一种评估抗性基因迁移风险的方法
阅读说明：本技术 一种评估抗性基因迁移风险的方法 (Method for evaluating migration risk of resistance gene ) 是由 许燕滨 欧阳朋倩 谢光炎 罗宏威 陈卓瑶 李宇 于 2021-01-18 设计创作，主要内容包括：本申请属于生物技术的领域,尤其涉及一种评估抗性基因迁移风险的方法。本申请提供了一种评估抗性基因迁移风险的方法,以荧光细菌为受体,耐药细菌为供体,利用荧光细菌和耐药细菌检测某水质下抗性基因迁移风险的一种方法,通过构建荧光细菌的荧光强度F-吸光度-荧光细菌浓度C三者标准曲线；根据标准曲线得到在待测水样中接合后受体的浓度,以及筛选液中接合子的浓度,实现检测待测水样中抗性基因迁移频率的目的。本申请提供了一种评估抗性基因迁移风险的方法,能有效解决现有计算迁移频率的方法中存在的费时费力,以及无法评估水样中重金属、抗生素及其他有机物质对抗性基因迁移综合风险的技术缺陷。(The application belongs to the field of biotechnology, and particularly relates to a method for evaluating migration risk of a resistance gene. The application provides a method for evaluating migration risk of a resistance gene, which is a method for detecting migration risk of the resistance gene under certain water quality by using fluorescent bacteria as an acceptor and drug-resistant bacteria as a donor and by constructing a standard curve of fluorescence intensity F-absorbance-fluorescence bacteria concentration C of the fluorescent bacteria; and obtaining the concentration of the receptor after the conjugation in the water sample to be detected and the concentration of the zygote in the screening solution according to the standard curve, thereby realizing the purpose of detecting the migration frequency of the resistant gene in the water sample to be detected. The application provides a method for evaluating migration risk of a resistance gene, which can effectively overcome the technical defects that the existing method for calculating migration frequency wastes time and labor, and the comprehensive risk of heavy metals, antibiotics and other organic matters in a water sample to the migration of the resistance gene cannot be evaluated.)
技术领域
本申请属于生物技术的领域，尤其涉及一种评估抗性基因迁移风险的方法。
背景技术
随着抗生素的广泛应用，抗生素带来的后续影响也逐渐引起人们的关注，其中最令人在意的即为抗生素造成的耐药菌的发展。常规风险评价的方法通常为风险熵值累加法，即依据水中检测的抗生素残留浓度计算风险熵值并将各类抗生素的风险熵值进行累加，但实际环境水样中通常成分复杂，如养殖废水中可能含有各类激素，工业废水中可能含有各类重金属，而目前研究已然证明，部分有机物与重金属的存在能够促进抗性基因的迁移与耐药菌的发展。因此，单纯通过风险熵值累加法进行水中抗生素风险评估并未考虑水中有机物、重金属对细菌获得耐药性过程中的影响。而且，计算迁移频率的方法通常通过稀释平板涂布，过程通常耗时较长，且易因浓度把控失误造成的实验失败，且样品不宜过多，不能快速进行多样品测试。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种评估抗性基因迁移风险的方法，能有效解决现有计算迁移频率的方法中存在的费时费力，以及无法评估水样中重金属、抗生素及其他有机物质对抗性基因迁移风险的技术缺陷。
本申请提供了一种评估抗性基因迁移风险的方法，包括：
步骤1、将荧光细菌稀释成吸光度在预置范围的一系列浓度梯度的稀释液，计算所述稀释液的荧光细菌浓度，构建吸光度-荧光细菌浓度C的标准曲线；
将所述荧光细菌稀释成所述吸光度在预置范围的一系列浓度梯度的稀释液，测定所述稀释液的荧光强度，构建吸光度-荧光强度F的标准曲线；
其中，所述荧光细菌具有荧光蛋白基因和第一抗生素抗性基因，使得所述荧光细菌对所述第一抗生素具有抗性，在诱导剂诱导和预置激发光下发出荧光，且所述荧光细菌对第二抗生素敏感；
步骤2、将所述荧光细菌、耐药细菌、待测水样和诱导剂混合培养，得到第一混合物，使得所述第一混合物中所述荧光细菌与所述耐药细菌的吸光度在所述预置范围内，且所述荧光细菌与所述耐药细菌的吸光度相等；所述耐药细菌对所述第二抗生素有抗性，所述待测水样预先经过过滤除菌处理，所述诱导剂为诱导所述荧光蛋白表达的物质；
其中，所述荧光细菌与所述耐药细菌混合培养后，得到第一荧光细菌；在所述预置激发光下，测定所述第一混合物的荧光强度，根据所述吸光度-荧光强度F的标准曲线，和所述吸光度-荧光细菌浓度C的标准曲线，计算所述第一混合物中所述第一荧光细菌的浓度，所述第一荧光细菌的浓度为受体的浓度；
其中，所述第一混合物、诱导剂、第一抗生素和第二抗生素混合培养后，得到第二混合物，所述荧光细菌与所述耐药细菌接合后，得到第二荧光细菌，在所述预置激发光下，测定所述第二混合物的荧光强度，根据所述吸光度-荧光强度F的标准曲线，和所述吸光度-荧光细菌浓度C的标准曲线，计算所述第二混合物中所述第二荧光细菌的浓度，所述第二荧光细菌的浓度为接合子的浓度；
步骤3、根据所述受体的浓度和所述接合子的浓度，计算所述待测水样中抗性基因迁移频率。
另一些实施例中，所述荧光蛋白基因选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或黄色荧光蛋白中的一种。
具体的，测定所述稀释液的荧光强度采用所述荧光蛋白的激发光波长。例如，绿色荧光蛋白(EGFP)采用488nm激发光波长，采用激光共聚焦扫描显微镜采集荧光强度。
另一些实施例中，所述第一抗生素抗性基因选自氨基糖苷类抗性基因；所述第二抗生素为所述第一抗生素以外的抗生素。
另一些实施例中，所述第一抗生素抗性基因选自氨基糖苷类抗性基因中的一种；所述第二抗生素为所述第一抗生素以外的抗生素。
具体的，所述第二抗生素选自β-内酰胺酶类抗生素、四环素类抗生素、喹诺酮类抗生素。
具体的，所述氨基糖苷类抗性基因为卡那霉素抗性基因；所述β-内酰胺酶类抗生素为阿莫西林。
另一些实施例中，所述耐药细菌为环境中的耐药细菌且可与大肠杆菌进行基因迁移的细菌中的一种。
另一些实施例中，所述耐药细菌选自耐药志贺氏菌。
另一些实施例中，所述荧光细菌为EGFP-BL21，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG。
另一些实施例中，所述绿色荧光大肠杆菌为大肠杆菌(BL21)导入构建的含绿色荧光蛋白(EGFP)和卡那霉素抗性基因的质粒(pET28a)重组而成。
另一些实施例中，步骤1中，所述吸光度为OD600 nm；所述预置范围为0.1～0.9。
另一些实施例中，步骤2中，所述荧光细菌在所述待测水样的吸光度在0.1；所述耐药细菌在所述待测水样的吸光度在0.1。
另一些实施例中，步骤2中，所述过滤除菌处理包括将所述待测水样经0.22μm有机系滤膜除菌。
另一些实施例中，步骤2中，所述混合培养的温度为30℃±2℃；所述混合培养的时间为16h～24h；所述混合培养的条件为150rpm～200rpm恒温摇床。
另一些实施例中，步骤2中，所述混合培养的时间为24h。
另一些实施例中，步骤2中，所述待测水样中抗性基因迁移频率为所述接合子的浓度/所述受体的浓度。
具体的，步骤1中，计算所述稀释液的荧光细菌浓度的方法为现有常规的稀释涂布计算法，按照稀释涂布计数法计算每一梯度的细菌浓度。
具体的，步骤1中，测定所述稀释液的荧光强度的方法为采用现有常规的激光共聚焦扫描显微镜采集所述稀释液的荧光强度。
具体的，步骤2中，测定接合子浓度和受体浓度时，若所测样本的荧光强度过强，则需适量稀释，如按照激光共聚焦扫描显微镜24孔培养孔板使用方法进行预平衡后，吸取500μL菌液加至每孔含2mL营养肉汤培养液的24孔培养孔板(即稀释5倍)，激光共聚焦扫描显微镜采集荧光图像，获得平均荧光强度数值；若所测样本的荧光强度合适，则按照激光共聚焦扫描显微镜24孔培养孔板使用方法进行预平衡后，直接吸取2mL菌液加至24孔培养孔板，直接采用激光共聚焦扫描显微镜采集荧光图像，获得平均荧光强度数值；若测样本的荧光强度过弱，则需重新开展实验，并提高第一混合物中荧光细菌和耐药细菌的浓度。
本申请是利用荧光细菌和耐药细菌检测待测水样下抗性基因迁移风险的一种方法。以荧光细菌为受体，耐药细菌为供体，构建荧光细菌的荧光强度F-吸光度-荧光细菌浓度C三者标准曲线；荧光细菌、耐药细菌、待测水样和诱导剂混合培养，得到第一混合物，诱导剂诱导荧光细菌的荧光蛋白表达，受体和供体接合后，检测第一混合物中第一荧光细菌，即受体的荧光强度；将第一混合物、第一抗生素和第二抗生素混合培养，得到第二混合物，由于耐药细菌对第二抗生素有抗性，因此，耐药细菌具有第二抗生素抗性基因，耐药细菌作为供体细菌，会在待测水样中将耐药基因(即第二抗生素抗性基因)迁移至荧光细菌中，荧光细菌与耐药细菌接合后的第二荧光细菌即为接合子，使得接合子有第二抗生素抗性基因；同时，第二抗生素会杀死未获得第二抗性基因的受体细菌，接合子为含有第二抗生素抗性基因的荧光细菌，使得接合子细菌对第一抗生素和第二抗生素具有抗性，利用诱导剂诱导荧光蛋白表达，在第二混合物中发出荧光，检测第二混合物中接合子细菌的荧光强度。根据标准曲线得到第一混合物中第一荧光细菌，即受体的浓度，以及第二混合物中第二荧光细菌，即接合子的浓度，二者相比即可实现检测待测水样中抗性基因迁移频率的目的，可快速测定多种待测水样水质条件下抗性基因迁移的频率，可应用于污水风险评价领域。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例提供的荧光强度F-OD600nm吸光度标准曲线；
图2为本申请实施例提供的绿色荧光大肠杆菌EGFP-BL21在不同稀释浓度下的激光共聚焦扫描显微镜扫描图；
图3为本申请实施例提供的在不同的待测水样添加绿色荧光大肠杆菌EGFP-BL21、耐药志贺氏菌和IPTG共培养24h后的激光共聚焦扫描显微镜扫描图；
图4为本申请实施例提供的在不同的待测水样添加绿色荧光大肠杆菌EGFP-BL21、耐药志贺氏菌、IPTG、卡那霉素和阿莫西林共培养24h后的激光共聚焦扫描显微镜扫描图；
图5为本申请实施例提供的不同的待测水样的抗性基因迁移频率。
具体实施方式
本申请提供了一种评估抗性基因迁移风险的方法，用于解决现有技术中存在的费时费力，以及无法评估水样中重金属、抗生素及其他有机物质对抗性基因迁移风险的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制；以下实施例所用营养肉汤为现有常规的细菌培养基。
本申请包括荧光强度F-OD600nm吸光度-细菌浓度C三者关系建立、待测水样中供受体接合及激光共聚焦扫描显微镜检测荧光强度三部分内容，包括：
从冰箱取出绿色荧光大肠杆菌，活化后涂布，检验绿色荧光大肠杆菌的荧光蛋白是否正常表达。
将活化的绿色荧光大肠杆菌稀释成OD600nm在0.1-0.9范围内一系列浓度梯度的稀释液。
取稀释液进行平板涂布，记录每个OD600nm吸光度值对应的绿色荧光大肠杆菌浓度，将数据进行拟合，获得OD600nm吸光度-绿色荧光大肠杆菌浓度C的标准曲线。
取稀释液2mL于经3mL磷酸盐缓冲液(0.1mM)预平衡30min的24孔激光共聚焦扫描显微镜板，上机激光共聚焦扫描显微镜采集荧光图像，本申请采用蔡司ZEN系统进行图像采集，图像采集选用488nm激发光(即EGFP用波长)，图像采集时需先按最大浓度时图片不发生曝光为原则调整检测器增益值和Effective NA值，后续图像采集保持该数据不变，根据所采集的荧光图像确定稀释液内绿色荧光大肠杆菌浓度，将数据进行拟合，获得荧光强度F-OD600nm吸光度标准曲线。
采集待测水样，并用0.22μm有机滤膜过滤做除菌处理。
采用营养肉汤调整过夜培养的供体细菌、受体细菌为相同浓度，等量投加于经过除菌处理的水样中，得到第一含菌水样；其中受体细菌为绿色荧光大肠杆菌(绿色荧光大肠杆菌对第二抗生素敏感)，供体细菌为耐药细菌(耐药细菌对第二抗生素具有抗性)。
第一含菌水样30±2℃，150rpm恒温摇床混合培养24h后，得到第二含菌水样，第二含菌水样中荧光细菌的浓度为受体的浓度；为保证荧光强度在合适范围，先于24孔激光共聚焦扫描显微镜培养孔板中加入2mL磷酸盐缓冲液(0.1mM)预平衡30min，再取500μL含菌水样添加于已加入2mL磷酸盐缓冲液的孔板中，磷酸盐缓冲液中含有诱导剂(可诱导绿色荧光蛋白表达的物质)，用激光共聚焦扫描显微镜对样本进行荧光图像采集，根据荧光图像获得平均荧光强度，利用荧光强度F-OD600nm吸光度-细菌浓度C获得受体细菌浓度，后续数据处理时乘回稀释倍数5。
同时，取第一含菌水样加入含第一抗生素和第二抗生素和诱导剂的营养肉汤中，30±2℃，150rpm恒温摇床培养24h，所得菌液为接合子细菌筛选液。接合子细菌筛选液中荧光细菌与所述耐药细菌接合后，得到第二荧光细菌，第二荧光细菌的浓度为接合子的浓度；为保证荧光强度在合适范围，先于24孔激光共聚焦扫描显微镜培养孔板中加入2mL磷酸盐缓冲液(0.1mM)预平衡30min，再取2mL接合子细菌筛选液添加于孔板中，用激光共聚焦扫描显微镜对样本进行荧光图像采集，根据荧光图像获得平均荧光强度，利用荧光强度F-OD600nm吸光度-细菌浓度C获得接合子细菌浓度。
根据公式迁移频率＝接合子细菌浓度/受体细菌浓度，获得在待测水样水质条件下的抗性基因迁移频率。
具体的，用激光共聚焦扫描显微镜进行荧光图像采集时，需对24孔激光共聚焦扫描显微镜培养孔板中的液体中的绿色荧光大肠杆菌浓度做一定把控，绿色荧光大肠杆菌绿色浓度过高和过低时，荧光强度数据可能不够准确。因此，本申请实施例在采集受体细菌的荧光强度时做稀释处理，而接合子细菌荧光强度数据采集时为原浓度。同时，利用激光共聚焦显微镜采集荧光图像时需从荧光强度最大的样本开始调整相机数据，否则可能出现过度曝光现象影响荧光强度数值，因此，受体或接合子细菌荧光强度过大则需及时做稀释处理。
具体的，耐药细菌可选择由自然环境筛选的耐药志贺氏菌。本申请是利用绿色荧光大肠杆菌和志贺氏菌检测某水质下抗性基因迁移风险的一种方法。首先制备绿色荧光大肠杆菌和志贺氏菌的新鲜菌液，其中绿色荧光大肠杆菌具备卡那霉素抗性，志贺氏菌具备待测抗性基因抗性(本申请以β-内酰胺酶类抗性基因为例，以阿莫西林作为代表)。绘制荧光大肠杆菌荧光强度F-OD600nm吸光度-细菌浓度C三者标准曲线。将等量荧光大肠杆菌和志贺氏菌投加入含荧光蛋白诱导剂的待测过膜水样进行接合，24h后利用激光共聚焦扫描显微镜采集荧光图像，获得含菌水样中荧光强度数据，根据标准曲线即得受体数量。同时将含菌水样加入含卡那霉素、阿莫西林和荧光蛋白诱导剂的营养肉汤中(即筛选液)，于30±2℃，150rpm恒温摇床中培养24h后同样利用激光共聚焦扫描显微镜测定筛选液中荧光强度，根据标准曲线即得接合子数量。水样中抗性基因迁移频率＝接合子数量/受体数量。
实施例1
本申请实施例提供了吸光度OD600nm-荧光强度F的标准曲线绘制，包括以下过程：
取出过夜培养的绿色荧光大肠杆菌EGFP-BL21，用营养肉汤培养液进行稀释，利用分光光度计测量600nm的吸光度，使之在0.1-0.9范围内，稀释浓度梯度OD600nm为：0、0.062、0.095、0.208、0.326、0.430、0.614。
在24孔激光共聚焦扫描显微镜培养孔板中加入2mL磷酸盐缓冲液(0.1mM)进行预平衡，30min后倒出。
取2mL稀释液加入已预平衡的24孔激光共聚焦扫描显微镜培养孔板。
上机激光共聚焦扫描显微镜对激光共聚焦扫描显微镜培养孔板进行荧光图像采集，按上述拍照原则调整检测器增益值为650V，Effective NA值为0.45，所得浓度梯度图片如图2所示，获得平均荧光强度数据，绘制荧光强度F-OD600nm吸光度标准曲线(R2为0.9863)，结果如图1所示；图2中，1为稀释浓度梯度为0.062时的激光共聚焦扫描显微镜扫描图片，2为稀释浓度梯度为0.095时的激光共聚焦扫描显微镜扫描图片，3为稀释浓度梯度为0.208时的激光共聚焦扫描显微镜扫描图片，4为稀释浓度梯度为0.326时的激光共聚焦扫描显微镜扫描图片，5为稀释浓度梯度为0.430时的激光共聚焦扫描显微镜扫描图片，6为稀释浓度梯度为0.614时的激光共聚焦扫描显微镜扫描图片。
实施例2
本申请提供了养鸭废水典型工艺水质中抗性基因迁移风险评估试验，包括：
取出过夜培养的绿色荧光大肠杆菌，用营养肉汤培养液进行稀释，利用分光光度计测量600nm的吸光度，使之在0.1-0.9范围内，采用稀释涂布计数法计算稀释液的绿色荧光大肠杆菌浓度，构建吸光度-绿色荧光大肠杆菌浓度C的标准曲线。
取广东某种鸭废水处理工艺中初沉池、调节池、一级A/O、二级A/O出水及消毒池进水和出水作为待测水样，纯水作为空白对照，待测水样经0.22μm有机滤膜进行过膜除菌处理，制得待测过膜水样。
取过夜培养的绿色荧光大肠杆菌EGFP-BL21及耐药志贺氏菌(耐阿莫西林)，绿色荧光大肠杆菌EGFP-BL21及耐药志贺氏菌的浓度调节至OD600nm＝0.6，取10mL菌液加入40mL含IPTG(0.1mmol/mL)各待测过膜水样中，即水中两菌浓度皆为OD600nm＝0.1，于30±2℃，150rpm恒温摇床中培养24h，得到含菌水样。
24h后为保证荧光强度在合适范围，先于24孔激光共聚焦扫描显微镜培养孔板中加入2mL磷酸盐缓冲液(0.1mM)预平衡30min，再取500μL含菌水样添加于已加入2mL磷酸盐缓冲液的孔板中利用激光共聚焦扫描显微镜采集荧光图像，参数设置与荧光强度F-OD600nm吸光度标准曲线图像采集时保持一致，荧光图像如图3所示，图3中，A为纯水，B为初沉池，C为调节池，D为一级A/O出水，E为二级A/O出水，F为消毒池进水，G为消毒池出水。获得含菌水样中荧光强度，设荧光强度为x，OD600nm吸光度为y，细菌浓度C为z(107cfu/mL)，根据前期所得标准曲线y＝0.0117x和z＝99.08y-16.992即得荧光大肠杆菌EGFP-BL21受体浓度C0。
取过夜培养的绿色荧光大肠杆菌EGFP-BL21及耐药志贺氏菌(耐阿莫西林)，采用营养肉汤将绿色荧光大肠杆菌EGFP-BL21及耐药志贺氏菌的浓度调节至OD600nm＝0.6，取10mL菌液加入40mL各待测过膜水样中，即待测过膜水样中两菌浓度皆为OD600nm＝0.1，于30±2℃，150rpm恒温摇床中培养24h，得到含菌水样。取1ml含菌水样加入50mL含卡那霉素(32μg/mL)、阿莫西林(8μg/mL)和含IPTG(0.1mmol/mL)的营养肉汤中(即含菌水样在营养肉汤中的含量为2％)，于30±2℃，150rpm恒温摇床中培养24h，得到接合子细菌筛选液。
24h后为保证荧光强度在合适范围，先于24孔激光共聚焦扫描显微镜培养孔板中加入2mL磷酸盐缓冲液(0.1mM)预平衡30min，再取2mL接合子细菌筛选液添加于孔板中，同样利用激光共聚焦扫描显微镜采集荧光图像，如图4所示，图4中，A为纯水，B为初沉池，C为调节池，D为一级A/O出水，E为二级A/O出水，F为消毒池进水，G为消毒池出水。测定接合子细菌筛选液中荧光强度，设荧光强度为x，OD600nm吸光度为y，细菌浓度C为z(107cfu/mL)，根据前期所得标准曲线y＝0.0117x和z＝99.08y-16.992根据前期标准曲线即得接合子数量C。
水样抗性基因迁移频率＝接合子数量C/荧光大肠杆菌EGFP-BL21受体C0，绘制迁移频率图5。图5可知，调节池出水的抗性基因迁移频率最高，消毒池出水的抗性基因迁移频率最低，符合预期。且根据综合水质条件的不同，迁移频率检测差异性明显，说明本申请的方法可快速测定多种待测水样水质条件(重金属、抗生素及其他有机物质)下抗性基因迁移的频率。
本申请选用荧光大肠杆菌作为受体，荧光表达稳定，含有卡那霉素抗性也方便筛选，激光共聚焦显微镜分辨率高，二者接合应用可在建立标准曲线后快速测定待测水质中抗性基因迁移频率，即在待测水样水质中抗性基因迁移的综合风险。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
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