具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(一)体外实验

(1)通过CCK8实验检测安全的药物浓度范围为≤100μmol/L(图1B)：

丹参酚酸B对3T3-L1细胞和h-ADSCs活力的影响通过Cell Counting Kit-8(Beyotime,China)根据制造商的说明进行测试。简而言之，将5000个细胞/孔接种在96孔板中。将细胞在含有不同浓度丹参酚酸B(0、0.1、0.5、1、5、10、25、 50、75、100、125μmol/L)的生长培养基或成脂分化培养基中培养。在培养72 h后，将10％CCK-8试剂与培养基混合并加入到每个孔中。将96孔板在37℃下孵育2小时。使用酶标仪(Thermo,USA)通过450nm处的吸光度测量OD值。

(2)通过Edu检测10,50,100μmol/L检测丹参酚酸B对于脂肪干细胞增殖水平的影响，发现10,50μmol/L浓度下可以促进脂肪干细胞增殖(图1C)：

将细胞接种在24孔板中，并在标准条件下与不同浓度的丹参酚酸B一起孵育。孵育24小时后，根据制造商的方案，使用EdU细胞增殖检测试剂盒 (Invitrogen，USA)检测细胞增殖。简而言之，将细胞与50μM EdU孵育2小时后固定、透膜、显色反应。然后，细胞核用Hoechst33342(Invitrogen，USA) 染色30分钟。通过倒置荧光显微镜(Nikon，Japan)确定掺入EdU的细胞。

(3)通过流式检测凋亡，发现上述10μmol/L，50μmol/L未对脂肪干细胞造成明显的凋亡影响(图2)：

将细胞接种于6孔板，设置阴性对照，0、10、50、100μmol/L组，药物处理后，收货细胞，使用冷PBS冲洗。准备1XAnnexin-binding Buffer及100μg/ml PI。离心细胞，使用Annexin-binding Buffer重悬，稀释至1*10⁶个/ml。取100μl、5μ l FITC annexin V以及1μl 100g/ml PI，室温孵育15分钟。加入400μl Annexin-binding Buffer，上机检测。

(4)通过使用10μmol/L，50μmol/L，100μmol/L三个浓度下诱导脂肪干细胞成脂分化，油红染色及甘油三酯测定发现上述三个浓度均可促进脂肪干细胞成脂分化，其中50μmol/L效果最佳(图3)：

油红染色：将细胞用PBS洗涤，在室温下在4％多聚甲醛中固定30分钟，并用新鲜的油红O溶液(Solarbio，China)染色30分钟。然后，染色的细胞用PBS 洗涤两次。使用倒置荧光显微镜(Nikon，Japan)来观察脂肪形成分化。

甘油三酯测定：在分化过程中将不同浓度丹参酚酸B添加到培养基中。在分化的第4天和第8天，根据制造商的说明，通过甘油三酯测定试剂盒(中国南京建成生物工程研究所)测量细胞的甘油三酯水平。简而言之，该测定以脂肪酶对甘油三酯的酶促水解开始，以产生甘油和游离脂肪酸。随后通过酶标仪在510 nm波长下测量释放的甘油。使用BCA试剂盒(Boster，China)测量蛋白质浓度。甘油三酯含量(mmol/gprot)＝甘油三酯浓度(mmol/L)/蛋白质浓度(gprot/L)。

(5)通过收集对照组和药物处理组(50μmol/L浓度下)分化第4天和第8 天脂肪干细胞样本，并送RNA-Seq发现PPAR通路在药物组明显上调(图4)：

向h-ADSCs中加入丹酚酸B或溶剂持续分化4天和8天后，获得RNA-Seq样本。使用NanoDrop ND-1000仪器(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)测量 RNA的表达量和质量。使用KAPA Stranded RNA-Seq文库制备试剂盒(Illumina， San Diego，CA)构建cDNA文库。

(6)通过WB和PCR验证测序结果，发现PPARγ、CEBPα及FABP4的基因及蛋白表达量均上升，其中50μmol/L效果最佳(图5)：

Western-blot：培养的细胞用补充有蛋白酶抑制剂(PMSF，Biosharp，中国) 的RIPA缓冲液(Beyotime，中国)裂解。简而言之，20μg蛋白质通过10％或12％ SDS-PAGE分离并在聚偏二氟乙烯膜(Millipore Sigma，USA)中进行印迹。膜在室温下用5％脱脂牛奶封闭1小时。然后对分离的蛋白质进行免疫印迹，并用抗 GAPDH抗体(Proteintech，中国；#10494-1-AP，1:5,000)、抗CEBPα抗体(Abcam，英国；ab40764，1:1,000)、抗PPARγ抗体(Abcam，英国；ab59256，1:1,000) 和抗FABP4抗体(Abcam，英国；ab92501，1:1,000)进行检测，在4℃下过夜。第二天，使用二抗(Abcam，英国；ab205718，1:10,000)在室温下孵育1小时，然后用TBST洗涤3次10分钟。ImageJ软件用于对免疫反应条带进行定量分析。

(二)体内实验

(1)构建裸鼠皮下人颗粒脂肪移植模型(图6)：

所有动物实验均经上海交通大学医学院附属第九人民医院批准。将雌性裸鼠(6至8周龄)关在单独的笼子中，光照/黑暗周期为12小时，并提供标准食物和水。将小鼠随机分为三组(每组6只)：生理盐水、10μmol/L和50μmol/L 组。使用带有钝性浸润套管1ml注射器在每只小鼠背部的左右两侧皮下注射 0.2ml Coleman脂肪。移植物被注射成球形。每两天给小鼠局部注射0.2ml生理盐水或丹酚酸B(10μmol/L，50μmol/L)。在第14天时，收获左背部的移植物并小心地与周围组织分离，并测量它们的体积和重量。用6-0号尼龙缝线缝合伤口，患处涂抗生素软膏1周，防止局部感染。对每个收获的样品进行组织学和免疫组织化学评估。在第28天，通过CT扫描脂肪移植物，收获移植物并小心地与周围组织分离，并测量它们的体积和重量。对每个收获的样品进行组织学和免疫组织化学评估。

(2)通过收集移植后2周、4周的样本分析发现，在第4周药物处理组(50 μmol/L)其脂肪保留率高于对照组(图7A，7B)：

移植物体积使用排水法检测，重量使用电子天平称量。

(3)HE及Perlipin组织学染色提示药物治疗组存活脂肪结构更为完整(图7C，7D)：

组织用多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切成5μm厚，苏木精伊红染色。对于免疫荧光染色，将组织切片与在封闭溶液中稀释的抗Perilipin(Proteintech， #15294-1-AP，中国，1:200)的一抗在4℃下孵育过夜。与Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔免疫球蛋白G(Invitrogen，#A-21206，美国，1:500)孵育后，用 DAPI(Southern Biotech，美国)染色细胞核。Image-Pro Plus 6.0软件用于定量分析。

本发明的机理是：通过丹参酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)处理脂肪干细胞，观察丹参酚酸B可以促进脂肪干细胞增殖，并通过上调PPARγ、CEBPα和FABP4来促进成脂分化。促进脂肪干细胞的增殖分化对于提高脂肪移植存活率尤为重要，通过丹参酚酸B处理移植脂肪，可以有效提高移植脂肪的存活率，这对于改善临床上自体脂肪移植治疗软组织缺陷等方面有广阔的应用前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。