乙酰紫草素在制备抗癌药物中的应用
阅读说明：本技术 乙酰紫草素在制备抗癌药物中的应用 (Application of acetylshikonin in preparation of anti-cancer drugs ) 是由 黄晓颖 杨乐和 赵承光 唐叶萌 周峰 郑丹丹 盛珏琦 王娴 姚丹 王良兴 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种乙酰紫草素在制备抗癌药物中的应用,所述的抗癌药物包括活性组分和药用辅料；所述的活性组分包含乙酰紫草素；所述的抗癌药物用于治疗肺癌。本发明提供了乙酰紫草素的新抗癌用途,对肺癌尤其是小细胞肺癌具有良好的抗癌作用。(The invention discloses an application of acetylshikonin in preparing an anticancer medicament, wherein the anticancer medicament comprises an active component and a pharmaceutic adjuvant; the active component comprises acetylshikonin; the anticancer drug is used for treating lung cancer. The invention provides a new anticancer application of acetylshikonin, which has good anticancer effect on lung cancer, in particular small cell lung cancer.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种乙酰紫草素在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
肺癌是世界范围内与癌症相关的死亡的最常见原因。每年有1800万人被诊断出患有肺癌，并且有1600万人死于这种疾病。5年生存率根据阶段和地区差异在4％至17％之间变化。在我国，肺癌的发病率及病死率均位居第一，且肺癌死亡人数遥遥领先，高达71万，占癌症死亡总数的23.8％。非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)是最常见的侵袭性肺癌，约占肺癌的85％，其中肺腺癌为NSCLC最常见亚型且所占的比例呈逐年增长的趋势。尽管近年来NSCLC的治疗取得重要突破，已由传统的手术治疗、化疗和放疗，发展到精准分子靶向治疗和免疫治疗，但由于大多数NSCLC患者在确诊时发生转移，其5年生存率仍低于16.1％，且近十几年无显著改善。
紫草(Lithospermum erythrorhizon)是我国传统的中草药，传统中医学认为，紫草性味甘、咸，寒，归心、肝经，有凉血，活血，解毒透疹之功能。现代药理学研究显示其具有抗菌、消炎、抗肿瘤等作用，其有效成分主要分布于根部。紫草根中含有紫草素、异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β,β-二甲基丙烯酰紫草素等萘醌类小分子化合物。乙酰紫草素是一种萘醌，以其抗炎潜力而闻名，然而，其抗癌作用尚未得到充分的研究。
发明内容
本发明提供了一种乙酰紫草素在制备抗癌药物中的应用，为癌症的治疗提供更多、更优的可选方案。
一种乙酰紫草素在制备抗癌药物中的应用，所述的抗癌药物包括活性组分和药用辅料；
所述的活性组分包含乙酰紫草素；
所述的抗癌药物用于治疗肺癌。
作为优选，所述的抗癌药物用于治疗小细胞肺癌。
作为进一步的优选，所述的抗癌药物用于治疗肺腺癌。
试验结果表明，本发明的抗癌药物可用于抑制肺癌细胞的增殖、降低肺癌细胞的侵袭转移，诱导肺癌细胞的凋亡。作为优选，所述的肺癌细胞为PC-9，H1975或A549细胞。
作为优选，所述的活性组分由乙酰紫草素和其他抗癌药物组成；
所述的其他抗癌药物为顺铂、奥希替尼或厄洛替尼。
作为优选，所述的其他抗癌药物为厄洛替尼；
所述的乙酰紫草素与厄洛替尼的摩尔比为5：0.5～10。作为进一步的优选，所述的乙酰紫草素的浓度为5μM，所述的厄洛替尼的浓度为0.5～10μM，此时乙酰紫草素和厄洛替尼的组合可以具有中度以上协同作用；作为更进一步的优选，所述的乙酰紫草素的浓度为5μM，所述的厄洛替尼的浓度为10μM，此时乙酰紫草素和厄洛替尼的组合具有高度协同作用。
作为优选，所述的其他抗癌药物为顺铂；
所述的乙酰紫草素与顺铂的摩尔比为1～2.5：0.5～10。作为进一步的优选，所述的乙酰紫草素的浓度为1～2μM，所述的顺铂的浓度为0.5～10μM，此时乙酰紫草素和顺铂的组合具有至少高度协同作用；作为另外的优选，所述的乙酰紫草素的浓度为2.5μM，所述的顺铂的浓度为0.5～5μM，此时乙酰紫草素和顺铂的组合具有中度协同作用。
作为优选，所述的其他抗癌药物为奥希替尼；
所述的乙酰紫草素与奥希替尼的摩尔比为0.5～1：1～10；作为进一步的优选，所述的乙酰紫草素的浓度为0.5μM，所述的顺铂的浓度为1～2.5μM，此时乙酰紫草素和奥希替尼的组合具有中度协同作用。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明提供了一种乙酰紫草素的新抗癌用途，对肺癌尤其是小细胞肺癌具有良好的抗癌作用；
(2)本发明进一步提供了乙酰紫草素和其他几种抗癌药物的组合，两者的组合可以发生协同，进一步提高抗癌效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中乙酰紫草素可抑制NSCLC细胞增殖结果；
图2为本发明实施例2中乙酰紫草素对NSCLC侵袭的影响结果；
图3为本发明实施例3中乙酰紫草素对NSCLC细胞凋亡的影响；
图4为本发明实施例4中乙酰紫草素和顺铂、奥希替尼、厄洛替尼的联用效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
MTT:MTT法检测人非小细胞肺癌细胞的存活率和死亡率。将NSCLE细胞(4.5×103细胞/孔)接种于96孔板上，并在不同培养基中进行适当处理。48H后，以25μL/孔的速度添加MTT溶液，并在CO2培养箱中约37℃的温度下培养4小时。用150μL二甲基亚砜溶解福尔马赞晶体，并使用微孔板读取器(490nm吸光度)记录MTT溶液的光密度(OD)。根据GraphPad ProPrism 8.0计算细胞活力和IC50值。
集落形成试验：人NSCLC细胞(1000个细胞/孔)在37℃、5％CO2气氛下接种于六孔板上过夜。将二甲基亚砜(对照)、乙酰紫草素(0.5μM,1μM,2μM或2.5μM,5μM,10μM)添加到细胞中7天。每2天用新鲜培养基替换培养基，以保持细胞生长7天。菌落用PBS洗涤，室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，用PBS洗涤3次，结晶紫染色10分钟。每个实验分三次进行，共三次独立实验。
EDU实验：采用BeyoClick进行EdU染色以研究细胞增殖TM含Alexa Fluor 594的EdU细胞增殖试剂盒(Beyotime，中国，Cat。编号C00788L)。首先用PBS清洗细胞三次，每次五分钟。新鲜培养基中加入一定量的EDU。细胞在37℃的CO2培养箱中培养1小时。培养后，再次用PBS洗涤细胞两次，每次10分钟。细胞在室温下用4％多聚甲醛固定30min，然后用DAPI染色10min。用PBS再次洗涤后，在倒置显微镜下观察细胞。
TRANSWELL实验：根据制造商的说明，使用transwell过滤器(美国BDBiosciences)进行研究，以观察细胞迁移。细胞密度为1×103加入含有无血清培养基的上腔。将含有10％FBS的培养基添加到下室中。药物处理48小时后，用4％多聚甲醛固定细胞，并从过滤器上表面去除未粉碎的细胞。在室温下，在黑暗中用1％结晶紫对膜下表面的细胞染色15分钟。在光学显微镜下记录并计数迁移细胞的数量。图像是在倒置显微镜下拍摄的。
划痕实验：将细胞(5×105细胞/孔)接种在6孔板上，并使其贴壁过夜。在80–90％汇合处，使用无菌10μL移液管尖端在平板底部划出一条“参考线”。在用磷酸盐缓冲盐(PBS)洗涤三次后，将细胞进一步与抑制剂或对照(DMSO)在培养基中孵育，以在没有细胞生长的情况下检查细胞迁移。分别在处理0、24和48小时后，用数码相机在不同区域拍摄穿过参考线的细胞迁移的显微照片。与对照组相比，通过从参考线向中心移动的细胞迁移距离量化迁移率。所有实验重复3次。
凋亡实验：将H1975细胞接种于六孔培养板中，使其在完全培养基中生长至80％融合。然后用二甲基亚砜(对照)、乙酰紫草素(0.5μM,1μM,2μM)处理细胞48小时，以评估这些化合物对细胞凋亡的影响。收集细胞，在冰冷的PBS中洗涤两次，然后根据凋亡试剂盒的说明在结合缓冲液中再悬浮。处理后的细胞(如上所述)与荧光素标记的膜联蛋白V和PI同时孵育。然后将膜联蛋白V结合缓冲液添加到混合物中，然后在FACSCalibur(BDBiosciences，Baltimore，MD，USA)上测量荧光。使用Flowjo软件对数据进行分析。
WB实验：癌细胞以500000个细胞/孔的密度接种在6孔板上，然后培养过夜。将二甲基亚砜(对照)、乙酰紫草素(0.5,1,2μM或2.5,5,10μM)添加到6孔板中。用冰冷的PBS清洗处理过的细胞，并在RIPA裂解缓冲液(总蛋白提取试剂盒)中用1％苯甲磺酰氟化物裂解。在高速离心以获得上清液后，收集蛋白质并用增强的BCA蛋白质分析试剂盒定量。随后，将约60μg蛋白质装载到8％、10％或12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上并分离。然后，将它们转移到PVDF膜上。膜用TBST清洗三次，并在室温下用5％新鲜脱脂乳封闭1.5小时。在4℃条件下，将印迹与特异性一级抗体孵育过夜。用TBST清洗后，将膜与相关二级抗体在室温下孵育60分钟。使用Omni ECL飞秒光化学发光试剂盒(EpiZyme，中国上海)观察免疫反应带。使用ImageJ计算机软件分析条带的可视化。
实施例1
本实施例通过MTT试验、集落形成试验和EDU实验表明，乙酰紫草素对NSCLC细胞具有剂量依赖性和时间依赖性的细胞毒性和抗增殖作用。通过EDU和克隆形成实验来检测乙酰紫草素对NSCLC细胞生长的作用。EDU细胞增殖检测提示乙酰紫草素可以剂量依赖性地抑制NSCLC细胞增殖；克隆形成实验结果显示，乙酰紫草素明显抑制PC-9，A549和H1975细胞的克隆形成数量(图1)。这些结果表明乙酰紫草素可抑制NSCLC细胞增殖。
实施例2
本实施例进一步观察乙酰紫草素对NSCLC侵袭的影响。在TRANSWELL实验中，加药则大大降低了PC-9，H1975和A549细胞的的侵袭转移能力(图2)。PC-9细胞的划痕愈合试验结果进一步支持乙酰紫草素在转移中的作用。此外我们进一步检测侵袭迁移蛋白提示乙酰紫草素可以诱导蛋白SNAIL和MMP2表达减少。
实施例3
本实施例用流式细胞术进一步分析乙酰紫草素对NSCLC细胞凋亡的影响。用膜联蛋白异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)作为细胞凋亡的标记，碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)作为细胞活力的标记。结果显示乙酰紫草素可以促进H1975细胞凋亡(图3)，进一步检测凋亡蛋白提示乙酰紫草素可以诱导凋亡蛋白Cl-PARP，BAX和Cl-Caspase3表达增多，同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。
实施例4
图4为乙酰紫草素和顺铂、奥希替尼和厄洛替尼的协同实验，根据CI值可以判断两者之间的相互作用，针对PC-9细胞，5μM的乙酰紫草素和10μM的厄洛替尼组合，药物联合指数为0.493，两者为高度协同作用。5μM的乙酰紫草素分别和0.5μM,1μM,2.5μM,5μM的厄洛替尼组合，药物联合指数分别为0.617，0.509，0.637，0.719，表现为中度协同作用。针对A549细胞，乙酰紫草素和顺铂表现出强协同作用。而针对H460细胞，乙酰紫草素和顺铂则表现出高度协同作用。针对H1975细胞，乙酰紫草素和奥希替尼两者有中度协同作用。
联合指数(CI)可判断两者的相互作用，当0.9≤CI≤1.1，表示两者为叠加作用；当0.8≤CI＜0.9，表示两者为低度协同作用；当0.6≤CI＜0.8，表示两者为中度协同作用；当0.4≤CI＜0.6，表示两者为高度协同作用；当0.2≤CI＜0.4，表示两者为强协同作用。