一种检测体内rna与dna及蛋白互作的试剂盒及其使用方法
阅读说明：本技术 一种检测体内rna与dna及蛋白互作的试剂盒及其使用方法 (Kit for detecting interaction of RNA, DNA and protein in vivo and use method thereof ) 是由 不公告发明人 于 2020-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者互作的试剂盒及其使用方法,包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶,生物素标记的dCTP,阳性探针及阴性探针,细胞裂解液,链霉亲和素磁珠,杂交液,洗液,蛋白酶K及其缓冲液,无RNA酶水,DNA洗脱液,蛋白洗脱液。本发明利用生物素标记的DNA探针抓取特异RNA,并随之获取与RNA互作的蛋白与DNA。首先用交联剂将体内互作的RNA、DNA和蛋白交联在一起,再利用与RNA序列互补且标记生物素的DNA探针与交联后的裂解液孵育,之后用链霉亲和素磁珠捕获RNA、DNA、蛋白互作复合物,最后分别洗脱RNA、蛋白以及DNA。(The invention discloses a kit for detecting the interaction of RNA, DNA and protein in vivo and a using method thereof. The invention uses a DNA probe marked by biotin to grab specific RNA and then obtains protein and DNA interacted with the RNA. Firstly, cross-linking RNA, DNA and protein interacted in vivo by using a cross-linking agent, then incubating the cross-linked lysate by using a DNA probe which is complementary to an RNA sequence and is marked with biotin, capturing an RNA, DNA and protein interaction complex by using streptavidin magnetic beads, and finally eluting the RNA, protein and DNA respectively.)
技术领域
本发明涉及分子生物领域，尤其涉及一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法
背景内容
非编码RNA参与细胞增值、迁移，EMT转化，干细胞分化，细胞凋亡等众多细胞进程的调控，是生物体重要的调控因子。非编码RNA主要包括lncRNA、circRNA、microRNA、eRNA等，这些RNA在胞质中的功能已研究的非常深入。近年来，研究表明，大量非编码RNA，尤其是lncRNA和eRNA，通过参与表观遗传过程来调控细胞进程。
表观遗传指的是在DNA序列不改变的情况下基因表达发生可遗传变化。主要包括DNA甲基化，甲基化、乙酰化等组蛋白修饰以及染色质重构等。在真核生物中，被研究的最清楚的表观调控过程是干细胞分化过程。该过程通过转录因子调控Nanog、Sox2、Oct2三大核心调控因子，进而招募激活复合物或抑制复合物，从而激活或抑制干性相关基因，从而调控干细胞的分化。许多研究表明，这一调控机制也适用于癌症等多种疾病的研究。近年来。非编码RNA作为一种新兴的表观遗传调控分子，被大量研究。研究结果表明，非编码RNA可以直接缠绕在转录因子上或作为支架调控转录因子，从而调控组蛋白与相关沉默或激活复合物，进而调控基因的转录。
非编码RNA与DNA、蛋白的互作是研究RNA参与表观调控的关键。已往的技术是将三者的互作两两分开，先通过RIP或RNA pull down研究RNA与蛋白互作情况，再通过ChIP研究DNA与蛋白互作，最后进行生物统计比较，找到三者互作的蛋白。这种方法既不能统一实验条件，也不能直观的证明三者者的互作，只能通过实验实验推断互作，具有很高的假阳性。很多实验没有阳性对照和阴性对照去评估实验的准确性，实验的可重复性差。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性好、经济、完整的简便检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dUTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。本发明利用生物素标记的DNA探针抓取特异RNA，并随之获取与RNA互作的蛋白与DNA。首先用交联剂将体内互作的RNA、DNA和蛋白交联在一起，再利用与RNA序列互补且标记生物素的DNA探针与交联后的裂解液孵育，之后用链霉亲和素磁珠捕获RNA、DNA、蛋白互作复合物，最后分别洗脱RNA、蛋白以及DNA。
进一步地，所述检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述的阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
其中TERC探针序列是经过优化的序列，该序列与端粒酶序列互补，且每个序列间隔均匀，间距均在80-100bp之间，探针的GC含量均在45％-55％之间。LacZ为原核生物序列，其探针序列也经过严格优化，选取lacZ序列的中前端序列设计探针，探针间距为200-300bp之间，探针的GC含量均在45％-55％之间。探针数量均为5条，这经过我们严格测定，探针为5条是，捕获效率最高。
所述细胞裂解液的配方包括如下原料：
1～1.5％(W/V)SDS
Tris-Cl 50～100mmol/L
EDTA 10～15mmol/L
PMSF 0.8～1.2mmol/L；
所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，可以裂解胞膜，1％左右的SDS可以迅速裂解细胞膜及核膜；Tris-HCl作为一种稳定的缓冲液，可以维持稳定的pH值，pH值为7.2～7.5，与细胞正常PH值(7.4左右)保持一致,保持正常的DNA和蛋白形态；EDTA为乙二胺四乙酸，可以和细胞中Mg2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子络合，抑制细胞内多种酶的活性；PMSF为磷酸酶抑制剂，主要抑制磷酸酶的活性。
所述杂交液的配方包括如下原料：
1～1.5％(W/V)SDS
15～20％(V/V)formamide
NaCl 500～750mmol/L
Tris-Cl 50～100mmol/L
EDTA 1～2mmol/L
PMSF 0.8～1.2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，可以裂解胞膜，1％左右的SDS可以迅速裂解细胞膜；formamide是去离子甲酰胺，它可以与核酸形成氢键，使DNA或RNA的变性，15～20％的去离子甲酰胺可以使游离的RNA保持变性状态，而DNA则保持双链结构保持，使探针与RNA更好的结合。Tris-HCl作为一种缓冲液，可以维持稳定的pH值，pH值为7.2～7.5，与细胞正常PH值(7.4左右)保持一致,保持正常的DNA和蛋白形态；Nacl作为一种电解质，500～750mmol/L的Nacl，是一个高盐状态，高浓度的Na+可以中和核酸上的电性，促进碱基互补配对作用，从而促进探针与RNA的结合；EDTA为乙二胺四乙酸，可以和细胞中Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子络合，抑制细胞内多种酶的活性；PMSF为磷酸酶抑制剂，主要抑制磷酸酶的活性。
所述蛋白酶K缓冲液的配方包括如下原料：
0.3～0.8％(W/V)SDS
NaCl 100～150mmol/L
Tris-Cl 10～20mmol/L
EDTA 1～2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为两个范围，提取RNA时，Tris-Cl的PH值为6.5-7.0，提取DNA时，Tris-Cl的PH值为8.0～8.5。
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，0.5％左右的SDS可以使蛋白质变性，从而增强蛋白酶K的降解能力；Nacl作为一种电解质，100～150mmol/L的Nacl，维持细胞的正常渗透压；Tris-HCl作为一种缓冲液，可调节PH，RNA为单链核酸，提取应PH为中性，DNA为双链核酸，提取时PH应偏碱性；EDTA为乙二胺四乙酸，可以螯合体系中Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子，增强蛋白酶K的活性。
所述洗液的配方包括如下原料：
0.3～0.8％(W/V)SDS
NaCl 300～400mmol/L
柠檬酸钠30～40mmol/L
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，0.5％左右的SDS可以使蛋白质变性，更好的去除蛋白杂质。Nacl作为一种电解质，300～500mmol/L的Nacl，高于细胞渗透压，是一种高盐状态，高浓度的高浓度的Na+可以中和核酸上的电性，使核酸处于疏水状态，洗脱时可以将更好的将核酸与其他杂质分开。柠檬酸钠可以络合Mg2+、Ca2+、Fe2+等金属离子，还具有较高的溶解度，是一种强碱弱酸盐，是很好的缓冲试剂，维持体系PH的稳定。
所述DNA洗脱液的配方包括如下原料：
0.8～1.2％(W/V)SDS
NaHCO3 50～80mmol/L
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，1％SDS可以降低离心管壁对DNA的吸附作用。NaHCO3是一种强碱弱酸盐，可以维持体系的弱碱性，同时它也是一种良好的缓冲试剂，50～80mmol/L的Na+浓度保护DNA，防止DNA降解。
所述蛋白洗脱液的配方包括如下原料：
220～280mmol/L Tris-HCl；
8.5～11.5％(W/V)SDS；
0.4～0.6％(W/V)溴酚蓝；
45～55％(V/V)甘油；
4～6％(W/V)β-巯基乙醇；
所述Tris-HCL的pH值为6.6～7.0。
其中，10％左右的SDS可以使蛋白变性，并使蛋白均匀带负荷，溴酚蓝，电泳时指示蛋白条带的位置；甘油可增加溶液的粘稠度，上样后，使液体更容易沉淀；5％左右的β-巯基乙醇可以使蛋白变性；蛋白带负电荷，溶液的PH值应保持在偏酸性，所以所述Tris-HCL的pH值调为6.6～7.0。
所述简便检测RNA与DNA、蛋白互作的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1生物素标记的DNA探针制备：首先根据RNA序列设计合成DNA探针序列，通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶将生物素标记的dCTP标记到DNA的3’末端。
S2细胞交联，用甲醛或戊二醛对细胞进行交联。
S3细胞裂解：加入细胞裂解液裂解细胞。
S4超声断裂染色质：超声打断染色质，片段长度范围为200～500bp：
S5探针与裂解液孵育：将S1制备好的探针与超声后的裂解液孵育。
S6磁珠孵育：将链霉亲和磁珠与S5中的复合物进行孵育，使RNA以及与其结合的DNA和蛋白通过生物素标记的DNA探针固定在链霉亲和磁珠上，用洗液洗掉未结合的物质。
S7产物获取：产物包括DNA、RNA和蛋白。
步骤S1的具体步骤为：依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul，线性DNA 10pmol，生物素标记的dCTP 100pmol，末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul，37℃反应15～30分钟，70℃加热10分钟。
步骤S2的具体步骤为：细胞中加入1％的甲醛或戊二醛，振荡器振荡交联10分钟，加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸，终止交联5分钟，PBS洗2次。
在S2步骤中，如果最终获取物是DNA或RNA，交联剂用甲醛，如果最终获取物为蛋白，交联剂用戊二醛，甲醛通过交联反应可以将核酸蛋白等交联在一起，
但甲醛容易形成较大的交联复合物，不适合蛋白交联，戊二醛可以与蛋白巯基、羟基、羧基和氨基反应，使其烷基化，不会形成大的交联复合物，适合蛋白交联。
步骤S3的具体步骤为：收集细胞，每3～5x107个细胞加入1mL细胞裂解液，冰上裂解10分钟。
步骤S4的具体步骤为：将细胞移入超声管中，超声设置为30秒开、30秒关，超声15～20个循环，取10ul超声后的裂解液，加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH＝8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1～3小时。提取DNA，1％琼脂糖检测片段大小。
在步骤S4中，如果样本不是细胞，而是细菌、真菌或植物组织，建议设置超声梯度，以5个循环为基数，每次增加5个循环，直到将样本超声至合适的片段。
步骤S5的具体步骤为：取10μL作为RNA的input，取10μL作为DNA的input，取10μL作为蛋白的input。将1mL染色质转移至15mL离心管中，加入2mL杂交液，加入100pmol来自S1制备的探针。37℃旋转孵育4～5小时。
步骤S6的具体步骤为：用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠，每个样品中加入100μL磁珠，37℃孵育30～60分钟，3000rpm离心2分钟去除上清，加入1mL洗液清洗磁珠，离心去上清，重复清洗5次
步骤S7的具体步骤为：获取RNA:向input RNA中加入85μL蛋白酶K缓冲液(pH7.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)重悬100μL磁珠。各管加入5μL Proteinease K，50℃孵育45min，RNA提取试剂盒或酚氯仿法提取RNA，用15μL无RNA酶水洗脱RNA。获取DNA：向inputDNA中加入85ul蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)重悬100μL磁珠。各管加入5ul Proteinease K，50℃孵育45min，DNA提取试剂盒或酚氯仿法提取DNA，用15μLDNA洗脱液洗脱DNA。获取蛋白：向input蛋白及磁珠中直接加入15μL蛋白洗脱液洗脱蛋白。
在步骤S7中，获取不同的产物，要用不同的提取液。因此，一个实验只能获取一中产物，如果要同时获取三种不同的产物，需要同时做三个实验，每个实验获取一种产物。
所述简便检测RNA与DNA、蛋白互作的试剂盒，阳性对照的探针为TERC，阴性对照探针为Lac Z；检测RNA阳性为TERC，检测RNA阴性为GAPDH；检测蛋白阳性为TEBP，蛋白阴性为GAPDH；检测DNA阳性为端粒重复序列，检测阴性DNA为Alu重复序列。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)探针设计灵活，多个探针抓取同一条RNA，大大提高了抓取效率。
(2)通过末端转移酶标记探针，可同时标记多个探针，大大提高标记效率，节约成本。
(3)根据不同目的需求，选择最优的交联剂，最大限度保证结果的可靠性。
(4)可准确获取内源性与RNA互作的蛋白，比RNA pull down结果更能真实反应生物体内RNA与蛋白互作情况
(5)获取的DNA可进行qPCR或测序，灵活性高。
(6)本发明比单独购买合成的末端标记DNA、磁珠和试剂更为经济，可工业化生产；
(7)完整：包含标记和富集组分，阳性对照探针、阴性对照探针及相应的核酸检测引物；
序列表
TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
端粒酶qPCR检测引物：
F：TGTCTAACCCTAACTGAGAAGG
R:CTCTAGAATGAACGGTGGAA
GAPDH检测引物：
F:CCAGAAGACTGTGGATGGCC
R:CATGCCAGTGAGCTTCCC
检测端粒重复序列的dotblot探针序列为：
TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
检测Alu重复序列的dotblot探针序列为：
CACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCAC
附图说明
图1为本发明原理及流程图；
图2为本发明的RNA获取效率检测图
图3为本发明的银染图与传统RNA pull down结果比对图
图4为本发明的蛋白获取检测图
图5为本发明的DNA获取检测图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dUTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。
阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
具体步骤如下：
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul，线性DNA 10pmol，生物素标记的dCTP100pmol，末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul，37℃反应15～30分钟，70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1％的甲醛或戊二醛，交联10分钟，加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸，终止交联5分钟，PBS洗2次。
S3：细胞收集：每3～5x107个细胞加入1mL细胞裂解液，冰上裂解10分钟。
S4:染色质超声：将细胞移入超声管中，超声设置为30秒开、30秒关，超声15～20个循环，取10ul超声后的裂解液，加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH＝8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1～3小时。提取DNA，1％琼脂糖检测片段大小。
S5：探针孵育：超声后的裂解液，取10μL作为RNA的input，将1mL染色质转移至15mL离心管中，加入2mL杂交液，加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4～5小时。
S6:磁珠孵育：用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠，每个样品中加入100μL磁珠，37℃孵育30～60分钟，3000rpm离心2分钟去除上清，加入1mL洗液清洗磁珠，离心去上清，重复清洗5次
S7:提取RNA:向input RNA中加入85ul蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH7.0)重悬100ul磁珠。各管加入5ul Proteinease K，50℃孵育45min，RNA提取试剂盒或酚氯仿法提取RNA，用15ul无RNA酶水洗脱RNA。
将上述获得的RNA，进行反转录，再进行qPCR检测，具体如下：
将获得的15ul IP组RNA和input组RNA分别用逆转录试剂盒进行逆转录，获得20ulcDNA，分别取1ul进行qPCR检测，获取探针的捕获效率。
图2为qPCR检测结果，从图2可以看出TERC探针对TERC的富集效率非常高，是阴性探针LacZ的3000倍左右。而LacZ阴性探针的富集则是接近阴性。这说明我们设计的阳性探针与阴性探针是非常有效的。
实施例2
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dUTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。
阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
具体步骤如下：
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul，线性DNA 10pmol，生物素标记的dCTP100pmol，末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul，37℃反应15～30分钟，70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1％戊二醛，交联10分钟，加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸，终止交联5分钟，PBS洗2次。
S3：细胞收集：每3～5x107个细胞加入1mL细胞裂解液，冰上裂解10分钟。
S4:染色质超声：将细胞移入超声管中，超声设置为30秒开、30秒关，超声15～20个循环，取10ul超声后的裂解液，加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH＝8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1～3小时。提取DNA，1％琼脂糖检测片段大小。
S5：探针孵育：取10μL作为蛋白的input，将1mL染色质转移至15mL离心管中，加入2mL杂交液，加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4～5小时。
S6:磁珠孵育：用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠，每个样品中加入100μL磁珠，37℃孵育30～60分钟，3000rpm离心2分钟去除上清，加入1mL洗液清洗磁珠，离心去上清，重复清洗5次
S7:蛋白洗脱：向input蛋白及磁珠中直接加入15ul蛋白洗脱液洗脱蛋白。
将上述获得的蛋白进行银染、免疫印迹检测、质谱，具体如下：
(1)银染：将洗脱的蛋白样品，取1～3ul，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白样品，对聚丙烯酰胺凝胶进行银染，蛋白条带显现，对差异蛋白进行分析。
结果如图3所示，其中A为本发明的银染结果，B为RNA pull down实验的银染结果，对比两个结果，可以看出，本发明的实验结果蛋白条带更清洗，阴性探针的背景更低，本实验结果明显优于传统的RNA pull down实验结果。
(2)蛋白斑点杂交：将3ul蛋白提取物点到PVDF膜上，真空抽干，用3％的BSA封闭10分钟，加入一抗，室温孵育2小时，洗膜，加入二抗，室温孵育1小时，洗膜，加发液曝光。
结果如图4所示，阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针。阳性检测蛋白为TEBP端粒酶结合蛋白，阴性检测蛋白为GAPDH甘油醛磷酸脱氢酶。从图中结果，我们可以看出，TERC探针明显捕获到与TERC结合的TEBP蛋白，而阴性探针LacZ明显没有捕获到TEBP蛋白，说明我们的探针捕获与RNA结合蛋白的效率及特异性非常高。
实施例3
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dUTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。
阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
具体步骤如下：
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul，线性DNA 10pmol，生物素标记的dCTP100pmol，末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul，37℃反应15～30分钟，70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1％甲醛，交联10分钟，加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸，终止交联5分钟，PBS洗2次。
S3：细胞收集：每3～5x107个细胞加入1mL细胞裂解液，冰上裂解10分钟。
S4:染色质超声：将细胞移入超声管中，超声设置为30秒开、30秒关，超声15～20个循环，取10ul超声后的裂解液，加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH＝8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1～3小时。提取DNA，1％琼脂糖检测片段大小。
S5：探针孵育：取10μL作为DNA的input，将1mL染色质转移至15mL离心管中，加入2mL杂交液，加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4～5小时。
S6:磁珠孵育：用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠，每个样品中加入100μL磁珠，37℃孵育30～60分钟，3000rpm离心2分钟去除上清，加入1mL洗液清洗磁珠，离心去上清，重复清洗5次
S7:提取DNA:向input DNA中加入85ul蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH8.0)重悬100ul磁珠。各管加入5ul Proteinease K，50℃孵育45min，DNA提取试剂盒或酚氯仿法提取DNA，用15ul无DNA洗脱液洗脱DNA。
将上述获得的DNA，分别取1ul进行斑点杂交检测，或构建DNA文库。
DNA斑点杂交：将1～3ul获取的DNA，点到带正点的尼龙膜上，用鲑鱼精DNA封闭膜10分钟，洗膜，加入探针，37℃孵育1小时，洗膜，加入链霉亲和磁珠-HRP孵育30分钟，加入发光液，曝光显色。
图5为检测结果，阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针。阳性检测DNA为端粒重复序列，阴性检测DNA为Alu重复序列。从图中结果，我们可以看出，TERC探针明显捕获到与TERC结合的端粒重复序列，而阴性探针LacZ明显没有捕获到端粒重复序列，说明我们的探针捕获与RNA结合的DNA的效率及特异性非常高。
序列表
<110> 广州赛诚生物科技有限公司
<120> 一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法
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