川楝氧化鲨烯环化酶MtOSC1及其编码基因与应用

文档序号：527094 发布日期：2021-06-01 浏览：2次 >En<

阅读说明：本技术 川楝氧化鲨烯环化酶MtOSC1及其编码基因与应用 (Szechwan chinaberry squalene oxide cyclase MtOSC1 and coding gene and application thereof ) 是由漆小泉廉旭凡薛哲勇刘云飞于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及三萜类化合物的生物合成途径,具体涉及川楝氧化鲨烯环化酶MtOSC1及其编码基因与应用。本发明提供的川楝氧化鲨烯环化酶MtOSC1,是如下a1或a2的蛋白质：a1.由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a2.将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的与川楝素生物合成相关的蛋白质。本发明首次克隆了川楝素生物合成途径中的环化酶,并通过烟草体外瞬时表达、GC-MS和核磁共振鉴定了该酶的产物,为深入解析川楝素生物合成途径奠定了基础。(The invention relates to a biosynthetic pathway of triterpenoids, in particular to toosendan oxidation squalene cyclase MtOSC1 and a coding gene and application thereof. The toosendan oxidation squalene cyclase MtOSC1 provided by the invention is a protein of a1 or a2 as follows: a1. a protein consisting of an amino acid sequence shown in a sequence 1 in a sequence table; a2. the protein related to the biosynthesis of toosendanin is formed by substituting and/or deleting and/or adding one or more amino acid residues in the amino acid sequence shown in the sequence 1 in the sequence table. The invention clones the cyclase in the toosendanin biosynthesis pathway for the first time, identifies the product of the cyclase through tobacco in vitro transient expression, GC-MS and nuclear magnetic resonance, and lays a foundation for deeply analyzing the toosendanin biosynthesis pathway.)

技术领域

本发明涉及三萜类化合物的生物合成途径，具体涉及川楝氧化鲨烯环化酶MtOSC1及其编码基因与应用。

背景技术

川楝素(toosendanin)是存在于楝科楝属植物中的特征性化合物，具有呋喃环的楝烷型三萜化合物，又被称为四降三萜类化合物(Tan and Luo,2011；Shi et al.2007)。其CAS登陆号为58812-37-6，分子式为C₃₀H₃₈O₁₁，相对分子质量为537.4。川楝素为白色固体粉末，熔点245℃，旋光度为-13.3°(c＝1.75，丙酮)。易溶于丙酮、甲醇、吡啶，微溶于氯仿、苯。

现代医学通过实验证明，川楝素具有杀菌、抗虫、消炎、抑癌、抗肿瘤、影响中枢神经细胞以及抑制呼吸中枢神经系统等作用(Zhang et al.,2019)。此外，川楝素也被开发为一种安全友好的植物源绿色农药(Isman,2006)。

川楝素属于三萜化合物，故根据三萜类化合物合成途径，可以推测川楝素生物合成途径主要分为三大部分：骨架形成、侧链环化、氧化重排(Tan and Luo,2011；姚立新，2003)。骨架形成以2,3-氧化鲨烯作为底物经2,3-氧化鲨烯环化酶(OSC)催化形成甘遂烷或大戟烷；之后在P450氧化酶以及还原酶的作用下，形成侧链环化产物柠檬苦素类化合物；再在氧化酶、还原酶以及乙酰化酶的催化作用下，经过多次氧化重排最终形成川楝素。目前，川楝素生物合成途径仍处于推测阶段，还没有得到实验验证。

发明内容

为弥补上述领域的不足，本发明提供川楝素生物合成途径中的第一步环化酶MtOSC1，该酶可以产生川楝素生物合成途径中的前体物质，为川楝素生物合成途径的研究奠定基础。

本发明提供的川楝氧化鲨烯环化酶MtOSC1，是如下a1或a2的蛋白质：

a1.由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

a2.将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的与川楝素生物合成相关的蛋白质。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下b1或b2的DNA分子：

b1.核苷酸序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

b2.在严格条件下与b1限定的DNA分子杂交的DNA分子。

含有所述编码基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物中化合物tirucalla-7,24-dien-3β-ol的含量发生改变。

所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pEAQ-HT-DEST1中得到的；所述出发植物为对照烟草；所述转基因植物为转基因烟草。

所述转基因烟草与对照烟草相比，产生了化合物tirucalla-7,24-dien-3β-ol。

所述蛋白、编码基因在调控川楝素生物合成途径中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明通过对川楝转录组数据进行分析，从川楝中克隆到了川楝氧化鲨烯环化酶基因MtOSC1，利用Gateway系统构建了MtOSC1烟草表达载体并进行烟草体外瞬时表达，通过GC-MS比较转基因烟草和对照烟草的提取物，找到了差异化合物，并通过核磁共振技术鉴定为tirucalla-7,24-dien-3β-ol，该化合物即川楝氧化鲨烯环化酶MtOSC1的产物。本发明首次克隆了川楝素生物合成途径中的环化酶基因并验证了其功能，为深入解析川楝素生物合成途径奠定了基础。

附图说明

图1.琼脂糖凝胶回收MtOSC1基因的电泳图片。

图2.烟草表达产物的GC-MS谱图：其中，(a)TIC，总离子流检测；EIC 393.300，特征离子393.300提取色谱谱图；红色箭头指示差异化合物。(b)差异化合物质谱图。Vector表示转入了pEAQ-HT-DEST1空载体的烟草叶片样品；MtOSC1表示转入了pEAQ-HT-DEST1-MtOSC1表达载体的烟草叶片样品；每个样品三次重复。

图3.MtOSC1烟草表达产物的核磁共振结果(氢谱)。

图4.MtOSC1烟草表达产物的核磁共振结果(碳谱)。

图5.MtOSC1酶产物的化学结构图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何形式限制本发明的范围。

生物材料：

本实验所用植物材料来自四川省成都市都江堰灵岩山川楝树，由中国科学院植物研究所的王飞博士鉴定为楝科楝属川楝(MeliaToosendan)，该物种记载在《中国植物志》以及童静玲.川楝子与苦楝子的鉴定.使用中医内科杂志，2005，5:476中。

本实验所用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)种子来自实验室保存，记载过本氏烟草的非专利文献是Ting H,et al.SNARE-RNAi results in higher terpeneemission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotianabenthamiana.Molecular Plant.2015；8:454–466。烟草瞬时表达实验中使用4～6周龄的烟草植株。

大肠杆菌DH5α菌株、农杆菌EHA105菌株均由本实验室保存，均为市售菌株，可商购获得。

上述生物材料本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

实验试剂：

快速通用植物RNA提取试剂盒：购自北京华越洋生物科技有限公司。

SuperScript^TMIII反转录试剂盒、BP Clonase II Mixture、LR Clonase IIMixture、Proteinase K：购自Invitrogen公司。

2×Q5 Mix：购自NEB(北京)有限公司。

DMSO，X-gal，IPTG，Coprostanol(粪醇)：购自Sigma公司。

pDONR207、pEAQ-HT-DEST1：由英国JIC中心赠送。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，2×Rapid ligation Buffer，pGEM-T easy vector，T₄ DNA ligase：购自康为世纪生物科技有限公司。

10×Ex Taq Buffer，Ex Taq，2×Taq Mix，GenStar质粒小提试剂盒(StarPrepPlasmid Miniprep Kit)：购自GenStar康润生物公司。

NaAC、乙醇、KOH、乙酸乙酯、CDCl₃：购自北京化工厂和上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

TLC板：Merck KGaA，Silicagel 60F₂₅₄ TLC。

硅胶柱：Biotage，规格为25g，5g。

Inoue缓冲液(250mL)：四水合氯化锰2.72g，二水合氯化钙0.55g，氯化钾4.6625g，PIPES(0.5M,pH6.7)5mL。

MMA buffer(1L)：2g MES，2g六水合氯化镁，1mL 0.1M乙酰丁香酮溶液。

LB培养基：在950ml ddH₂O中溶解10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后用NaOH调节pH为7.4，用ddH₂O定容至1L。若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。

YEB培养基配方(1L)：5g胰蛋白胨、1g酵母提取物、5g牛肉浸膏、0.5g MgSO₄、5g蔗糖，pH7.0。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册，例如分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell DW，Molecular cloning:a laboratorymanual，2001)，或制造厂商说明书。

实施例1.川楝氧化鲨烯环化酶基因(MtOSC1)克隆

1、川楝总RNA提取

采用华越洋的快速通用植物RNA提取试剂盒(Quick RNA Isolation Kit)，按照试剂盒说明书记载的方法提取川楝果实总RNA，步骤如下：

(1)取川楝果实于液氮中迅速研磨成粉末，用离心管装取5mg粉末样品，然后加入1ml细胞裂解液A，涡旋，再加入100μLβ-巯基乙醇，漩涡震荡30s使其充分裂解。

(2)再往离心管中加入300μL的去蛋白液B和200μL的氯仿，震荡30s使其充分混匀(管底溶液必须漩起)，呈乳浊状，室温放置两分钟。该步骤非常重要。

(3)室温12,000rpm离心10min，两相间约有5mm厚的细胞破碎物。将上清转移到另一干净的1.5mL离心管中，避免触及或吸取中层和下层。

(4)加入等体积的漂洗液C，充分颠倒混匀。将所得溶液包括沉淀分三次加入同一离心吸附柱中，每次加入后都进行12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

(5)向吸附柱中加入500μL洗柱液D，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。再加入500μL洗柱液D，重复两次。室温12,000rpm离心1min以便除去残留的液体。

(6)膜上消化DNA：将5μL的RNase-free DNaseⅠ与45μL DNase buffer混匀配成DNA消化液，37℃预热消化液1min，加入到离心吸附柱中室温放置7min；直接在离心吸附柱中加入500μL去酶液E，盖上盖后颠倒混匀数次，室温12,000rpm离心1min，再加入新的去酶液E重复此步骤一次；室温离心2min，倒掉收集管中废液，吸附柱室温晾干无水乙醇。

(7)RNA洗脱：将离心吸附柱转移到RNase-free 1.5mL离心管中，加入30μL RNA洗脱液F，室温放置3min，12,000rpm离心1min，将洗脱液重新上柱，室温洗脱3min离心。

(8)RNA质量检测：分别用1％琼脂糖凝胶、Nanodrop分光光度计检测RNA的提取质量和提取浓度。

经Nanodrop分光光度计检测，获得了浓度为120ng/μL的川楝果实总RNA溶液。

2、总RNA反转录

采用Invitrogen公司SuperScript^TMIII反转录试剂盒，按照试剂盒说明书记载的方法对步骤1获得的总RNA进行反转录，步骤如下：

(1)将以下试剂按顺序加入PCR管中，轻柔混匀并短暂离心。

65℃反应5min，立即冰浴3min。

(2)在冰上依次加入以下溶液，配置反转录体系：

50℃反应1h，时间可适当延长。

(3)70℃失活15min，终止反应，获得cDNA溶液，取1μL用1％琼脂糖凝胶检测反转录效果，剩余溶液保存于-20℃。

3、基因克隆

(1)引物设计

将步骤1获得的川楝果实总RNA送北京诺禾致源科技股份有限公司进行转录组测序，获得三代测序信息。以测序信息为基础，用拟南芥的13条OSC基因序列(Genebank号分别是NM_001334261，NM_001334828，NM_001334856，NM_148667，NM_001334862，NM_001334865，NM_126681，NM_114382，NM_117622，NM_117625，NM_001344127，NM_123624，NM_001085264)进行比对，找到了一条完整的OSC基因序列，命名为MtOSC1，其核苷酸序列如序列2所示，编码的氨基酸序列如序列1所示。根据引物设计原则，利用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件设计MtOSC1基因的克隆引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物的核苷酸序列如下(5’-3’)：

MtOSC1-F:AGAGAAGATGTGGAAGCTGAAGATT；

MtOSC1-R:CTTTATTTTAATTAGGCAATGGAACTTT。

(2)基因克隆

以上述反转录得到的cDNA为模板，按照下列PCR反应体系和程序扩增目的片段。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

其中，温度梯度设置为：48-58℃。PCR反应结束后，取1μL反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小是否正确。

(3)克隆基因胶回收

使用康为世纪的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对正确的目的条带进行胶回收，步骤如下：

(a)电泳：2％琼脂糖凝胶电泳区分DNA条带。

(b)切胶：条带充分分开后，在紫外灯下迅速切下条带并称重。

(c)溶胶：按照W/V＝1:100加入溶胶液，50℃水浴15min，期间不断晃动，直到胶块完全溶解。若胶块不能完全溶解，可适当添加溶胶液或延长溶胶时间。

(d)DNA柱吸附：待融化的胶块冷却到室温后，将溶液转移到离心吸附柱内，静置2min，室温12,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱重新插入到回收管内。

(e)漂洗：取600μL漂洗液加入离心吸附柱内，室温12,000rpm离心1min，弃废液。重复一次，室温12,000rpm离心2min彻底去除漂洗液。

(f)洗脱：将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附柱中央加入40μL洗脱缓冲液，室温静置5min，12,000rpm离心2min。

(g)凝胶检测：1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并估算基因浓度。

电泳检测结果如图1所示，获得了全长2283bp的基因条带，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，测序结果与MtOSC1基因序列一致。

实施例2.MtOSC1烟草体外瞬时表达载体的构建

1、T载体构建

(1)加A反应和连接反应

加A反应体系：

37℃孵育30min，得到加A产物，然后置于冰上。

pGEM-T EASY载体连接体系：

4℃过夜连接。

(2)大肠杆菌DH5α感受态细胞制备

取保存于-80℃的大肠杆菌菌株，划板于不含任何抗生素的LB固体培养基上，37℃培养12h。挑取单菌落于不含任何抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养10h。取2mL菌液接种于200mL LB液体培养基中，18℃，200rpm摇床培养至OD₆₀₀为0.5-0.6，大约20h。将摇好的菌液于冰上静置30min，分装于4个预冷的50mL离心管中，4℃，4,500rpm离心10min，弃上清。每管加入16mL预冷的Inoue缓冲液洗涤菌液，4℃，4,500rpm离心10min，弃上清。再分别加入8mL预冷的Inoue缓冲液轻轻悬起菌体，两管合并，4℃，4,500rpm离心10min，弃上清收集菌体。再加入3.72mL预冷的Inoue缓冲液，轻悬起菌体，并缓缓向菌液中加入预冷的DMSO溶液280μL，轻拍混匀，冰上静置30min后，分装于1.5mL离心管中，每管70μL，并迅速至于液氮中冷冻，储存于-80℃冰箱中。

(3)转化

取保存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化。加入5μL上述连接好的T载体，柔和混匀，静置于冰上30min。42℃热激90s，冰上放置2min。加入450μL不含任何抗生素的LB液体培养基，37℃，180rpm活化1h。在含100μg/ml Amp⁺的固体LB培养基中，分别加入40μL X-gal和8μL IPTG，涂匀至吸收。将活化好的大肠杆菌4,500rpm离心2min，取100μL涂于平板上，37℃过夜培养。

(4)阳性菌落鉴定

从上述固体LB培养基中挑取单菌落于500μL含100μg/ml Amp⁺的液体LB培养基中，37℃，200rpm活化3h。然后按照下述体系和方法进行菌液PCR，鉴定阳性克隆。PCR引物如下：

M13-F：CGCCAGGGTTTTCCAGTCAAGAC；

M13-R：CACACAGGAAACAGTATGAC。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

PCR反应结束后，取5μL反应产物溶液用1％琼脂糖凝胶检测目的基因条带大小是否正确，并选择阳性菌落的菌液，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

(5)提取质粒

选取测序结果正确的阳性菌落，将200μL菌液接种于10mL含100μg/ml Amp⁺的LB液体培养基中，37℃200rpm过夜培养。取600μL菌液与600μL 60％甘油混合，保菌。剩余菌液采用GenStar质粒小提试剂盒，按照试剂盒使用说明书记载的方法提取质粒，具体步骤如下：

收菌：将菌液用2mL离心管收菌，每管4mL，室温，12,000rpm离心1min，弃上清。

重悬：吸弃离心管中残留菌液，加入250μL含有RNase的细胞悬浮液，充分混旋使菌体彻底悬浮。

裂解：加入250μL细胞裂解液，轻轻上下颠倒混匀，此时溶液呈半透明状。

中和：加入350μL中和缓冲液，轻轻上下颠倒使其充分混匀，室温，12,000rpm离心15min。

DNA结合：小心将上清转移至带有离心管的离心吸附柱中，室温，12,000rpm离心1min，弃除滤液，将离心吸附柱重新放入离心管中。

漂洗：向吸附柱中加入500μL漂洗液，室温，12,000rpm离心1min，弃除滤液，将离心吸附柱重新放入离心管中。重复一次，12,000rpm离心2min，彻底除去柱中残留液体。

洗脱：将离心吸附柱转移至1.5mL离心管中，向柱中央加入80μL洗脱缓冲液，室温放置2min，12,000rpm离心2min收集质粒。

凝胶检测：1％琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒质量，并估算浓度。

经检测，获得了浓度为150ng/mL的pGEM-T-MtOSC1质粒溶液，将该溶液稀释10倍，进行后续重组接头扩增。

2、重组接头基因克隆

(1)重组接头引物设计

根据MtOSC1的基因序列，设计带有重组接头的引物，引物序列如下：

RR-MtOSC1-F：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGAGAAGATGTG；

RR-MtOSC1-R：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTTATTTTAATT。

(2)重组接头基因克隆

PCR反应体系：

PCR反应程序：

其中，温度梯度设置为48-58℃。PCR反应结束后，取1μL反应产物溶液用1％琼脂糖凝胶进行检测。

(3)PCR产物回收-乙醇回收法

若克隆产物条带较为单一，则可以采用乙醇沉淀回收法进行回收，具体步骤如下：

A、在反应产物中加入1/10体积的pH＝5.2的1M NaAC溶液，再加入3倍体积的无水乙醇，液氮速冻30s。

B、4℃，12,000rpm离心30min，弃上清。

C、加入1mL 75％乙醇溶液洗涤沉淀，4℃，12,000rpm离心30min，弃上清。重复一次。

D、小心用枪头吸干管底残留液体，于通风处晾干。

E、用20μL ddH₂O溶解DNA沉淀，得到RR-MtOSC1溶液，取1μL进行电泳检测并估算浓度。

3、BP反应及转化

(1)BP反应

25℃孵育10h。

Proteinase K 1μL

37℃孵育10min，得到重组产物pDONR207_MtOSC1，置于冰上。

(2)转化

取保存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化。加入5μL上述重组产物pDONR207_MtOSC1，柔和混匀，静置于冰上30min。42℃热激90s，冰上放置2min。加入450μL不含任何抗生素的LB液体培养基，37℃，180rpm活化1h。将活化好的大肠杆菌3,000rpm离心1min，去除400μL上清，重悬菌液并将其全部涂于含50μg/ml Gen⁺(硫酸庆大霉素)的LB固体平板，37℃过夜培养。

(3)阳性菌落鉴定

从上述LB固体平板上挑取单菌落于500μL含50μg/ml Gen⁺的液体LB培养基中，37℃，200rpm活化3h。然后按照下述体系和方法进行菌液PCR，鉴定阳性克隆。PCR引物如下：

pDONR-F：TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC；

pDONR-R：GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

PCR反应结束后，取5μL反应产物溶液用1％琼脂糖凝胶检测目的基因条带大小是否正确，并选择阳性菌落菌液委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

(4)质粒提取

选择测序正确的菌液，取200μL小摇菌液于10mL含50μg/ml Gen⁺的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。取600μL菌液与600μL 60％甘油混合，保菌。剩余菌液采用GenStar质粒小提试剂盒，按照试剂盒使用说明书记载的方法提取质粒，详细步骤参见本实施例步骤1(5)。

4、LR反应及转化

(1)LR反应体系：

25℃孵育10h。

Proteinase K 1μL

37℃孵育10min，得到重组产物pEAQ-HT-DEST1-MtOSC1，置于冰上。

(2)转化

取保存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化。加入5μL上述重组产物pEAQ-HT-DEST1-MtOSC1，柔和混匀，静置于冰上30min。42℃热激90s，冰上放置2min。加入450μL不含任何抗生素的LB液体培养基，37℃，180rpm活化1h。将活化好的大肠杆菌3,000rpm离心1min，去除400μL上清，重悬菌液并将其全部涂于含有100μg/ml Kan⁺的固体LB平板，37℃过夜培养。

(3)阳性菌落鉴定

从上述固体LB平板上挑取单菌落于500μL Kan⁺(100μg/ml)液体LB培养基中，37℃，200rpm活化3h。然后按照下述体系和方法进行菌液PCR，鉴定阳性克隆。PCR引物如下：

DEST1-M13-F：CTTGCTGAAGGGACGACCTGCTAAA；

DEST1-M13-R：TAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTG。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

PCR反应结束后，取5μL反应产物溶液，用1％琼脂糖凝胶检测目的基因条带大小是否正确，并选择阳性菌落的菌液，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

(4)质粒提取

选择测序正确的菌液，取200μL小摇菌液于10mL含100μg/ml Kan⁺的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。取600μL菌液与600μL 60％甘油混合，保菌。剩余菌液用GenStar质粒小提试剂盒，按照试剂盒使用说明书记载的方法提取质粒，详细步骤参见本实施例步骤1(5)。

实施例3.烟草体外瞬时表达

1、农杆菌EHA105感受态细胞制备

(1)取保存于-80℃的农杆菌菌株EHA105，划板于含有50μg/ml Rif⁺抗生素的YEB固体培养基上，28℃培养2d。

(2)挑取单菌落于含有50μg/ml Rif⁺抗生素的YEB液体培养基中，28℃，200rpm培养1d。

(3)取2mL菌液接种于200mL含有50μg/ml Rif⁺抗生素的YEB液体培养基中，28℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。

(4)将摇好的菌液分装于4个预冷的50mL离心管中，4℃，4,500rpm离心10min，弃上清。

(5)每管加入与原始菌液等体积预冷无菌ddH₂O洗涤菌液，4℃，4,500rpm离心10min，弃上清。

(6)再分别加入1/2原始菌液等体积预冷无菌ddH₂O洗涤菌液，4℃，4,500rpm离心10min，弃上清收集菌体。重复一次。

(7)再加入1/100原始菌液等体积预冷无菌10％甘油，轻悬起菌体，分装于1.5mL离心管中，每管70μL，并迅速置于液氮中冷冻，-80℃冰箱储存。

2、烟草体外瞬时表达载体转化

设置对照组和实验组，对照组采用pEAQ-HT-DEST1空载体转化农杆菌，实验组采用pEAQ-HT-DEST1-MtOSC1表达载体转化农杆菌。

农杆菌转化方法如下：

(1)从-80℃冰箱中取出农杆菌EHA105感受态细胞置于冰上，在感受态细胞刚刚融化时加入1-2μL表达载体，混合均匀后置于冰上。

(2)从75％酒精中取出电击杯，用无水乙醇润洗1-2次置于超净台中晾干，冰浴预冷备用。

(3)用移液器将混好的感受态细胞载体溶液沿电击杯边缘加入到两电击板之间，轻拍使其沉降至底部并保证两电击板之间无气泡。

(4)将电击杯放入转化仪，设置1,800V恒定电压电击。

(5)电击完成后，用移液器加入1mL未加任何抗生素的YEB培养基，轻轻悬起菌液并转入1.5mL无菌管中，28℃，150rpm低速震荡培养3-4h。

(6)将转化产物涂布于添加含有50μg/ml Rif⁺、100μg/ml Kan⁺抗生素的YEB固体培养基上，28℃培养2-3d待菌落长出。

3、菌落阳性鉴定

从上述YEB固体培养基上挑取单菌落于含有50μg/ml Rif⁺、100μg/ml Kan⁺抗生素的YEB液体培养基中，28℃，250rpm培养1d。按照下列体系和程序进行菌液PCR，鉴定菌落是否为阳性。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

4、菌液扩大培养及转化

(1)将测序正确的阳性菌落的菌液划线培养，挑取单菌落于含有50μg/ml Rif⁺、100μg/ml Kan⁺抗生素的YEB液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养至对数期。

(2)吸取步骤(1)培养的菌液0.5mL，转移到50mL含相同抗生素的液体培养基中，继续震荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右。

(3)将菌液转移至50mL离心管中，4,000rpm离心10min，收集菌液。

(4)去除上清，用MMA buffer缓冲液重悬菌液并调节OD₆₀₀＝0.2，用一次性注射器吸取1mL菌液，取针头在烟草叶片上轻刺2-3个小孔，将注射器压在针孔部位，以手指抵住叶片下部，轻轻用力将注射器内的菌液压送并渗透到叶片组织中，用标记笔在注射部位做好标记。经注射的烟草植株在25℃下，在14h光照和10h黑暗的光周期下培养七天，然后剪取转基因烟草叶片进行化合物测定。其中，采用pEAQ-HT-DEST1空载体-EHA105菌液注射烟草叶片，培养得到对照烟草；采用pEAQ-HT-DEST1-MtOSC1-EHA105菌液注射烟草叶片，培养得到MtOSC1转基因烟草。

实施例4.MtOSC1烟草表达产物分析

1、烟草表达产物的提取

按照如下方法，分别提取实施例3获得的对照烟草和MtOSC1转基因烟草叶片中的化合物：

(1)配制皂化试剂乙醇：水：KOH(固体)＝9ml：1ml：1g，加入Coprostanol作为内标，终浓度为10ng/mL。

(2)将烟草叶片冻干并研磨成粉末，取5mg粉末样品于离心管中，加入500μL皂化试剂。

(3)75℃反应1h，期间不断摇晃，打开盖子注意液体喷溅，将剩余液体特别是乙醇挥发干净。

(4)加入500μL乙酸乙酯于样品中，涡旋提取。

(5)再加入500μL水，再次涡旋。

(6)8,000rpm离心1min，转移上清于进样瓶中蒸干，得到提取物。

2、烟草表达产物的分析

(1)用500μL乙酸乙酯溶解上述步骤1的提取物，取100μL于带有衬管的进样瓶中，氮吹干后加入30μL衍生化试剂1-(Trimethylsilyl)imidazole-Pyridine mixture(纯试剂，购买自Sigma公司)，70℃反应30min。

(2)用GC-QQQ-MS平台对衍生化样品进行分析，GC-QQQ-MS平台为Agilent GC7890B和Agilent MS 5977A；EI源电离方式；色谱柱为DB-5HT(30m×0.32mm，0.1μm filmthickness，Agilent)。载气为氦气，流速为3.0mL/min。进样口温度250℃。升温程序为170℃保持2min，6℃/min升温至290℃保持4min，10℃/min升温至340℃保持0min。进样量为1μL，不分流。MS检测器在标准电子冲击条件为70eV下，以3.9次/s的速度扫描，扫描区间为60-800。

(3)GC-MS(Gas chromatography-mass spectrometry)结果用Agilent分析软件Qualitative Analysis B.0600进行化合物定性和定量分析。

从GC-MS检测结果可以看到，MtOSC1转基因烟草与对照烟草相比，产生了一种差异化合物，该化合物的出峰时间为22.08min，特征离子为393.300、483.400(图2)。

3、MtOSC1烟草表达产物的分离鉴定

(1)化合物分离

研磨大量收获的MtOSC1转基因烟草叶片，加入适量的乙酸乙酯进行化合物提取，重复三次，每次3h。将提取液合并旋干，用二氯甲烷溶解，然后加入300目硅胶约0.5g，于通风橱中晾干。使用中低压对提取物进行分离，硅胶柱规格为25g，流动相是乙酸乙酯/正己烷(梯度洗脱4％-10％)，流动相流速为100mL/min。用TLC板对各组分进行检测，并确认目的化合物所在组分。根据检测结果合并相似组分，旋干，用二氯甲烷溶解，并再次过硅胶柱。硅胶柱规格为5g，流动相是乙酸乙酯/正己烷(等度洗脱2％)，流动相流速为25mL/min。获得较为单一的各组分，再用GC-MS对目的化合物的纯度进行检测，若目的化合物的纯度在95％以上，即可合并旋干送样，进行核磁共振分析(NMR,Nuclear Magnetic Resonance)。

(2)化合物鉴定

将样品用CDCl₃溶解，加入核磁管，由首都医科大学中心实验室应用Bruker800MHz核磁共振波谱仪对纯化的化合物进行分析，获得了对应的氢谱(图3)和碳谱(图4)。

氢谱和碳谱数据如下：

根据氢谱和碳谱信息对目的化合物的结构进行解析，获得了MtOSC1酶的产物结构(图5)，化学名称为tirucalla-7,24-dien-3β-ol(甘遂-7,24-二烯醇)。

序列表

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 川楝氧化鲨烯环化酶MtOSC1及其编码基因与应用

<130> P190902-ZWY

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 760

<212> PRT

<213> 川楝(Melia toosendan)

<400> 1

Met Trp Lys Leu Lys Ile Ala Glu Gly Asp Lys Asn Ser Pro Tyr Ile

1 5 10 15

Phe Thr Thr Asn Asn Phe Val Gly Arg Gln Ile Trp Glu Phe Asp Pro

20 25 30

Asn Ala Gly Thr Ala Glu Glu Leu Ala Glu Val Glu Glu Ala Arg Gln

35 40 45

Asn Phe Tyr Lys Asn Arg His Gln Val Lys Pro Ala Ser Asp Leu Ile

50 55 60

Phe Arg Leu Gln Phe Leu Arg Glu Lys Asn Phe Lys Gln Thr Ile Pro

65 70 75 80

Gln Val Lys Val Glu Asp Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Thr Ala Thr

85 90 95

Ala Ala Met Lys Arg Ala Ala His Tyr Phe Ser Ala Ile Gln Ala Gly

100 105 110

Asp Gly His Trp Pro Ala Glu Asn Ser Gly Pro Met Tyr Phe Leu Pro

115 120 125

Pro Phe Ile Phe Ser Leu Tyr Ile Thr Gly His Leu Asp Thr Val Phe

130 135 140

Thr Ala Ala His Arg Arg Glu Val Leu Arg Tyr Leu Tyr Asn His Gln

145 150 155 160

His Glu Asp Gly Gly Trp Gly Ile His Ile Glu Gly Pro Ser Ser Met

165 170 175

Phe Gly Thr Val Tyr Ser Tyr Leu Thr Met Arg Leu Leu Gly Leu Gly

180 185 190

Pro Asn Asp Gly Glu Asn Asn Ala Cys Ala Arg Ala Arg Lys Trp Ile

195 200 205

Arg Asp Asn Gly Gly Val Thr Tyr Ile Pro Ser Trp Gly Lys Asn Trp

210 215 220

Leu Ser Ile Leu Gly Leu Phe Glu Trp Ala Gly Thr His Pro Met Pro

225 230 235 240

Pro Glu Phe Trp Met Leu Pro Ser Tyr Phe Pro Leu His Pro Ala Gln

245 250 255

Met Trp Cys Phe Cys Arg Leu Val Tyr Met Pro Leu Ser Tyr Leu Tyr

260 265 270

Gly Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Leu Ile Lys Gln Leu Arg

275 280 285

Glu Glu Leu His Thr Glu Pro Tyr Asp Gln Ile Asn Trp Arg Lys Val

290 295 300

Arg His Leu Cys Ala Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr Pro His Pro Phe Val

305 310 315 320

Gln Asp Val Leu Trp Asp Thr Leu Tyr Leu Ala Thr Glu Pro Leu Leu

325 330 335

Thr Arg Trp Pro Leu Asn Lys Tyr Leu Arg Glu Lys Ala Leu Lys Gln

340 345 350

Thr Met Lys Ile Ile His Tyr Glu Asp Gln Ser Ser Arg Tyr Ile Thr

355 360 365

Ile Gly Cys Val Glu Lys Pro Leu Cys Met Leu Ala Cys Trp Val Glu

370 375 380

Asp Pro Glu Gly Val Ala Phe Lys Lys His Leu Glu Arg Ile Ala Asp

385 390 395 400

Phe Ile Trp Ile Gly Glu Asp Gly Met Lys Val Gln Thr Phe Gly Ser

405 410 415

Gln Thr Trp Asp Thr Ala Leu Gly Leu Gln Ala Leu Leu Ala Cys Asn

420 425 430

Ile Val Asp Glu Ile Gly Pro Ala Leu Ala Lys Gly His Asp Tyr Leu

435 440 445

Lys Lys Ala Gln Val Arg Asp Asn Pro Val Gly Asp Tyr Thr Ser Asn

450 455 460

Phe Arg His Phe Ser Lys Gly Ala Trp Thr Phe Ser Asp Gln Asp His

465 470 475 480

Gly Trp Gln Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ser Leu Lys Cys Cys Leu

485 490 495

His Phe Ser Met Leu Pro Arg Glu Ile Val Gly Glu Lys His Asp Pro

500 505 510

Glu Arg Leu Tyr Glu Gly Val Asn Phe Ile Leu Ser Leu Gln Asp Lys

515 520 525

Asn Gly Gly Leu Ala Val Trp Glu Lys Ala Gly Ala Ser Leu Leu Leu

530 535 540

Glu Trp Leu Asn Pro Val Glu Phe Leu Glu Asp Leu Ile Val Glu His

545 550 555 560

Thr Tyr Val Glu Cys Thr Ala Ser Ala Ile Glu Ala Phe Val Met Phe

565 570 575

Lys Lys Leu Tyr Pro His His Arg Lys Lys Glu Ile Glu Asn Phe Leu

580 585 590

Val Lys Ala Val Gln Tyr Ile Glu Asn Glu Gln Thr Ala Asp Gly Ser

595 600 605

Trp Tyr Gly Asn Trp Gly Val Cys Phe Leu Tyr Gly Thr Cys Phe Ala

610 615 620

Leu Gly Gly Leu His Ala Ala Gly Lys Thr Tyr Asn Asn Cys Leu Ala

625 630 635 640

Ile Arg Arg Ala Val Glu Phe Leu Leu Gln Ala Gln Ser Asp Asp Gly

645 650 655

Gly Trp Gly Glu Ser Tyr Lys Ser Cys Pro Ser Lys Ile Tyr Val Pro

660 665 670

Leu Asp Gly Lys Arg Ser Ser Val Val His Thr Ala Leu Ala Val Leu

675 680 685

Gly Leu Ile His Ala Gly Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr Pro Ile His

690 695 700

Arg Gly Val Lys Leu Leu Ile Asn Ser Gln Leu Glu Asn Gly Asp Phe

705 710 715 720

Pro Gln Gln Glu Ile Met Gly Val Phe Met Arg Asn Ser Met Leu His

725 730 735

Tyr Ala Gln Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Leu Trp Ala Leu Ala Glu Tyr

740 745 750

Arg Arg Lys Val Pro Leu Pro Asn

755 760

<210> 2

<211> 2283

<212> DNA

<213> 川楝(Melia toosendan)

<400> 2

atgtggaagc tgaagattgc agagggagac aaaaatagcc catatatttt tacaacaaac 60

aatttcgttg gaaggcaaat atgggaattt gatccgaatg ctggaactgc tgaagagctt 120

gctgaagttg aagaagctcg tcagaatttc tacaagaatc gccatcaagt caagcctgct 180

agtgacctta tttttcgtct tcagtttctt agagagaaaa acttcaagca aacgattcct 240

caagtgaagg ttgaagatgg ggaggaaatc acatatgaca ctgctacagc agcaatgaag 300

agggctgctc actacttctc agcgattcag gctggcgatg gccattggcc tgctgaaaat 360

tctggcccta tgtatttcct tcctccattt atattcagct tgtacattac aggacatctt 420

gatactgtat ttacagctgc tcatcgcaga gaagtccttc gttacttata caatcatcag 480

catgaagatg gagggtgggg aatacacata gaaggaccaa gcagtatgtt tggtacagtt 540

tacagttatc ttacaatgcg tttgctgggg ttaggaccca acgatggtga aaacaatgcc 600

tgtgctagag ctagaaagtg gattcgtgat aatggtggtg tcacttacat tccctcttgg 660

ggaaagaatt ggctttcgat tcttggattg tttgaatggg ctggaacaca cccaatgccc 720

ccagagttct ggatgcttcc ttcttatttt ccacttcatc cagcccaaat gtggtgcttc 780

tgccggctgg tttacatgcc cttgtcttat ttatacggca aaagatttgt tggtccaatc 840

actccactta tcaaacaact cagagaagaa cttcacacag agccttacga tcaaatcaac 900

tggaggaaag ttcgtcatct atgtgcgaag cctgatctct actacccaca tccattcgta 960

caagacgttc tatgggatac tctatacttg gctacagagc ctctgcttac tcgttggcca 1020

ttgaacaagt atctcagaga gaaggctttg aaacaaacga tgaagatcat tcattatgaa 1080

gaccaaagca gtcgatacat tactattggc tgcgtcgaga agccgttgtg tatgcttgct 1140

tgttgggtgg aggatcctga gggggttgct ttcaagaagc atcttgagag aattgctgat 1200

tttatttgga ttggagaaga tggaatgaaa gttcagacat ttggtagtca aacatgggat 1260

actgctcttg gtcttcaagc tttgcttgct tgcaatatcg ttgatgaaat tggaccagca 1320

ctcgctaaag gacacgacta cttgaagaaa gctcaggtga gggataatcc agtgggtgat 1380

tatacaagca atttccgtca cttttctaaa ggagcatgga ctttctctga tcaagatcat 1440

ggttggcaag tttcagattg tactgcagaa agtttgaagt gctgcttgca tttctcaatg 1500

ctgcctcgag aaattgttgg agagaaacat gatcctgaga gattatatga aggtgtcaat 1560

ttcatactct ctcttcagga taaaaatggt ggattagcag tttgggagaa agctggtgcc 1620

tctttgttgt tagagtggct caatcctgta gagtttctgg aggaccttat tgttgagcat 1680

acttatgtgg agtgcactgc ttcagcaatc gaggcatttg ttatgttcaa gaaattatac 1740

ccacatcatc gcaagaagga gattgaaaat ttcctcgtaa aagctgtaca gtacattgaa 1800

aatgagcaaa ctgctgatgg ctcatggtat ggaaactggg gagtttgctt cttatatgga 1860

acatgttttg cacttggagg attacatgct gctggaaaga cttacaacaa ttgtcttgcc 1920

attcgtagag cagttgaatt tctgctccaa gcacagagtg atgatggtgg ttggggagag 1980

agctacaaat cttgccctag taagatatat gtacctcttg atggaaaaag atcaagtgtg 2040

gtacacactg cattggctgt tcttggttta attcatgctg ggcaggctga aagagaccca 2100

acacctattc atcgtggtgt aaaattgctg atcaactctc aattggagaa tggagacttc 2160

cctcaacagg aaattatggg agtttttatg agaaactcta tgttacacta tgctcaatac 2220

aggaatattt ttcctttgtg ggctttagcc gaatatagaa gaaaagttcc attgcctaat 2280

taa 2283

<210> 3

<211> 25

<212> DNA