Monensin A)可显著促进皮肤伤口愈合，呈剂量依赖性。莫能霉素(Monensin A)在伤口愈合的第6天开始显现显著效果，且在第8-14天的疗效优于同浓度的EGF。
实施例4莫能霉素(Monensin A)促进BSK-Leprem2Cd479/Gpt小鼠皮肤损伤修复
BSK-Leprem2Cd479/Gpt小鼠(雌性，6-8周龄，体重40-55g)经麻醉后，小鼠背部剃毛，使用脱毛膏脱毛干净。用6mm口径活检打孔器在小鼠背部打孔，使用数码相机以10mm孔径硅胶片为参照记录伤口。小鼠随机分为4组，分别为生理盐水组(Vehicle)、Monensin A高剂量组(Monensin A250nM)、Monensin A低剂量组(Monensin A125nM)和EGF组(EGF250nM)。每4天给药一次，连续给药7次，每次20μL，并拍照记录创面。给药后，伤口使用3M医用透明贴粘贴整个背部，防止伤口皮肤皱缩和药物外溢。使用Image J测量伤口和硅胶孔面积，计算伤口相对面积和伤口面积相对值。伤口相对面积＝伤口面积/硅胶孔面积*100％；伤口面积相对值(relative area of wound)＝第N天伤口相对面积/第0天伤口相对面积*100％。
结果如图5所示，从第16天开始，莫能霉素(Monensin A)可显著促进BSK-Leprem2Cd479/Gpt小鼠皮肤伤口愈合，呈剂量依赖性。EGF在伤口愈合的第16-28天显现显著效果。莫能霉素(Monensin A)疗效与同浓度的EGF相当。
参考文献
1.Gonzales K A U,Fuchs E.Skin and Its Regenerative Powers:An Alliancebetween Stem Cells and Their Niche[J].Developmental Cell,2017,43(4):387-401.
2.Geoffrey C.Gurtner,Sabine Werner,Yann Barrandon,et al.Wound repairand regeneration[J].Nature,2008,453(7193):314-321.
3.Sun B K,Siprashvili Z,Khavari P A.Advances in skin grafting andtreatment of cutaneous wounds[J].Science,2014,346(6212):941-945.
4.A.-S,Tseng,W,et al.Induction of Vertebrate Regeneration by aTransient Sodium Current[J].Journal of Neuroscience,2010,30(39):13192-13200.
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