一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用
阅读说明：本技术 一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用 (Application of high-throughput screening method using droplet microfluidic chip in actinomycetes ) 是由 涂然 王猛 张玥 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用,通过本方法可以将放线菌单孢子被包埋到单液滴中,在液滴中0-7d的培养时间内间稳定成型保证了宽泛的检测及分选时间,在检测方面,用此方法可以高通量检测到在放线菌中有功能的启动子,或鉴定一些未知启动子的强度,并筛选到适宜强度的启动子元件用于后续的放线菌菌株改造；在筛选方面,此方法的筛选通量可以达到10～5个菌株/天,可以对产生绿色荧光信号的阳性菌和不产生绿色荧光信号的阴性菌的混库进行成功分选,其中分选后的阳性菌富集率达到81.7％以上,相较分选前的3.1％提高至26倍。(The invention discloses an application of a high-throughput screening method using a droplet microfluidic chip in actinomycetes, through the method, single spores of the actinomycetes can be embedded into a single droplet, the stable forming is carried out within the culture time of 0-7d in the droplet, the wide detection and sorting time is ensured, in the aspect of detection, promoters which have functions in the actinomycetes can be detected in a high-throughput manner by the method, or the strength of some unknown promoters can be identified, and promoter elements with proper strength are screened for subsequent modification of actinomycetes strains; in the aspect of screening, the screening flux of the method can reach 10 5 The strains per day can be successfully sorted from the mixed library of the positive bacteria generating green fluorescent signals and the negative bacteria not generating green fluorescent signals, wherein the enrichment rate of the sorted positive bacteria reaches more than 81.7 percent and is improved to 26 times compared with 3.1 percent before sorting.)
技术领域
本发明属于微生物生物技术领域。更具体的说，本发明涉及一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用。
背景技术
放线菌目属于放线菌纲，是一类高GC的、呈菌丝状生长的、主要以无性孢子繁殖的革兰氏阳性原核生物。放线菌目下包含放线菌属、链霉菌属等多个属，但属间无论从生活习性、形态发育还是繁殖方式上都具有很大的相似性，例如：多数为腐生；在固体平板培养时多数能分化出发达的菌丝体，菌丝体又分为负责吸收营养的基内菌丝以及伸展至周围空间的气生菌丝；气生菌丝成熟后变为孢子丝，孢子丝进一步分化成单孢子以进行繁殖；在液体培养时菌丝相互缠绕，形成菌丝团。
放线菌的次级代谢过程可以产生多种重要的次级代谢产物，如抗生素、水解酶、酶的抑制剂、免疫调节剂和色素等。目前已发现的抗生素中，约有一半由放线菌产生。因此，研究与改造放线菌，对于挖掘新的天然产物，以及以放线菌作为底盘生产有价值的天然产物都具有重要意义。但无论是以代谢产物为导向还是以蛋白表达为导向的改造，势必需要强有力的高通量筛选方法作为支撑，才能在较短的时间内高效的在成千上万甚至上百万的菌株库中筛选到理想的表型。目前针对放线菌的高通量筛选方法十分有限，这大大限制了对于放线菌的研究与改造。
液滴微流控技术是近些年发展起来的高通量筛选新技术，该技术的优势在于可以将悬浮有单细胞的培养基包埋在液滴中，液滴悬浮在油相中互不干扰，每个液滴皆可作为独立的微反应器进行细胞的培养、蛋白的表达及代谢物的生产。之后，再借助微芯片对液滴内物质信号的检测进行分析与分选，形成包括细胞培养、信号检测、分离分选的技术平台，具有通量高、耗材少、成活率高、阳性率高等优点。目前，液滴微流控已在多种细菌与真菌的高通量筛选方面得到了成功应用，但目前还没有将液滴微流控技术应用于放线菌的高通量筛选与检测的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用，按照下列步骤进行：
步骤一、用液体培养基将放线菌孢子从固体平板上吹洗下来，过滤掉与孢子黏连的菌丝体，直至滤液中的孢子呈单分散状态，用无菌液体培养基稀释孢子悬液至浓度为0.5-2×106个/mL；
步骤二、采用液滴微流控技术将所述步骤一获得的孢子和培养基包埋于液滴中，液滴直径为80-100μm；
步骤三、液滴静置培养，至液滴内的荧光信号可以被荧光显微镜检测到，且放线菌孢子萌发产生的菌丝团充满全部液滴前结束培养；
步骤四、利用液滴微流控检测筛选设备，根据液滴内的荧光信号的强度进行分析和分选，筛选出荧光强度相对较高的一个或者几个液滴；
步骤五、对分选后的液滴中的孢子进行纯培养及验证。
优选的是，所述的一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用中，所述步骤一中，所述液体培养基包括但不限于R2YE液体培养基，也包括其他的可以使放线菌孢子萌发的液体培养基，包括YEME、R2、R5、2×YT、LB液体培养基等。
优选的是，所述的一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用中，所述步骤二中，所用的油相与水相流速比的范围在1:1到3:1之间，制备的液滴大小为80-100μm。
优选的是，所述的一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用中，所述步骤二中，液滴的大小通过以下过程测定：
采用液滴微流控技术将所述步骤一获得的孢子和培养基包埋于液滴中，调节流速获得不同大小的液滴，在显微镜下观测测量确定液滴大小。
优选的是，所述的一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用中，所述步骤三中，所述培养的温度为30℃；所述培养的持续时间优选为18-24h。
优选的是，所述的一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用中，所述步骤三中，培养的持续时间通过以下过程测定：
采用液滴微流控技术将所述步骤二获得液滴，进行测定阶段的培养，观察孢子在液滴中的萌发情况和荧光信号情况，确定荧光显微镜下可以观察到液滴荧光信号，且孢子萌发产生的菌丝萌发产生的菌丝团充满全部液滴前结束培养。
优选的是，所述的一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用中，所述放线菌为放线菌目中，包括但不限于放线菌属和链霉菌属，所有由单孢子进行繁殖，并可以由单孢子增殖分裂，并分化为菌丝形态的微生物。本发明中使用的出发菌株为放线菌模式菌株之一，属于放线菌目链霉菌属的变铅青链霉菌。
本发明的优点和有益效果为：
1、在本方法中，单孢子被包埋到单液滴中，以一个液滴为反应微单元，进行蛋白表达，次级代谢产物的生产等一系列生理活动和生化反应。蛋白的旺盛表达多在放线菌细胞生长发育初期的营养生长阶段(0-3d)，而次级代谢产物生产多在细胞生长发育中后期的次级代谢阶段(4-7d)，而经实验证实，在液滴中0-7d的培养时间内，放线菌单孢子分化而成的柔软菌丝团不会将液滴扎破，液滴的长时间稳定成型保证了相对宽泛的检测及分选时间，使得无论是在初期以蛋白信号为目标的检测还是在中后期以次级代谢产物为目标的检测都能够顺利实现。
2、区别于传统用于构建筛选体系的大肠杆菌、枯草杆菌，放线菌的个体大小、形成菌丝团的生长特性均具有独特个性，如何调整放线菌悬液浓度、液滴大小等技术参数，使放线菌的生长、检测适应液滴微流控芯片筛选体系是本发明核心解决的技术问题；经试验证实，当孢子浓度与液滴个数的比在0.3-0.5之间，制得的液滴直径为80-100μm时，孢子液滴的形成比例和检测速度最佳。如孢子悬液至浓度为1×106个/mL时，液滴的个数为2-3.7×106个液滴/mL，可以制备得到高效的孢子液滴，液滴直径在80-100μm。液滴直径在80-100μm，一方面在放线菌的整个生长、次级代谢阶段保证液滴的稳定，另一方面产生的荧光可以适应液滴微流控芯片的快速检测和筛选。
3、本发明采用液滴微流控技术对放线菌进行高通量检测和筛选。在检测方面，用此方法可以高通量检测到在放线菌中有功能的启动子，或鉴定一些未知启动子的强度，并筛选到适宜强度的启动子元件用于后续的放线菌菌株改造；在筛选方面，此方法的筛选通量可以达到105个菌株/天，相比较于常用的孔板和摇瓶几百个/天的速度，本发明的检测和筛选通量提高近千倍。对产生绿色荧光信号的阳性菌和不产生绿色荧光信号的阴性菌的混库进行成功分选，其中分选后的阳性菌富集率达到81.7％以上，相较分选前的3.1％提高至26倍。
附图说明
图1为本发明实施例中一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用的流程图；
图2为本发明的实施例二中单分散孢子在显微镜下的状态图；
图3-A为采用微流控芯片生成液滴的流程示意图；
图3-B为不同比例的油相水相下液滴状态图；
图3-C为不同比例的油相水相下液滴大小统计图；
图4-A为本发明实施例四中在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h培养时间下普通静置培养的孢子萌发状态图；
图4-B为本发明实施例四中在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h培养时间下液滴中的孢子萌发状态图；
图4-C为本发明实施例四中在12h、18h、24h、36h、2d、3d、6d、7d培养时间下液滴中的孢子状态和液滴荧光信号图；
图5为本发明的实施例五中检测和分选时刻下(24h)阴性菌株和阳性菌株的液滴荧光信号对比图；
图6为本发明实施例六中不同启动子菌株的液滴荧光信号强度图；
图7为本发明实施例七中空液滴和阴阳菌株的绿色荧光信号值检测结果图。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
以下实施例中所涉及用于液滴微流控技术高通量筛选的模式放线菌出发菌株为变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)66。
实施例一绿色荧光信号阴阳性菌株的构建
在原始的增强型绿色荧光蛋白基因egfp(如序列表中SEQ NO.1所述)序列的基础上，以ATG作为起始密码子，并将表达框内所有的GTG密码子同义突变为GTC或GTA，得到egfp(ATG)基因(如序列表中SEQ NO.2所述)。在egfp(ATG)的基础上，利用点突变的方法将起始ATG替换为ACG，得到egfp(ACG)基因(如序列表中SEQ NO.3所述)。选取5个异源启动子(表1)：Pgapdh(EL)，PrpsL(XC)，PrpsL(SG)，PrpsL(TP)，Perm*E，合成这些启动子序列，并以合成序列为模板分别克隆这些启动子；同时选取4个内源启动子(表1)： PrpS12，PgpmA，Ppyk，PrpoA，并以变铅青链霉菌基因组为模板克隆这些启动子。将这9个启动子分别连接到egfp(ATG)基因之前，并将“启动子+基因”的融合片段连接到潮霉素抗性的整合型载体pSET152-hyg上，构建9个绿色荧光蛋白表达质粒：
pSET152-hyg-Pgapdh(EL)-egfp(ATG)，其中Pgapdh(EL)启动子的序列，如序列表中SEQNO.4 所述；
pSET152-hyg-PrpsL(XC)-egfp(ATG)，其中PrpsL(XC)启动子的序列，如序列表中SEQNO.5所述；
pSET152-hyg-PrpsL(SG)-egfp(ATG)，其中PrpsL(SG)启动子的序列，如序列表中SEQNO.6所述；
pSET152-hyg-PrpsL(TP)-egfp(ATG)，其中PrpsL(TP)启动子的序列，如序列表中SEQNO.7所述；
pSET152-hyg-Perm*E-egfp(ATG)，其中Perm*E启动子的序列，如序列表中SEQ NO.8所述；
pSET152-hyg-Prps12-egfp(ATG)，其中Prps12启动子的序列，如序列表中SEQ NO.9所述；
pSET152-hyg-PgpmA-egfp(ATG)，其中PgpmA启动子的序列，如序列表中SEQ NO.10所述；
pSET152-hyg-Ppyk-egfp(ATG)，其中Ppyk启动子的序列，如序列表中SEQ NO.11所述；
pSET152-hyg-PrpoA-egfp(ATG)，其中PrpoA启动子的序列，如序列表中SEQ NO.12所述；
同时，将PrpsL(XC)启动子连接到egfp(ACG)基因之前，并将“启动子+基因”的融合片段连接到潮霉素抗性的整合型载体pSET152-hyg上，构建失活了的绿色荧光蛋白表达质粒：pSET152-hyg-PrpsL(XC)-egfp(ACG)。上述质粒采用的启动子来源及构建的质粒和菌株如下表1所示，上述使用的引物信息如下表2所示。
表1启动子来源及构建的质粒和菌株
表2实施例中使用的引物
利用PEG介导的原生质体转化法，将上述构建的10个质粒分别转化至出发菌株变铅青链霉菌原生质体中，涂布于R2YE固体平板上。30℃下培养20h后，加入终浓度50 μg/mL的潮霉素筛选，30℃下继续培养5d，可获得转化子。挑选转化子在同样浓度的潮霉素抗性的R2YE平板上重新传代，即获得9个整合了egfp(ATG)基因的绿色荧光信号阳性菌株：S.lividans/pSET152-hyg-Pgapdh(EL)-egfp(ATG)，S. lividans/pSET152-hyg-PrpsL(XC)-egfp(ATG)(简称SLATG)，S. lividans/pSET152-hyg-PrpsL(SG)-egfp(ATG)，S.lividans/pSET152-hyg-PrpsL(TP)-egfp(ATG)， S.lividans/pSET152-hyg-Perm*E-egfp(ATG)，S.lividans/pSET152-hyg-PrpS12-egfp(ATG)，S. lividans/pSET152-hyg-PgpmA-egfp(ATG)，S.lividans/pSET152-hyg-Ppyk-egfp(ATG)，S. lividans/pSET152-hyg-PrpoA-egfp(ATG)，以及整合了egfp(ACG)基因的绿色荧光信号阴性菌株S.lividans/pSET152-hyg-PrpsL(XC)-egfp(ACG)(简称SLACG)。
实施例二平板孢子培养和收集
取-80℃下冻存的孢子(20％甘油溶液悬浮)，用无菌的接种环蘸取少量孢子液，在R2YE固体平板上划线传代。平板倒置于30℃培养箱中培养5-7天，直至分化出灰色的成熟孢子。收集时，向平板表面加入5mL已过0.22μm水系膜的无菌的R2YE液体培养基，用移液器反复吹吸平板上的孢子，使之悬浮在培养基中。取洗脱后的孢子悬液3mL 加入至无菌的8层擦镜纸过滤装置中，过滤2次，直至孢子在培养基中呈单分散状态(如图2所示)。取20-30μL过滤后的孢子悬液滴于血球计数板，在20x物镜下观察并统计孢子浓度。用无菌R2YE液体培养基稀释孢子悬液至浓度为1×106个/mL。
实施例三液滴包埋方法
根据公开文献中的方法对液滴进行包埋He,R.,Ding,R.,Heyman,J.A.et al.JInd Microbiol Biotechnol(2019)46:1603.https://doi.org/10.1007/s10295-019-02221-2：其中水相为1mL的孢子浓度为1×106个/mL的孢子悬液，将上述水相加入至1mL注射器中，油相为1mL含稳定剂的油，同样加入至1mL注射器中，随后将装有水相与油相的注射器与液滴生成微芯片联通，尝试调整油相与水相流速之比分别为1:1，2:1和3：1，以生成不同直径的液滴(图3-B，C)。当孢子浓度与液滴个数的比在0.3-0.5之间，制得的液滴直径为80-100μm时，孢子液滴的形成比例和检测速度最佳。制备的液滴大小与芯片和流速有关，如孢子悬液至浓度为1×106个/mL时，液滴的个数为2-3.7×106个液滴/mL，可以制备得到高效的孢子液滴，其直径在80-100μm。实验发现，在油相与水相流速之比分别为2:1，且油相流速为1000μL/h，水相流速为500μL/h时，制得的直径为90μm的液滴最为合适。待液滴稳定生成后，将液滴接入至无菌的1.5mL离心管中，30℃静置培养以供检测；如需分选则将液滴接入1mL注射器内，30℃静置培养。
实施例四液滴中菌丝萌发情况及液滴稳定性的观测
将实施例一中获得的孢子悬液置于30℃静置培养，在不同时刻下(2h，4h，6h，8 h，10h，12h，24h)取部分菌液置于载玻片上制片，在显微镜20x物镜下观察(显微镜： LeicaDM5000B)。同时，将实施例三中获得的液滴置于30℃静置培养，在不同时刻下 (2h，4h，6h，8h，10h，12h，18h，24h，36h，2d，3d，6d，7d)取部分液滴观察，具体操作为：吸取液滴3-5μL置于血球计数板中，再吸取15-20μL液滴包埋用油于血球计数板中，使得油相充满整个血球计数板，并在显微镜20x物镜下观察。对比发现：孢子在液滴中可以正常萌发分化；在24h内，孢子在液滴中的萌发情况与在普通条件下相同(图4-A，B)；在1d以后，直到7d，菌丝团虽然基本填满液滴，但并未扎破液滴，液滴仍然稳定存在(图4-C)，为弹性选择分选时间提供了基础。
实施例五液滴中绿色荧光信号的观测
将实施例三中获得的液滴在不同培养时间下观测荧光信号，具体操作如下：吸取实施例三中制备的液滴3-5μL置于血球计数板中，再吸取15-20μL液滴包埋用油于血球计数板中，使得油相充满整个血球计数板，将上述制备的待镜检样品置于20x物镜下观察液滴的荧光情况。白场曝光时间为30ms，在相同视野下同时观察液滴的荧光情况，荧光激发波长488nm，吸收波长520nm，荧光场分别在曝光时间为10ms，30ms，50ms 下观察并拍摄。在12h至7d内，可以观察到液滴静置培养条件下孢子在液滴内可以正常萌发分化，液滴内的荧光信号可以被荧光显微镜检测到；根据不同时刻液滴荧光信号的强度，在24h液滴内的荧光信号强度最佳，确定今后实验的最佳检测和分选时刻为24 h(图4-C)。在检测和分选时刻下(24h)，各种不同强度启动子的菌株荧光信号可以观测到明显差异(图5)。并且实施例四已经验证，此时刻下液滴可以保持稳定，故符合检测和分选条件。
实施例六液滴微流控检测鉴定不同启动子强度
在分选时刻下(24h)，将包埋有实施例一中构建的9个不同启动子的绿色荧光信号阳性菌株——S.lividans/pSET152-hyg-Pgapdh(EL)-egfp(ATG)，S. lividans/pSET152-hyg-PrpsL(XC)-egfp(ATG)，S.lividans/pSET152-hyg-PrpsL(SG)-egfp(ATG)，S. lividans/pSET152-hyg-PrpsL(TP)-egfp(ATG)，S.lividans/pSET152-hyg-Perm*E-egfp(ATG)，S.lividans/pSET152-hyg-PrpS12-egfp(ATG)，S.lividans/pSET152-hyg-PgpmA-egfp(ATG)，S.lividans/pSET152-hyg-Ppyk-egfp(ATG)，S.lividans/pSET152-hyg-PrpoA-egfp(ATG)——的液滴分别进行绿色荧光检测，并以绿色荧光信号阴性菌株S. lividans/pSET152-hyg-PrpsL(XC)-egfp(ATG)作为对照。将各菌株荧光信号的强度作图，可以得出不同启动子强度的排序(图6)。用此方法可以高通量检测到在放线菌中有功能的启动子，或鉴定一些未知启动子的强度，并筛选到适宜强度的启动子元件用于后续的放线菌菌株改造。
实施例七液滴微流控分选绿色荧光信号阴阳性菌混库
将实施例三制得的液滴置于30℃培养箱培养24h。分选前，先分别检测空液滴，绿色荧光信号阴性菌株SLACG，以及绿色荧光信号阳性菌株SLATG的荧光信号值(图7A， B，C)，结果表明空液滴与SLACG荧光信号值差异不大，而SLATG的荧光信号值相较它们有明显提高，达到分选条件。分选时，设定液滴流速为20μL/h，油相流速为100 μL/h，液滴筛选速度为10-15个/s，分选阈值为液滴细胞信号最高的1％，偏转电压为700 V，每次收集约40个液滴于1.5mL无菌离心管中。
实施例八分选菌株的验证
将实施例七中经过分选收集的液滴涂布在含50μg/mL潮霉素的R2YE平板上，30℃培养3d待长出单菌落。之后将平板置于蓝光下照射，分别统计平板上发出绿色荧光的阳性菌落个数与不发出绿色荧光的阴性菌落个数，计算阳性富集率。阳性富集率的计算公式为：阳性富集率(％)＝[阳性菌落数/(阳性菌落数+阴性菌落数)]×100％。经过计算，在本发明中，绿色荧光信号阳性菌的富集率可从初始预混的3.1％提至高81.7％，阳性富集率提高至原来的26倍，如下表所示。
表3液滴微流控分选阳性富集率统计
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种使用液滴微流控芯片的高通量筛选方法在放线菌中的应用
<130> 1
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 2
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ctcgtcacca ccctgaccta cggcgtccag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
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<210> 3
<211> 671
<212> DNA
<213> 未知()
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atcacatggt cctgctggag ttcgtaaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 660
tgtacaagta a 671
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gctgctcctt cggtcggacg tgcgtctacg ggcaccttac cgcagccgtc ggctgtgcga 60
cacggacgga tcgggcgaac tggccgatgc tgggagaagc gcgctgctgt acggcgcgca 120
ccgggtgcgg agcccctcgg cgagcggtgt gaaacttctg tgaatggcct gttcggttgc 180
tttttttata cggctgccag ataaggcttg cagcatctgg gcggctaccg ctatgatcgg 240
ggcgttcctg caattcttag tgcgagtatc tgaaagggga tacgc 285
<210> 5
<211> 302
<212> DNA
<213> 未知()
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gccctgcagg cggaagtcag gtagacacga cttccgctag tccttgcaag gtctgctgac 60
gtgaggcggg gcggtcgttt ttgaccgccc tgccttcgtc atgtaggctc gctcgctgtg 120
cctggcgtgt catcagacgc ccaggtcccg gtgccgtgag gcccgggcca tcgagccggt 180
ggtacgtggc tgcggtcccc ttgtgagggc tgcgcgccgt gtgctgtccg gcgcgcacag 240
ccttgaatcc acccgcgggg gccggccggt ctccgtgagc tcgagtagac gacggagacg 300
ta 302
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<212> DNA
<213> 未知()
<400> 6
aggggcgcgc ggccccggcc gccggccgtc ccgtccgggg gcccgtggcc ggggcggtcc 60
cggcgtgtcg cggcggacag catttgtttt gacccagctc cgtgaggtag gtacgctcaa 120
gccttgtgcc tggggtgtgc ctgggctcgg gtgcgtgtcc tcaaccgcat cgcgagtccg 180
tcagtagcca ccgcaatctg cgcccttcct gccttcgggg cgggagtccg cagtattcga 240
cacacccgac cgcgtgggtc ggcgatgttc caggttagtt tcacgaacgg cacacagaaa 300
ccggagaagt a 311
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<212> DNA
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accgggtccg cgatcggcgg aggcgaacac ttttgaccac tatgagttca tccaggtaag 60
cttggtcgcc gtgcctggtg aatgccagga cgatcgctcg tgcccatact gcaggccgga 120
cctccgggac cacgtacgga cacgcgacac gcccgacctc ggggtacgtg cgaggcgggt 180
agctacttcc cggaaacggg actgaccagc agagacggcg aaagccggaa ctgccggtgg 240
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tct 363
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ggtacgcggc ttgcaggtcc aggaagggga cgtccatgcg agtgtccgtt cgagtggcgg 120
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ctgttgtggg ctggacaatc gtgccggttg gtaggacacc ac 282
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ctcgccgaac aggacaaagt gggatagagc gggcggcgat gccggtgtcg cccatttgtt 60
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ctggtcgggc gtcaaatagc gggcgcccct gactgaagga tcaccac 287
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