一种非标记蛋白质组学检测方法及装置
阅读说明：本技术 一种非标记蛋白质组学检测方法及装置 (Non-labeled proteomics detection method and device ) 是由 丁显廷 王丽萍 朱大为 于 2021-11-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种痕量细胞在线分离串联质谱检测的非标记蛋白质组学方法,涉及单细胞蛋白质组学检测领域,由微流控系统实现细胞分离、样品制备、以及串联质谱检测。本发明通过建立微流控系统实现细胞的精准计数和微量生物样本的前处理,从而实现对单个细胞蛋白信息的精确定量；进一步开展CTCs高通量蛋白质组学的检测,利用CTCs的蛋白质组学信息监测个体对化疗的耐药反应,对进一步指导个体化用药具有重大的意义。(The invention discloses a non-labeled proteomics method for trace cell online separation tandem mass spectrometry detection, relates to the field of single cell proteomics detection, and realizes cell separation, sample preparation and tandem mass spectrometry detection by a microfluidic system. According to the invention, the accurate counting of cells and the pretreatment of a trace biological sample are realized by establishing a microfluidic system, so that the accurate quantification of single cell protein information is realized; the detection of CTCs high-throughput proteomics is further developed, the proteomics information of CTCs is used for monitoring the drug resistance reaction of an individual to chemotherapy, and the method has great significance for further guiding individualized medication.)
技术领域
本发明涉及一种痕量细胞在线分离串联质谱检测的非标记蛋白质组学方法，尤其涉及一种通过微流控系统实现细胞分离、样品制备、以及串联质谱检测的非标记蛋白质组学检测方法。
背景技术
在蛋白质组学研究中，除质谱仪硬件的灵敏度和高分辨率影响因素外，样品前处理、质谱数据采集和数据分析均对蛋白组学研究有影响。
样品前处理过程复杂，且需要根据具体的实验目的进行优化，以减少在样品处理阶段对蛋白造成的降解和修饰，释放尽可能多的肽段，用于最终质谱的检测。其中，微量样本蛋白质组学检测是一个技术瓶颈，流式分选细胞、培养胚胎、激光显微切割、循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)以及细针穿刺等样品无法使用传统方法开展非标记蛋白质组学检测。常规蛋白质组学研究是基于细胞群体的研究，会使大量细胞信息平均化，且一般要求细胞数量至少要大于106。而微量样本蛋白质组学研究可以解决细胞的异质性。传统的蛋白质组学样本制备目前存在体系大、管子吸附的问题。
传统质谱技术受到采集速度低的影响，单个样本的鉴定深度很难提升；翻译后修饰在生命过程中发挥重要作用，但因为修饰的多肽比例一般比较低，并且修饰类型种类多、修饰位置异构多，受到传统质谱技术灵敏度和分离能力的限制，修饰多肽鉴定通常深度不足，修饰位置异构的多肽也无法准确鉴定和定量。
虽然，目前蛋白质组学质谱技术已经比较成熟，在蛋白质组学微量样本前处理、液相和质谱以及数据采集模式三个方面均有很大改进，但依然面临众多挑战。基于非标记蛋白质组学的改进方法需要的样本量较多，基于TMT标记蛋白质组学的研究成本较贵。采用微流控平台对微量样本的蛋白质组学得到了很好的鉴定结果，对细胞的需求量大大降低，可以实现小于100个细胞的蛋白质组学检测，但是设计相对复杂，不易被其它质谱实验室采用，同时，微流控平台制样完成后，需要通过色谱柱直接进样对液质机器的操作也提出了很高的要求，不但要有成熟的色谱柱制备体系，同时，每跑一个样品的时间相对较长，包括对机器的校正、平衡和进样，且不可连续自动进样。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种实现细胞的精准计数和微量生物样本的前处理，从而实现对单个细胞蛋白信息的精确定量的蛋白质组学检测方法
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是实现对单个细胞蛋白信息的定性和相对定量。
为实现上述目的，本发明提供了一种痕量细胞在线分离串联质谱检测的非标记蛋白质组学方法。
所述方法包括以下步骤：
步骤1、芯片制备
步骤1.1聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)与固化剂(Sylgard 184，道康宁)按11:1的比例倒入硅片表面的培养皿中，在85℃下烘烤45分钟；
步骤1.2用氧等离子体将螺母粘接在半圆形通道中间附近PDMS凝固表面50秒；
步骤1.3将PDMS与固化剂混合倒入培养皿中，直至覆盖螺母，烘烤1小时。
步骤1.4将带螺母的PDMS从皿中剥离，经氧等离子体处理50s后粘在玻璃基板上；
步骤1.5在进、出口打孔。进口和内出口采用直径为0.8mm的冲孔机，外出口采用直径为2.5mm的冲孔机；
步骤1.6外出口顶部贴20μm孔径滤膜；
步骤1.7在室温下用1％BSA处理芯片1h，阻断芯片表面，防止未指定蛋白结合。用50mM NH4HCO3洗涤去除牛血清白蛋白，置于37℃烘箱中使用。柔性管与钢管连接，插入进口和内出口，用于流体注入和收集。
步骤2、通过微流控体系分离细胞和计数
优选的，用50mM NH4HCO3洗涤芯片，取代PBS，并通过Zeiss LSM 880，德国显微镜拍摄腔体图像，用于准确的细胞计数；
步骤3、通过微流控制备蛋白质组学样品
步骤3.1准备目标细胞，稀释后，通过进样端加入微流体系，通过细胞通道去除杂质，进入样品池；
步骤3.2用50mM NH4HCO3洗涤芯片，取代PBS，并通过Zeiss LSM 880，德国显微镜拍摄腔体图像，用于准确的细胞计数；
步骤3.3滤膜被去除；
步骤3.4螺栓被拧进螺帽里，把细胞固定在外出口腔；
步骤3.5将芯片置于80℃烘箱中30分钟使细胞蛋白变性；
步骤3.6取5μL(0.1％DDM，1mM TCEP，2mM CAA溶在50mM NH4HCO3)添加到外出口；
步骤3.7外出口使用进样瓶密封垫和电胶带密封，在60℃培养1h。
步骤3.8然后从内部出口加入5μL胰蛋白酶(总胰蛋白酶(w):蛋白(w)＝1:10)，使用进样瓶密封垫和电胶带密封，37℃孵育过夜，最后，从外部出口采集样品；
步骤3.9加入1％甲酸终止反应，旋干；
步骤3.10加入甲酸水复溶，进行液质分析；
步骤4、4D淌度质谱进行DDA数据采集
步骤4.1液质系统为串联nanoElute timsTOF Pro，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，液相梯度具体如下：40min梯度如下：5-24％B(25min),24-36％B(5min),36-80％B(2min),80-80％B(8min)；
步骤4.2肽段重悬5μL，取4μL以最大压力275bar上样至micro trap cartridgechromXP C18CL(5μmAB SCIEX)，肽段分离使用分析柱(C18,75μm×25cm,1.7μm,IonOpticks,Australia-Aurora)；
步骤4.3timsTOF Pro采用正离子DDA平行积累序列碎片(PASEF)模式。毛细管电压设为1400V。一级和二级质荷比范围300m/z～1500m/z，离子迁移率范围(1/K0)为0.60Vs/cm2～1.60Vs/cm2。
本发明还提供一种非标记蛋白质组学检测微流控芯片，包含细胞通道5和样品池，细胞通道5两端设置进口52和内出口53，样品池包括外出口、螺母3和7、螺栓1,所述细胞通道5与样品池通过半圆型通道连接，进口52和内出口53采用直径为0.8-1.0mm的冲孔机，外出口采用直径为2-3mm的冲孔机，所述半圆型通道内半径为6-6.5mm，外径6.8-7.0mm。
优选的，样品池外出口(3)覆盖20μm孔径滤膜。
此外，本发明还提供了所述的非标记蛋白质组学检测方法在CTC细胞高通量蛋白质组学检测中的应用。
本发明优点在于：
1.通过建立微流控系统实现细胞的精准计数和微量生物样本的前处理，从而实现对单个细胞蛋白信息的精确定量，且操作相比较传统蛋白质组学样本前处理更加简便，相比较标记蛋白质组学检测方法成本的得到极大的降低；
2.通过建立的微流控系统结合4D淌度质谱进行DDA数据采集的方法，进一步开展了CTCs高通量蛋白质组学的检测，利用CTCs的蛋白质组学信息监测个体对化疗的耐药反应。
附图说明
图1是本发明芯片结构示意图；
图2是不同上样量对可定量蛋白质组合平均鉴定蛋白质组的影响；
图3是DDA、DIA和dDIA对可鉴定蛋白质组的影响；
图4是不同细胞数量可定量蛋白质组的数目以及交集数目；
图5是微流控系统分离获得的不同MCF7和CTCs蛋白质组的鉴定情况(A-C:106、119和107个MCF7细胞,D-F:57、68和58个MCF7细胞，G-H:7和5个CTCs)。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
在附图中，结构相同的部件以相同数字标号表示，各处结构或功能相似的组件以相似数字标号表示。附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的，本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰，附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。
实施例1微流控系统的制备
(1)将PDMS与固化剂(Sylgard 184，道康宁)按11:1的比例倒入硅片表面的培养皿中，在85℃下烘烤45分钟。
(2)用氧等离子体将螺母粘接在半圆形通道中间附近PDMS凝固表面50秒。
(3)将PDMS与固化剂混合倒入培养皿中，直至覆盖螺母，烘烤1小时。
(4)将带螺母的PDMS从皿中剥离，经氧等离子体处理50s后粘在玻璃基板上。
(5)在进、出口打孔。进口和内出口采用直径为0.8mm的冲孔机，外出口采用直径为2.5mm的冲孔机。
(6)外出口顶部贴20μm孔径滤膜。
(7)在室温下用1％BSA处理芯片1h，阻断芯片表面，防止未指定蛋白结合。用50mMNH4HCO3洗涤去除牛血清白蛋白，置于37℃烘箱中使用。柔性管与钢管连接，插入进口和内出口，用于流体注入和收集。
实施例2 293T细胞蛋白质组样品制备
(1)准备目标细胞，稀释后，通过进样端加入微流体系，进入样品池。
(2)用50mM NH4HCO3洗涤芯片，取代PBS，并通过Zeiss LSM 880，德国显微镜拍摄腔体图像，用于准确的细胞计数。
(3)滤膜被去除。
(4)螺栓被拧进螺帽里，把细胞固定在外出口腔。
(5)将芯片置于80℃烘箱中30分钟使细胞蛋白变性。
(6)取5μL(0.1％DDM，1mM TCEP，2mM CAA溶在50mM NH4HCO3)添加到外出口。
(7)外出口使用进样瓶密封垫和电胶带密封，在60℃培养1h。
(8)然后从内部出口加入5μL胰蛋白酶(总胰蛋白酶(w):蛋白(w)＝1:10)，使用进样瓶密封垫和电胶带密封，37℃孵育过夜。最后，从外部出口采集样品。
(9)加入1％甲酸终止反应，旋干；
(10)加入甲酸水复溶，进行液质分析。
实施例3MCF7细胞的分离、计数以及蛋白质组样品制备
(1)MCF7细胞浓度为5×104cells/mL和1×103cells/mL分别与5×104cells/mLWBCs混合，通过进样端加入微流体系1mL/h，进入样品池。
(2)较小的细胞和白细胞从内部出口流出，MCF7细胞从外部出口流出，通过滤膜过。
(3)用50mM NH4HCO3洗涤芯片，取代PBS，并通过Zeiss LSM 880，德国显微镜拍摄腔体图像，用于准确的细胞计数。
(4)滤膜被去除。
(5)螺栓被拧进螺帽里，把细胞固定在外出口腔。
(6)将芯片置于80℃烘箱中30分钟使细胞蛋白变性。
(7)取5μL(0.1％DDM，1mM TCEP，2mM CAA溶在50mM NH4HCO3)添加到外出口。
(8)外出口使用进样瓶密封垫和电胶带密封，在60℃培养1h。
(9)然后从内部出口加入5μL胰蛋白酶(总胰蛋白酶(w):蛋白(w)＝1:10)，使用进样瓶密封垫和电胶带密封，37℃孵育过夜。最后，从外部出口采集样品。
(10)加入1％甲酸终止反应，旋干；
(11)加入甲酸水复溶，进行液质分析。
实施例4CTC细胞的分离、计数以及蛋白质组样品制备
(1)临床患者的血液，裂解红细胞，通过进样端加入微流体系1mL/h，进入样品池。
(2)较小的细胞和白细胞从内部出口流出，CTC细胞从外部出口流出，通过滤膜过。
(3)用50mM NH4HCO3洗涤芯片，取代PBS，并通过Zeiss LSM 880，德国显微镜拍摄腔体图像，用于准确的细胞计数。
(4)滤膜被去除。
(5)螺栓被拧进螺帽里，把细胞固定在外出口腔。
(6)将芯片置于80℃烘箱中30分钟使细胞蛋白变性。
(7)取5μL(0.1％DDM，1mM TCEP，2mM CAA溶在50mM NH4HCO3)添加到外出口。
(8)外出口使用进样瓶密封垫和电胶带密封，在60℃培养1h。
(9)然后从内部出口加入5μL胰蛋白酶(总胰蛋白酶(w):蛋白(w)＝1:10)，使用进样瓶密封垫和电胶带密封，37℃孵育过夜。最后，从外部出口采集样品。
(10)加入1％甲酸终止反应，旋干；
(11)加入甲酸水复溶，进行液质分析。
液质分析操作步骤参照发明内容步骤4。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
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