一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物、制备方法、鲜虾光动力杀菌保鲜方法
阅读说明：本技术 一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物、制备方法、鲜虾光动力杀菌保鲜方法 (Curcumin derivative with high photosensitive bactericidal activity, preparation method and fresh shrimp photodynamic sterilization and preservation method ) 是由 焦龙 张宾 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及水产品加工及贮藏领域,为了克服现有的保鲜效果差、现有的保鲜技术安全性不可控、会破坏造成质地和风味的不足,公开一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物、制备方法、鲜虾光动力杀菌保鲜方法。通过在姜黄素酚羟基结构上引入含有氮氧自由基的取代基,可以提高姜黄素衍生物的光敏特性,在一定条件下提高生成具有细胞毒性的活性氧(ROS)的能力,进而造成细菌细胞广泛氧化性损伤。并且,生成活性氧仅需LED灯辐照即可完成,杀菌保鲜过程简单易操作,安全无污染,还能延长虾类的保鲜时长,保鲜效果优良,具有很强的实用价值。(The invention relates to the field of processing and storing of aquatic products, and discloses a curcumin derivative with high photosensitive bactericidal activity, a preparation method and a fresh shrimp photodynamic sterilization and preservation method in order to overcome the defects that the existing preservation effect is poor, the safety of the existing preservation technology is uncontrollable, and the texture and flavor can be damaged. By introducing a substituent containing a nitroxide free radical into a phenolic hydroxyl structure of curcumin, the photosensitive characteristic of the curcumin derivative can be improved, the ability of generating Reactive Oxygen Species (ROS) with cytotoxicity is improved under certain conditions, and further extensive oxidative damage to bacterial cells is caused. And the active oxygen generation can be completed only by the irradiation of the LED lamp, the sterilization and preservation process is simple and easy to operate, the safety and the pollution are avoided, the preservation time of the shrimps can be prolonged, the preservation effect is excellent, and the practical value is very high.)
技术领域
本发明涉及水产品加工及贮藏领域，尤其是一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物、制备方法、鲜虾光动力杀菌保鲜方法。
背景技术
光动力杀菌是一种新型冷杀菌技术，具有无毒、无耐药性等优势。光敏剂经可见光照射后，产生具有细胞毒性的活性氧(ROS)，进而造成细菌细胞广泛氧化性损伤。目前，水产品杀菌方法主要包括：传统热处理杀菌技术，辐照、低温等离子体等冷杀菌技术，而基于高光敏杀菌性能的姜黄素类衍生物的制备及其在鲜虾保鲜中的应用尚未见报道。
传统热处理杀菌技术会破坏水产品的营养物质、造成质地和风味的负面变化；利用放射性同位素发出的γ射线、电子加速器产生的电子束或X射线的辐照保鲜技术，其安全性仍存在争议；低温等离子体产生的自由基等高氧活性粒子，接触水产品后可能会产生有毒化合物。
天然光敏剂姜黄素虽然具有光敏抗菌活性，但其ROS产率低而导致光动力杀菌效果较差，因此难以满足水产品光动力保鲜的实际应用。
中国专利公开号CN104082394B，公开了一种鲜虾的保鲜方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)鲜虾预处理：将鲜虾用水洗净后，沥干至鲜虾表面无水分；(2)复合成膜液制备：以复合成膜液的总质量为基准，按1.5～2％壳聚糖，1～1.5％醋酸，1～3％月桂酸，10～15％山梨糖醇，1～1.5％酪蛋白酸钠，0.3～0.5％聚丙烯酸钠，0.5～1％植酸，20～30％生姜水，余量为大蒜水的配比依次称量各组分后，先将醋酸、生姜水与大蒜水混合均匀，再加入壳聚糖、月桂酸、山梨糖醇、酪蛋白酸钠、聚丙烯酸钠、植酸后进行超声分散，最后对料液进行抽滤后，于真空环境中静置10～15min；(3)浸泡成膜：将步骤(1)中鲜虾置于步骤(2)所得的复合成膜液中浸泡20～30min后取出进行冷风干燥；(4)包装贮藏：将步骤(3)中的鲜虾真空包装后进行冷藏。其不足之处在于，复合膜液对鲜虾的风味影响较大，特别是醋酸、生姜水、大蒜水等进入虾肉蛋白内，会对鲜虾的风味产生较大的影响，不利于广泛使用。
发明内容
本发明是为了克服现有技术保鲜效果差、现有的保鲜技术安全性不可控、会破坏造成质地和风味的不足，公开一种保鲜效果优良、安全性高、不会破坏造成质地和风味的一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物及其制备方法；
本发明的另一目的在于提供一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物的鲜虾光动力杀菌保鲜方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物，高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物的结构式如式Ⅰ所示：
其中，R含有至少一个氮氧自由基。
天然姜黄素是一种常用的食品添加剂，具有良好的抗炎、抗癌等特性，但其抗菌活性有限，无法满足在虾类保鲜中应用需求。通过在姜黄素酚羟基结构上引入含有氮氧自由基的取代基，可以提高姜黄素衍生物的光敏特性，在一定条件下提高生产具有细胞毒性的活性氧(ROS)的能力，进而造成细菌细胞广泛氧化性损伤。基于氮氧自由基基团的自由基-三重态对机制(RTPM)所产生的电子自旋-自旋相互作用(QP or DP-RTPM)，可提高衍生物的系间窜越效率，促进长寿命三重态的生成，进而获得增强的单线态氧(1O2)产率。因此，本发明的姜黄素衍生物可作为无毒的优良光敏剂，应用于虾类的高效光动力杀菌保鲜。
进一步的，R为2，2，5，5-四甲基吡咯-1-氧基自由基-3-甲酰氧基。
一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
在惰性气体保护条件下，将姜黄素和催化剂溶解于反应烧瓶中搅拌，加入缩合剂与含氮氧自由基的底物继续反应，反应结束后，分离得到所述高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物。
进一步的，含氮氧自由基的底物为含氮氧自由基的羧酸、酰卤、酸酐中的至少一种。当R为2，2，5，5-四甲基吡咯-1-氧基自由基-3-甲酰氧基时，对应的结构式分别如下：含氮氧自由基的羧酸：
含氮氧自由基的酸酐：
含氮氧自由基的酰卤：
其中X为卤族元素氟氯溴碘中的一种。
进一步的，反应体系各化合物摩尔比为姜黄素：含氮氧自由基的底物：催化剂：缩合剂＝1：2～3：1～3：1～3。
进一步的，催化剂为4-二甲氨基吡啶DMAP，缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC·HCl。
一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物的鲜虾光动力杀菌保鲜方法，包括以下步骤：
A.配制高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物水溶液，避光灌装；
B.使用生理盐水清洗鲜虾后，沥干表面水分；
C.将步骤A配制好的高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物水溶液喷洒于步骤B制得的鲜虾表面，避光静置；
D.将步骤C制得的鲜虾置于光源下进行辐照，完成光动力杀菌保鲜过程。
本发明的高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物，是一种无需腌制，无需γ射线或X射线辐照，仅通过LED灯光辐照即可释放单线态氧达到杀菌保鲜目的的保鲜剂。并且，在同虾类接触并释放单线态氧前后，不会产生有毒物质，基于姜黄素本身的抗菌性能，在单线态氧完全释放后，仍能保持一定的抗菌活性，缓解虾类的变质，保鲜效果优良。
进一步的，步骤A中，姜黄素衍生物水溶液浓度为10～40μM。
进一步的，步骤B中，步骤B中，避光静置的时间为5～30min。
进一步的，步骤D中，光源为光功率5～30W的蓝光LED矩阵光源，波长范围400～480nm，光动力辐照时间120～360s。
由于采用以上的技术方案，本发明具有这样的有益效果：通过在姜黄素结构上引入氮氧自由基，得到具有高光敏杀菌性能的姜黄素衍生物，提高了姜黄素衍生物的单线态氧产率，从而提高了抗菌活性，同时避免了造成质地和风味的破坏，又不至于生成有毒物质，提高了安全性，且将其应用于虾类保鲜，有效的延长了虾类保鲜时长，保鲜效果优良且保鲜方法简单易操作，无毒无污染，具有很强的实用价值。
附图说明
图1是本发明的具有高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物的合成反应方程式。
图2是本发明的姜黄素衍生物的质谱图。
图3是本发明的姜黄素衍生物的紫外吸收和荧光光谱图。
图4是对比例1的姜黄素衍生物的还原产物的合成反应方程式。
图5是对比例1的姜黄素衍生物的还原产物的质谱图。
图6是采用9，10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)吸光度衰减法评价单线态氧生成能力的原理图。
图7是采用9，10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)吸光度衰减法评价姜黄素、姜黄素衍生物、姜黄素衍生物还原产物的单线态氧生成能力的折线图。
图8是空白对照组、天然姜黄素对照组、姜黄素衍生物还原产物与姜黄素衍生物对南美白对虾的细菌生长抑制效果的折线图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
一种高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物，高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物的结构式如式Ⅰ所示：
其中，R含有至少一个氮氧自由基。
进一步的，上述式Ⅰ化合物由含氮氧自由基的羧酸、酸酐或酰卤中的一种与姜黄素在催化剂和缩合剂反应下得到；
进一步的，R为2，2，5，5-四甲基吡咯-1-氧基自由基-3-甲酰氧基；相应的，所述的羧酸、酸酐和酰卤的结构式如下所示。
羧酸：
酸酐：
酰卤：
其中X为卤族元素氟氯溴碘中的一种。
实施例1
具有高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物Ⅱ的合成，其中姜黄素衍生物II的结构式如下：
，反应方程式如图1所示。
在室温、N2保护条件下，将准确称取的1mmol姜黄素和3mmol的4-二甲氨基吡啶用15mL N，N-二甲基甲酰胺溶解于反应烧瓶中，常温搅拌1h，期间每20min加入1mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，最后加入用5mL的N，N-二甲基甲酰胺溶解的2mmol的3-羧基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧基自由基，继续搅拌反应12h。反应结束后，经萃取、柱层析纯化得到具有高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物Ⅱ，如图2所示，为姜黄素衍生物Ⅱ的质谱图；如图3所示，为5μmol/L姜黄素衍生物Ⅱ甲醇溶液的(A)紫外吸收和(B)荧光光谱。
实施例2
在室温、N2保护条件下，将准确称取的1mmol姜黄素和1mmol的4-二甲氨基吡啶用15mL N，N-二甲基甲酰胺溶解于反应烧瓶中，常温搅拌1h，期间每30min加入0.5mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，最后加入用5mL的N，N-二甲基甲酰胺溶解的3mmol的3-羧基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧基自由基，继续搅拌反应12h。反应结束后，经萃取、柱层析纯化得到具有高光敏杀菌活性的姜黄素衍生物Ⅱ。
实施例3
将实施例1的姜黄素衍生物Ⅱ，应用于鲜虾的光动力杀菌保鲜的方法，具体步骤如下：
1)配制10μM姜黄素衍生物Ⅱ水溶液，灌装于避光喷壶中；
2)选取鲜活完整、颜色鲜亮、大小均一的南美白对虾，将其浸入冰水中快速冻死后，使用无菌生理盐水洗净并沥干表面水分；
3)采用喷洒方式，将步骤1)配制好的姜黄素衍生物Ⅱ水溶液足量、均匀喷洒于步骤2)制得的鲜虾表面，避光静置5min；
4)将步骤3)制得的鲜虾置于光功率30W的蓝光LED矩阵下进行辐照120s，辐照波长为400nm，完成光动力杀菌保鲜过程。
实施例4
将实施例2的姜黄素衍生物Ⅱ，应用于鲜虾的光动力杀菌保鲜的方法，具体步骤如下：
1)配制40μM姜黄素衍生物Ⅱ水溶液，灌装于避光喷壶中；
2)选取鲜活完整、颜色鲜亮、大小均一的南美白对虾，将其浸入冰水中快速冻死后，使用无菌生理盐水洗净并沥干表面水分；
3)采用喷洒方式，将步骤1)配制好的姜黄素衍生物Ⅱ水溶液足量、均匀喷洒于步骤2)制得的鲜虾表面，避光静置30min；
4)将步骤3)制得的鲜虾置于光功率5W的蓝光LED矩阵下进行辐照360s，辐照波长为480nm，完成光动力杀菌保鲜过程。
对比例1
姜黄素衍生物Ⅱ的还原产物的制备方程式如图4所示，其制备过程如下：
将1mmol实施例1所得的姜黄素衍生物Ⅱ和3mmol抗坏血酸分散于5mL乙腈中，室温搅拌反应1h。反应结束后，反应液经萃取、柱层析纯化后，得到姜黄素衍生物Ⅱ的加氢还原产物，如图5所示，为姜黄素衍生物Ⅱ的还原产物的质谱图。
对比例2
将对比例1不含氮氧自由基的姜黄素衍生物Ⅱ的加氢还原产物，应用于鲜虾的光动力杀菌保鲜的方法，具体步骤如下：
1)配制10μM姜黄素衍生物Ⅱ加氢还原产物的水溶液，灌装于避光喷壶中；
2)选取鲜活完整、颜色鲜亮、大小均一的南美白对虾，将其浸入冰水中快速冻死后，使用无菌生理盐水洗净并沥干表面水分；
3)采用喷洒方式，将步骤1)配制好的姜黄素衍生物Ⅱ加氢还原产物的水溶液足量、均匀喷洒于步骤2)制得的鲜虾表面，避光静置10min；
4)将步骤3)制得的鲜虾置于光功率10W的蓝光LED矩阵下进行辐照120s，辐照波长为420nm，完成光动力杀菌保鲜过程。
对比例3
将未修饰的天然姜黄素，应用于鲜虾的光动力杀菌保鲜的方法，具体步骤如下：
1)配制10μM姜黄素水溶液，灌装于避光喷壶中；
2)选取鲜活完整、颜色鲜亮、大小均一的南美白对虾，将其浸入冰水中快速冻死后，使用无菌生理盐水洗净并沥干表面水分；
3)采用喷洒方式，将步骤1)配制好的姜黄素水溶液足量、均匀喷洒于步骤2)制得的鲜虾表面，避光静置10min；
4)将步骤3)制得的鲜虾置于光功率10W的蓝光LED矩阵下进行辐照120s，辐照波长为420nm，完成光动力杀菌保鲜过程。
对比例4
设置生理盐水替换姜黄素衍生物Ⅱ的空白对照组，其它操作步骤与实施例1相同。
对实施例1中氮氧自由基修饰的姜黄素衍生物Ⅱ及对比例1的姜黄素衍生物Ⅱ还原产物、未被修饰的姜黄素进行单线态氧生成能力测试，采用9，10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)吸光度衰减法评价姜黄素衍生物Ⅱ的单线态氧生成能力，ABDA吸光度衰减法检测单线态氧机理如图6所示，具体检测方法如下：
1)配制5μmol/L姜黄素衍生物Ⅱ和50μmol/L的ABDA的混合水溶液样品；
2)选择蓝光LED矩阵光源(420nm，20mW/cm2)光辐照样品溶液180s，每30s记录一次ABDA的吸光度值，绘制吸光度衰减曲线，同时以5μmol/L未被修饰的天然姜黄素和50μmol/L的ABDA的混合水溶液作为对照组1，以5μmol/L姜黄素衍生物Ⅱ的加氢还原产物和50μmol/L的ABDA的混合水溶液作为对照组2。检测结果如图7所示。
如图7所示，由姜黄素、姜黄素衍生物Ⅱ、姜黄素衍生物Ⅱ的加氢还原产物的单线态氧生成能力的对比结果可知，经氮氧自由基取代后的姜黄素衍生物Ⅱ的单线态氧生成能力远高于天然姜黄素；更重要的是，姜黄素衍生物Ⅱ的单线态氧生成能力远高于姜黄素衍生物Ⅱ的加氢还原产物。这是由于氮氧自由基被还原后丧失了电子自旋极化作用对系间窜越过程的诱导作用，进而导致敏化氧气生成的单线态氧数量大大降低。由此可见，氮氧自由基取代可以高效促进姜黄素衍生物Ⅱ单线态氧的生成。
如图8所示，实施例3、实施例4与对比例2、对比例3、对比例4的抑菌效果对比，姜黄素衍生物Ⅱ与空白对照组、天然姜黄素对照组、姜黄素衍生物Ⅱ还原产物对照组相比较，经姜黄素衍生物Ⅱ光动力处理后的南美白对虾的总菌生长受到了显著抑制，进一步表明本发明的姜黄素衍生物Ⅱ具备高效的光敏杀菌保鲜效果。本发明的姜黄素衍生物Ⅱ对南美白对虾进行光动力处理，可高效杀灭南美白对虾所带总菌，而大幅延长其冷藏期。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，如使用2，2，5，5-四甲基吡咯-1-氧基自由基-3-甲酰氧基的衍生物基团或其生物电子等排体对2，2，5，5-四甲基吡咯-1-氧基自由基-3-甲酰氧基进行替换。这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基本上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。