具体实施方式

以下内容提供了不同的实施例或范例，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。当然，这些仅仅是范例，而非意图限制本发明。在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应当被视为在本文中具体公开。

图1示出了本发明一个实施方式的玉石体外药效评价方法的流程示意图；图2示出了本发明一个实施方式的利用transwell小室进行玉石体外药效评价的结构示意图。结合图1和图2所示，本发明提供一种玉石体外药效评价方法，包括：提供一transwell小室，包括上室100和下室200；于下室200加入细胞300和培养基400，于上室200加入含玉石的溶液500，静置进行药物孵育；及取出上室100，检测下室200内的细胞活性，计算细胞活率。

根据本发明，目前有越来越多的研究表明，玉石不仅具有保健功效，还具有一定的药学功效，提供一种有效的检测方法，以研究玉石的作用机制是本领域亟待解决的问题。在涉及药物对细胞作用检测时，一般是将细胞接种至细胞培养板后，药物直接与细胞接触，然后利用MTT、CCK-8检测细胞活性。然而，由于需要检测的玉石成分复杂，较难提取获得浸出物，一般的检测方法导致颗粒物直接与细胞接触，一方面影响细胞的状态，另一方面颗粒物吸附在板底很难清洗，影响检测结果。为此，本发明的发明人发现，通过利用transwell小室构建玉石体外药效评价模型，可以有效评价玉石的体外药物活性。

下面结合图1和图2具体说明本发明一个实施方式的进行玉石体外药效评价的方法。

首先，提供一transwell小室。如图2所示，该transwell小室包括上室100和下室200，其中上室100的底部为交换膜101，交换膜101的材质可以为聚碳酸酯(PET)膜，交换膜的孔径为0.4μm～8μm，优选为0.4μm。

接着，培养细胞，并将培养好的细胞300置于含有培养基400的下室200。优选地，下室200内的细胞浓度为2.5×10⁴～1.25×10⁵cell/mL，细胞铺板体积为400μL。培养基可以为本领域常用的细胞培养基，例如，DMEM培养基、MEM培养基、RPMI-1640培养基等，本发明不限于此。

进一步地，于上室200加入含玉石的溶液500，静置进行药物孵育。优选地，将玉石研磨成目数为200的玉石粉，再溶于对应细胞培养用的培养基中，得到前述的含玉石的溶液500。

根据本发明，玉石是一种成分较为复杂的天然矿石，其主要成分包括硒、锶等微量元素中的一种或多种。将玉石置于水中，随着时间的延长会有有效成分浸出，例如含硒、锶等化合物，本发明将玉石药物作用检测和transwell小室技术结合，通过配制与下室200的细胞浓度相应的含玉石的溶液500加入上室100进行共孵育，可保证玉石浸出后的药物有效成分能够通过上室100的交换膜101进入下室200，从而对细胞300发挥作用。同时，由于交换膜101的孔径限制，还可拦截上室100内的较大颗粒难溶物，从而避免颗粒物影响细胞状态，或吸附在上室底部而对结果造成影响。

具体而言，上室中玉石的浓度一般为1mg/mL～120mg/mL，例如，1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、120mg/mL等。当采用不同的细胞、不同的细胞浓度时，玉石优选的浓度范围也有所不同。例如，当所选用的细胞为人成神经细胞瘤细胞时，细胞浓度为1.25×10⁵cell/mL时，优选地，控制玉石的最终作用浓度为25mg/mL～116.7mg/mL。再比如黑色素瘤细胞浓度为2.5×10⁴cell/mL，控制玉石的最终作用浓度为100mg/mL～120mg/mL；人正常甲状腺细胞浓度为1.25×10⁵cell/mL，控制玉石的最终作用浓度为4mg/mL～116.7mg/mL；人小气道上皮细胞细胞浓度为1.25×10⁵cell/mL，控制玉石的最终作用浓度为4mg/mL～50mg/mL等。

在一些实施例中，静置进行药物孵育的时间为24h～72h，例如24h、48h、50h、52h、60h、65h、70h、72h等。药物孵育的时间不宜过短，否则无法实现玉石成分的有效浸出，也不宜过长，否则不能准确判断药物对细胞的影响，优选为72h。

最后，取出上室100，检测下室200内的细胞活性，计算细胞活率。

具体地，一般在前述药物孵育结束前取出上室100，然后弃掉下室200内原有的培养基，用PBS缓冲液进行清洗，然后于下室200内加入新鲜培养基并加入检测试剂，继续培养4h。待培养结束后，检测细胞活性，并计算细胞活率。细胞活率的计算公式如下：

前述的检测试剂可以选自CCK-8、MTT中的一种或多种，本领域技术人员也可根据实际情况选择相应的检测试剂，本发明不限于此。检测用细胞可以为人成神经细胞瘤细胞、人淋巴瘤细胞等任何可以用于体外培养中的一种或多种细胞，本发明不限于此。

综上，本发明通过提供一种新的玉石体外评价方法，该方法先通过Transwell小室培养，将玉石药物与细胞共孵育，之后再通过检测细胞活性来评价药物活性。通过利用本发明的方法，玉石中的有效成分可以穿过Transwell上室的膜作用于下室细胞，抑制或促进细胞增殖，且其他杂质不影响试验结果的判定。该方法对中药浸出物，尤其是玉石浸出物体外药效学研究具有重要意义，具有良好的应用前景。

下面将通过实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不因此而受到任何限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

细胞：人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞(货号：GDC210)，购自中国典型培养物保藏中心；

试剂：MEM培养基(货号：41500)，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液(货号：T1300)，青链霉素混合液(100X)(货号：P1400)，细胞增殖及毒性检测CCK-8试剂盒(货号：CA1210)以上试剂均购自索莱宝公司；胎牛血清(货号：22011-8612)购自四季青公司；顺铂注射液(6mL:30mg)，购自江苏豪森药业集团有限公司。待测玉石粉：购自吉林省磐龙玉开发有限公司。

仪器：电热恒温水浴锅(型号：LUX-12)，购自北京陆希科技有限公司；洁净工作台(型号：DL-CJ-2NDI)，购自北京东联哈尔仪器制造有限公司公司；倒置显微镜(型号：DMILLED)，购自Leica公司；离心机(型号：L3-5K)，购自湖南可成仪器设备有限公司；二氧化碳培养箱(型号：HF151)，购自香港力康公司；多功能酶标仪(型号：Fluostar Omega with ABS)，购自德国BMG公司。

实施例1

1)细胞培养(含复苏、传代)

细胞复苏过程：从液氮罐中取出人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化后取出，吸取细胞悬液于离心管中，加入2mL培养液，1000rpm/min，5min离心后去上清，加入2mL MEM完全培养基，吸管吹打均匀后，转移到培养瓶中，补足培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，隔天观察，看细胞需要继续培养，还是需要对细胞进行换液或传代处理。

细胞传代过程：细胞复苏后，待贴壁细胞长满瓶底约80％～90％时，需对细胞进行传代处理，将瓶中培养液吸出，用无菌PBS清洗两次，去除残余培养基，加入适量胰酶，轻轻摇晃，使之覆盖均匀，将其放到培养箱中，一般2min后可在镜下观察细胞边缘变圆，轻摇后细胞不断从瓶底脱落，加入胰酶2倍体积的完全培养液终止消化，吹打均匀后，转移至离心管中，1000rpm/min，5min离心后去上清，加入2mL培养液，吹打均匀后，1:2～1:4进行传代培养。

2)细胞铺板与药物孵育

取对数生长期人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞，采用0.25％胰蛋白酶进行消化，1000rpm离心5min，细胞计数；

用MEM完全培养液调节细胞浓度为1.25×10⁵cell/mL；

先向每个Transwell小室的下室中加入400μL含5×10⁴细胞悬液，培养过夜；

第二天从37℃取出放有小室的24孔板，直接向下室内加入200μL对照品顺铂低中高剂量组，浓度分别为12μM、60μM、300μM，最终作用浓度为4μM、20μM、100μM；轻轻向每个上室加入200μL供试品玉石低中高剂量组，浓度分别为14mg/mL、70mg/mL、350mg/mL，最终作用浓度分别为4.7mg/mL、23.3mg/mL、116.7mg/mL，避免出现气泡。此外，设置对照组，也即不在上室中加入药物，直接向下室加入200μLMEM完全培养基。

将上述24孔板置于37℃和5％CO₂培养箱中静置进行药物孵育72h，根据预试验结果确定检测时间点。

3)细胞活性检测

药物孵育结束前4h，将小室上室取出，弃掉下室培养基，并用PBS清洗1遍，下室每孔加入270μLMEM培养基，再加入30μL CCK-8检测试剂，放入培养箱中继续培养4h后，取出24孔板，每孔吸取100μL的待测溶液转移至96孔酶标板中，用酶标仪在波长450nm下读取吸收值并计算细胞活率：

表1 细胞活力检测OD值

由上表1可以看出，顺铂低剂量组(4μM)、中剂量组(20μM)和高剂量组(100μM)细胞活率分别为(31.15±4.77)％、(25.49±0.35)％和(26.08±1.55)％；玉石低剂量组(4.7mg/mL)、中剂量组(23.3mg/mL)和高剂量组(116.7mg/mL)细胞活率分别为(95.28±2.88)％，(93.27±3.02)％，(82.18±6.22)％。与对照组相比，顺铂高、中、低剂量以及玉石高剂量均对人成神经细胞瘤细胞SH-SY5Y体外生长有明显的抑制作用(P<0.001或P<0.05)；玉石中、低剂量组对其无明显抑制作用(P>0.05)。可见，通过采用本发明的方法，玉石中的有效成分可以穿过Transwell上室的膜作用下室细胞，抑制细胞增殖，且杂质不影响试验结果的判定，可有效进行玉石体外药效评价。

对比例1

将实施例1中的高浓度为116.7mg/mL的玉石悬液加入有小室的培养孔中或取浓度为4.7mg/mL、23.3mg/mL低中剂量的玉石悬液直接加入到实施例1中步骤2)的培养过夜后的400μL含5×10⁴细胞悬液中，并进行药物细胞共孵育72h。

用倒置显微镜(10X物镜)进行镜下观察，图3至图5分别示出了不同处理方式下孵育72h后细胞的倒置显微镜图，其中，图3为玉石高剂量组(利用transwell小室)，图4为玉石低剂量组(玉石直接作用)，图5为玉石中剂量组(玉石直接作用)。结果表明，利用transwell小室的方法不受玉石杂质干扰，能清晰的看到细胞的形态。但直接加入玉石悬液的实验孔，细胞形态未知，且不能有效去除出杂质颗粒直接影响细活率以及对实验终点吸收值检测的干扰。说明本发明的方法能够使有效成分穿过Transwell上室的膜作用于下室细胞的同时，且杂质不影响试验结果的判定，可有利于玉石体外药效评价。

本领域技术人员应当注意的是，本发明所描述的实施方式仅仅是示范性的，可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进。因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。