一种减弱肿瘤细胞耐药性的方法
阅读说明：本技术 一种减弱肿瘤细胞耐药性的方法 (Method for weakening drug resistance of tumor cells ) 是由 叶明亮 刘震 王麒 王科云 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)结合固相萃取-强阳离子交换树脂分离敏感和耐药细胞甲基化位点的方法。细胞在含有重标甲硫氨酸的培养基中培养,利用胰蛋白酶Trypsin和赖氨酸酶Lys-C酶解,再使用精氨酸酶Arg-C进行酶解,SCX分级蛋白酶解物的肽段,最后将洗脱下来的肽段进行LC-MS/MS分析。通过labelfree定量可以得出差异的赖氨酸和精氨酸甲基化位点,将这些甲基化位点进行motif分析后发现敏感和耐药细胞的赖氨酸甲基转移酶偏好性明显不同,比较获得耐药和敏感细胞中对应甲基化修饰位点表达量的比值,将绝对值最大的甲基位点所对应的甲基转移酶进行含量调整,从而减弱肿瘤细胞的耐药性。(The invention relates to a method for separating sensitive and drug-resistant cell methylation sites by combining Stable isotope labeling technology (SILAC) with solid phase extraction-strong cation exchange resin under cell culture conditions. Culturing cells in a culture medium containing the re-standard methionine, performing enzymolysis by Trypsin Trypsin and lysine Lys-C, performing enzymolysis by arginase Arg-C, classifying peptide fragments of the protein zymolyte by SCX, and finally performing LC-MS/MS analysis on the eluted peptide fragments. Different lysine and arginine methylation sites can be obtained through labelfree quantification, the methylation sites are analyzed for motif, the lysine methyltransferases of sensitive cells and drug-resistant cells have obviously different preferences, the ratio of the expression amounts of the corresponding methylation modification sites in the drug-resistant cells and the sensitive cells is obtained through comparison, and the content of the methyltransferase corresponding to the methyl site with the maximum absolute value is adjusted, so that the drug resistance of tumor cells is weakened.)
技术领域
本发明属于蛋白质组学研究方向肿瘤细胞耐药性研究领域，具体涉及细胞培养条件下稳定同位素标记技术结合固相萃取-强阳离子交换树脂用于富集赖氨酸和精氨酸甲基化肽段的方法。
背景技术
癌症是一种常见的恶性肿瘤和容易导致人类死亡的重大疾病，一些化疗药物可以很好的杀死癌细胞，但是经过长时间用药后，很容易导致肿瘤细胞产生耐药性(文献1.Li,X.；Yu,J.；Brock,M.V.；Tao,Q.；Herman,J.G.；Liang,P.；Guo,M.,Epigenetic silencingof BCL6B inactivates p53 signaling and causes human hepatocellular carcinomacell resist to 5-FU.Oncotarget 2015,6,(13),11547-11560.)，因此了解肿瘤细胞耐药的分子机制对于鉴定新的治疗靶标来减弱细胞的抗性是非常关键的。
细胞内的信号转导经常通过不同的蛋白质翻译后修饰完成，例如磷酸化和甲基化，磷酸化的基本细胞转导途径已经阐述的很清楚。尽管甲基化和磷酸化发现时间是同步的，蛋白质甲基化的信号转导途径还没有很好的揭示。甲基化通常发生在蛋白质的精氨酸和赖氨酸残基上。赖氨酸以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在赖氨酸甲基转移酶的作用下可以形成单甲基化，二甲基化和三甲基化(文献2.Paik,W.K.,Paik,D.C.,Kim,S.,Historical review:the field of protein methylation.Trends Biochem.Sci.2007,32,146-152，文献3.Lake,A.N.,Bedford,M.T.,Protein methylation and DNArepair.Mutat.Res.-Fundam.Mol.Mech.Mutagen.2007,618,91-101，文献4.Smith,B.C.,Denu,J.M.,Chemical mechanisms of histone lysine and argininemodifications.Biochimica Et BiophysicaActa-Gene Regulatory Mechanisms 2009,1789,45-57.)。精氨酸侧链在精氨酸甲基转移酶作用下形成单甲基化和二甲基化(文献5.Bedford,M.T.,Richard,S.,Arginine methylation:An emerging regulator ofprotein function.Molecular Cell 2005,18,263-272.)，其中二甲基化又分为对称二甲基化和不对称二甲基化。大量的证据说明蛋白质甲基化在维持细胞内的功能和细胞的生理和病理变化过程中起到了关键的作用。组蛋白甲基化影响染色质的物理性质，影响基因的表达(文献6.Zhou,V.W.,Goren,A.,Bernstein,B.E.,Charting histone modificationsand the functional organization of mammalian genomes.Nature Reviews Genetics2011,12,7-18.)。除了组蛋白，赖氨酸和精氨酸的甲基化也发生在非组蛋白上，并且扮演着重要的调控作用(文献7.Paik,W.K.,Paik,D.C.,Kim,S.,Historical review:the fieldof protein methylation.Trends Biochem.Sci.2007,32,146-152.)，然而肿瘤细胞产生耐药性甲基化是如何变化还没有相关报道。
为了更好的理解蛋白质甲基化在肿瘤细胞药物抗性中的状态变化，本发明基于重标甲硫氨酸标记结合固相萃取-强阳离子交换树脂富集赖氨酸和精氨酸甲基化肽段。通过分析敏感和耐药细胞的甲基化位点motif，发现催化它们的甲基转移酶偏好性明显不同，比较获得耐药和敏感细胞中对应甲基化修饰位点表达量的比值，将绝对值最大的甲基位点所对应的甲基转移酶进行含量调整，从而减弱肿瘤细胞的耐药性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以简便、低成本、重复性好富集敏感和耐药肿瘤细胞的赖氨酸和精氨酸甲基化位点的方法。
本发明提供的方法是利用重标甲硫氨酸培养的方法结合固相萃取-强阳离子交换树脂从复杂样品中将甲基化肽段分离出来，然后通过质谱分析得到样品的赖氨酸和精氨酸甲基化位点。
本发明采用如下技术方案：
重标甲硫氨酸培养的细胞样品，使用胰蛋白酶Trypsin和赖氨酸酶Lys-C酶解，再使用精氨酸酶Arg-C进行酶解，然后用固相萃取-强阳离子交换树脂分离甲基化肽段，最后对洗脱下来的肽段进行LC-MS/MS分析来获得赖氨酸和精氨酸甲基化位点的鉴定结果。
富集敏感和耐药细胞的赖氨酸和精氨酸甲基化位点具体步骤如下：
(1)分别将敏感和耐药肿瘤细胞培养在含有重标甲硫氨酸的培养基中1-10代，将提取后的蛋白分别溶解在含有1-10M Urea和10-100mMTris的缓冲溶液中，加入终浓度为10-100mM二硫苏糖醇(DTT)，10-100℃水浴中1-10h，然后加入终浓度为10-100mM碘乙酰胺(IAA)，10-100℃避光反应10-100min；
(2)步骤(1)结束后得到的样品，用截留分子量为3-30K的超滤管在离心力为1000-20000g下进行超滤离心，取截留样品加入酶解缓冲液，然后分别加入与蛋白质量比为1/100-1/25的胰蛋白酶Trypsin和赖氨酸酶Lys-C，37℃水浴中酶解12-24h，得到肽段溶液；
(3)步骤(2)结束后得到的样品，用截留分子量为3-30K的超滤管在离心力为1000-20000g下进行超滤离心，取截留样品加入激活缓冲液，然后取截留样品加入与蛋白质量比为1/100-1/25的精氨酸酶Arg-C，37℃水浴中酶解12-24h，得到肽段溶液；
(4)向步骤(3)得到的肽段溶液中加入三氟乙酸调pH值至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，将得到的肽段洗脱液冷冻干燥；
(5)将100-1000μg步骤(4)得到的蛋白质样品酶解肽段复溶于100-1000μL的上样缓冲溶液中；
(6)将100-1000μL SCX材料加入到1-5ml的SPE柱中，用100-1000μL洗脱缓冲液洗涤1-10次，然后用100-1000μL上样缓冲液平衡1-10次，将上述步骤(5)的溶液加入到SPE柱中；
(7)将100-1000μL洗涤缓冲液1加入上述步骤(6)的SPE柱中，洗涤1-10次，收集洗脱液；
(8)将100-1000μL洗涤缓冲液2加入上述步骤(7)的SPE柱中，洗涤1-10次，收集洗脱液；
(9)将100-1000μL洗脱缓冲液加入上述步骤(8)的SPE柱中，洗脱1-10次，收集洗脱液；
(10)向步骤(7)、步骤(8)和步骤(9)得到的洗脱液中加入三氟乙酸调pH值至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，将得到的肽段洗脱液冷冻干燥。
步骤(1)重标甲硫氨酸的终浓度为10-30mg/L。
步骤(2)酶解缓冲液为5-100mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH值为7-10的水溶液。
步骤(3)激活缓冲液为5-50mM三(羟甲基)氨基甲烷pH值为7-10,5-50mM二硫苏糖醇,0.2-2mM乙二胺四乙酸和50-500mM氯化钙的水溶液。
步骤(5)、(6)中上样缓冲液为1-10mM磷酸二氢钾，pH值为1.7-5.7,10-100％(V/V)乙腈的乙腈溶液。
步骤(7)中的洗涤溶液1为1-10mM磷酸二氢钾,10-100mM氯化钾,pH值为1.7-5.7,10-100％(V/V)乙腈的乙腈溶液。
步骤(8)中的洗涤溶液2为1-10mM磷酸二氢钾,10-100mM氯化钾,pH值为1.7-5.7,10-100％(V/V)乙腈的乙腈溶液。
步骤(9)中的洗脱溶液为1-10mM磷酸二氢钾,100-1000mM氯化钾,pH值为5-10,10-100％(V/V)乙腈的乙腈溶液。
所述肿瘤细胞为肝癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等其中的一种；
敏感肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞为同一种肿瘤细胞；
所述培养基为对应肿瘤细胞所需的培养基。
取来源于服用过待检药物的患有肿瘤生物的肿瘤细胞作为备用耐药肿瘤细胞；
取来源于未曾服用过待检药物的患有肿瘤生物的肿瘤细胞作为备用敏感肿瘤细胞；
采用终浓度相同的待检药物对备用耐药肿瘤细胞和备用敏感肿瘤细胞进行培养处理，分别获得它们的IC50值，如果备用耐药肿瘤细胞和备用敏感肿瘤细胞的IC50值比值大于等于10，所述备用耐药肿瘤细胞和备用敏感肿瘤细胞即可作为实验用耐药肿瘤细胞和敏感肿瘤细胞；
所述待检药物为可治疗肿瘤的患有肿瘤疾病生物可服用的药物，药物可为氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂类药物和他莫昔芬等，肿瘤疾病生物可为小白鼠和小白兔。
将上述步骤(7)、(8)、(9)中得到的赖氨酸和精氨酸甲基化肽段复溶在0.1％体积浓度的三氟乙酸中进行RPLC-MS/MS分析。
该方法成本低、操作简单、重复性好，可用于敏感和耐药细胞的甲基化蛋白质组分析。
所用的甲基化肽段富集材料为商品化的极性MC30-SP SCX beads(Sepax)。
所述的甲基化肽段富集方法，蛋白质酶解液中赖氨酸和精氨酸甲基化肽段依据其离子交换强度被强阳离子交换树脂分离出来。
本发明的优点：
该富集方法成本低，易于操作，重现性好。本发明是利用重标甲硫氨酸培养条件下结合固相萃取-强阳离子交换树脂用于肿瘤细胞耐药性分析，高分辨率的RPLC-MS/MS分析，有效地富集出赖氨酸和精氨酸甲基化位点，通过label free定量可以得出差异的赖氨酸和精氨酸甲基化位点,将这些甲基化位点进行motif分析后发现敏感和耐药细胞的赖氨酸甲基转移酶偏好性明显不同，比较获得耐药细胞和敏感细胞中对应甲基化修饰位点表达量的比值，将绝对值最大的甲基位点所对应的甲基转移酶进行含量调整，从而减弱肿瘤细胞的耐药性。
附图说明
图1为所述敏感和耐药肿瘤细胞甲基化蛋白质组分析方法的流程图。敏感和耐药细胞在含有重标甲硫氨酸的培养基中培养，其蛋白经过多种酶进行酶解，将酶解后的肽段用固相萃取-强阳离子交换树脂分离，对洗脱下来的肽段进行Q Exactive HF分析，然后利用label free方法定量。
图2为所述敏感和耐药细胞甲基化蛋白质组分析方法，每周多点注射DEPC水于50只荷瘤鼠瘤体，每周多点注射5-Fu(3mg/kg)于50只荷瘤鼠瘤体，每周增加1mg/kg药物，共计10周，记录肿瘤体积大小。，
图3为所述敏感和耐药细胞甲基化蛋白质组分析方法，0mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg和18mg/kg的药物5-Fu注射对照组和用药组肿瘤细胞，一周后记录肿瘤体积大小，每个浓度重复3次。
图4为所述敏感和耐药细胞甲基化蛋白质组分析方法，用于对照组和用药组肿瘤细胞甲基化蛋白质组学定量分析数据，图中的结果为定量和显著性变化的甲基化形式和甲基化蛋白质。
图5为所述敏感和耐药细胞甲基化蛋白质组分析方法，用于对照组和用药组肿瘤细胞甲基化蛋白质组学定量分析数据，(a)上调的赖氨酸甲基化位点的motif，(b)上调的精氨酸甲基化位点的motif，(c)下调的赖氨酸甲基化位点的motif，(d)下调的精氨酸甲基化位点的motif。
图6为所述敏感和耐药细胞甲基化蛋白质组分析方法，用于减弱用药组肿瘤细胞生长的数据，用药组荷瘤鼠瘤体多点注射DEPC水50μL+腹腔注射0.9％氯化钠注射液200μL，瘤体多点注射DEPC水50μL+腹腔注射5-Fu(3mg/kg)，瘤体多点注射siRNA 500pmol+腹腔注射0.9％氯化钠注射液200μL，瘤体多点注射siRNA 500pmol+腹腔注射5-Fu(3mg/kg)，每周一次，共计4次，记录瘤体积大小。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例
肝癌细胞系Bel-7402培养于含10％胎牛血清的1640培养液中，置于5％、37℃培养箱中培养。取对数生长期的细胞制备单细胞悬液，调整细胞密度为1х108个/mL。用1mL注射器将单细胞悬液注射于裸鼠右侧背部皮下，每只注射剂量为200μL。严格按照无菌操作原则进行。接种完成后隔天观察接种部位，用游标卡尺测量肿瘤最长经和最短经，按照如下公式计算肿瘤体积：V(mm3)＝πabc/6。
当移植瘤体积大于10mm3时，将100只荷瘤鼠随机分为2组，即对照组和用药组，每组50只。对照组：瘤体多点注射DEPC水；用药组：瘤体多点注射5-Fu(3mg/kg),每周1次，每周增加1mg/kg药物，共计10次。
每次注射前用游标卡尺测量肿瘤最长经a、最短经b和高c，按照公式计算瘤体积，记录瘤体积大小。
取15只对照组和15只用药组的荷瘤鼠，用0mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg和18mg/kg的5-Fu注射荷瘤鼠的瘤体一周，每个浓度重复3次，按照公式计算瘤体积，算出IC50值。
确定荷瘤鼠的瘤体具有耐药性后，喂养含有重标甲硫氨酸的食物2周，用药组每周一次注射3mg/kg的5-Fu维持其耐药性，处死荷瘤鼠，取肿瘤组织，提取蛋白。
(1)将1mg对照组和用药组的蛋白溶解在8M Urea和50mMTris的缓冲溶液中，加入20mM DTT，37℃水浴中2h，然后加入40mM IAA，25℃避光反应40min；
(2)用10K的超滤管在14000g下进行超滤离心，取截留样品加入10mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH值为8.0，然后分别加入与蛋白质量比为1/100的胰蛋白酶Trypsin和赖氨酸酶Lys-C，37℃水浴中酶解16h，得到肽段溶液；
(3)用10K的超滤管在14000g下进行超滤离心，取截留样品加入终浓度为5mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH值为7.6,5mM二硫苏糖醇,0.2mM乙二胺四乙酸和5mM氯化钙缓冲液，然后取截留样品加入与蛋白质量比为1/100的精氨酸酶Arg-C，37℃水浴中酶解16h，得到肽段溶液；
(4)向肽段溶液中加入三氟乙酸，调pH值至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，将得到的肽段洗脱液冷冻干燥；
(5)加入200μL SCX的材料到2.5ml的SPE柱中，用300μL洗脱缓冲液(5mM磷酸二氢钾,500mM氯化钾,pH值为7.0,30％乙腈)洗涤3次，然后用200μL上样缓冲液(5mM磷酸二氢钾,pH值为2.7,30％乙腈)平衡3次；
(6)将1000μg酶解肽段复溶于900μL的上样缓冲溶液中，加入到SPE柱中；
(7)用300μL洗涤缓冲液1(5mM磷酸二氢钾,30mM氯化钾,pH值为2.7,30％乙腈)洗涤SPE柱5次，收集洗涤液；
(8)用300μL洗涤缓冲液2(5mM磷酸二氢钾,40mM氯化钾,pH值为2.7,30％乙腈)洗涤SPE柱3次，收集洗涤液；
(9)用300μL洗脱缓冲液洗涤SPE柱3次，收集洗脱液；
(10)向洗脱液中加入三氟乙酸调pH值至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，将得到的肽段洗脱液冷冻干燥；
(11)将得到的赖氨酸和精氨酸甲基化肽段复溶在0.1％(v/v)的三氟乙酸中进行RP LC-MS/MS分析。
(12)将质谱采集的数据用Maxquant搜索引擎进行label free定量，将定量的结果用perseus软件处理得到差异的甲基化位点，比较获得耐药和敏感细胞中对应甲基化修饰位点表达量的比值，按比值与1差的绝对值从大至小排序，从绝对值大的一端取排在前面1的对应位点的赖氨酸甲基转移酶进行含量调整，绝对值最大的甲基化位点为HSPA8的二甲基化位点di-K 561(变化倍数＝5.12，p值＝0.002)，经查阅文献其甲基转移酶为METTL21A。
(13)利用siRNA技术将用药组中METTL21A下调表达，具体实验设计如下，对照组：瘤体多点注射DEPC水50μL+腹腔注射0.9％氯化钠注射液200μL；5-Fu组：瘤体多点注射DEPC水50μL+腹腔注射5-Fu(3mg/kg)；siRNA组：瘤体多点注射siRNA 500pmol+腹腔注射0.9％氯化钠注射液200μL；siRNA联合5-Fu组：瘤体多点注射siRNA 500pmol+腹腔注射5-Fu(3mg/kg)，每周一次，共计4次，记录瘤体积大小。
图2为肿瘤细胞在加药过程中的肿瘤体积大小变化情况，可以看出对照组肿瘤体积随着时间的增加逐渐增大，然而开始阶段用药组肿瘤体积随着时间的增加逐渐减小，在第五周时肿瘤体积最小，之后随着时间的增加肿瘤体积逐渐增大，表明用药组肿瘤细胞已具备耐药性。
图3为对照组和用药组肿瘤细胞的IC50值，对照组IC50值为2.069mg/kg，用药组IC50值为61.83mg/kg，用药组的IC50值是对照组的29.9倍，可以用于下一步实验。
图4为甲基化位点的定量分析结果，从图中可以看出一共定量到231个甲基化形式，89个具有统计学意义，发现15个甲基化形式是上调表达的，包括9个精氨酸甲基化形式和6个赖氨酸甲基化形式，74个甲基化形式是下调表达的，包括42个精氨酸甲基化形式和32个赖氨酸甲基化形式，余下的142个甲基化形式没有变化，这些差异的甲基化形式在肿瘤细胞耐药性方面可能扮演着重要的作用。
图5为甲基化位点的motif分析结果，从图中可以看出上调的赖氨酸甲基化形式序列特征明显不同于下调的甲基化形式序列特征，进一步我们发现用药组肿瘤细胞赖氨酸甲基转移酶偏好甲基化邻位是精氨酸的赖氨酸，这一现象预示着偏好甲基化这一类型的甲基转移酶可能与肿瘤细胞的耐药性相关。
图6为肿瘤细胞生长体积变化曲线结果，从图中可以看出随着时间的增加对照组、5-Fu组和siRNA肿瘤体积变化趋势几乎是一致的，然而siRNA联合5-Fu组肿瘤细胞生长明显受到抑制。
总之，本发明为一种细胞培养条件下稳定同位素标记技术结合固相萃取-强阳离子交换树脂分离敏感和耐药细胞的甲基化位点。该方法容易操作，低成本，重现性好，能够同时富集敏感和耐药细胞的赖氨酸和精氨酸甲基化位点，通过labelfree定量可以得出差异的赖氨酸和精氨酸甲基化位点,将这些差异的甲基化位点所对应的甲基转移酶含量进行调整，从而减弱肿瘤细胞的耐药性。