一种判断女性原发不孕的标记cdc20基因及其检测试剂盒
阅读说明：本技术 一种判断女性原发不孕的标记cdc20基因及其检测试剂盒 (Marker CDC20 gene for judging female primary infertility and detection kit thereof ) 是由 王磊 桑庆 赵琳 于 2019-12-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因检测技术领域,具体为一种判断女性原发不孕的标记及其检测试剂盒。本发明涉及的标记为人类CDC20基因,它的突变是导致因卵子不成熟、受精及胚胎异常致女性不孕的原因。本发明还提供检测CDC20基因是否发生突变的的引物：SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.17；以及检测CDC20基因发生突变筛查试剂盒。本发明可用于指导临床相应患者是否合适进行试管婴儿术。(The invention belongs to the technical field of gene detection, and particularly relates to a marker for judging female primary infertility and a detection kit thereof. The marker of the invention is human CDC20 gene, and the mutation is the cause of female sterility caused by ovum immaturity, fertilization and embryo abnormality. The invention also provides a primer for detecting whether the CDC20 gene is mutated: SEQ ID NO.2 to SEQ ID NO. 17; and a screening kit for detecting mutation of CDC20 gene. The invention can be used for guiding the clinical corresponding patient whether to carry out the test tube infant operation.)
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测女性原发不孕的标记及其检测试剂盒。
背景技术
正常怀孕及生殖是维持及延续人类种群的重要环节。对于女性不孕，目前已经有ZP-1，Stag3，FSHR等基因被发现与女性不孕症密切相关（Huang HL et al, Mutant ZP1 infamilial infertility. N Engl J Med. 2014 370(13):1220-6;de Roux N et al, Afamily with hypogonadotropic hypogonadism and mutations in the gonadotropin-releasing hormone receptor. N Engl J Med. 1997 337(22):1597-602;Caburet S etal, Mutant cohesion in premature ovarian failure. N Engl J Med.2014 370(10):943-9）。但是，均未在临床中应用。
导致女性不孕症的原因很多，有一些临床报道涉及以卵子不成熟为特征的女性不孕症的描述（Rudak et al, fertility and sterility,1990 54:292-296;HumanReproduction,1995 10:2343-2349; fertility and sterility 1999 71:567-570;HumanReproduction 2001 16(10):2136-2138;Human Reproduction 2002 17(6):1604-1609;Human Reproduction 2002 17(10):2556-2559）。这些病人通过反复进行受精-胚胎移植术（试管婴儿），均因未能获取到成熟卵细胞，而无法完成成功的体外受精操作。如果能发现相关致病基因，则对疾病临床诊断及分型都具有重要意义。最近我们发现了导致人类卵子成熟障碍的第一个致病基因TUBB8(N Engl J Med. 2016 Jan 21;374(3):223-32)。但是，此基因仅能解释部分患者的原因，相当多患者的原因依然未知。
经对现有技术文献的检索发现，仅发现少数几篇围绕CDC20基因功能的研究文章。这些研究报道了此基因在小鼠卵子减数分裂过程中起着重要作用，敲除导致雌鼠不孕。但是，至今未见关于CDC20基因突变与人类疾病之间关系的任何报道。也未发现其与女性不孕症相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作方便、效果明确的用于判断女性原发不孕的标记及其检测试剂盒。
本发明中，用于检测女性原发不孕的CDC20基因，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述女性原发不孕是指因卵子不成熟、受精及胚胎异常导致的女性不孕。
本发明还涉及筛查因卵子不成熟、受精及胚胎异常致原发性不孕的方法，就是通过检测CDC20基因是否发生突变来判断病人是否为卵子不成熟、受精及胚胎异常而导致的原发性不孕。患者携带CDC20基因突变表现为不孕，表现为卵子始终无法成熟、受精及胚胎异常、试管婴儿失败。
可见，CDC20基因是否发生突变可作为判断因卵子不成熟、受精及胚胎异常致女性不孕的标记。
检测CDC20基因是否发生突变方法，具体可从患者的外周血中提取DNA后，用PCR（多聚酶链式反应）法结合DNA测序，来检测CDC20基因是否发生了突变。
其中，检测的样本是DNA，该DNA样本来自于待检人群的外周血。
或者，检测的样本是RNA、蛋白、细胞或者血清样本，该样本来自于待检人群的外周血。
本发明涉及检测CDC20基因是否发生突变的引物。
CDC20基因有10个外显子，用于检测第1外显子的PCR扩增引物对为：
5’- CAGGCGTGTTAAAGCCGGT-3’（SEQ ID NO.2）
5’- ATGAAGGCTGCTCTCACTCAG-3’（SEQ ID NO.3）
测序引物对同上；
用于检测第2、3号外显子的PCR扩增引物对为：
5’-TCAGTGAGGTGCCAAAGGAA-3’（SEQ ID NO.4）
5’-AAATCAACACCTCCCTTGCCC-3’（SEQ ID NO.5）
测序引物对同上；
用于检测第4号外显子的PCR扩增引物对为：
5’-AAGACCCGAAGTTCCTGGTTC-3’（SEQ ID NO.6）
5’-GCTTGCACTCCACAGGTACA-3’（SEQ ID NO.7）
测序引物对同上；
用于检测第5号外显子的PCR扩增引物对为：
5’-CGGAAGACCTGCCGTTACAT-3’（SEQ ID NO.8）
5’-GGACTGGTGAGAATGACAGCA-3’（SEQ ID NO.9）
测序引物对同上；
用于检测第6、7号外显子的PCR扩增引物对为：
5’-GAGACGTGTCCAGTGCTGTC-3’（SEQ ID NO.10）
5’-AGCCCAACCCTACTCACCTT-3’（SEQ ID NO.11）
测序引物对同上；
用于检测第8号外显子的PCR扩增引物对为：
5’-CAAGGTGAGTAGGGTTGGGC-3’（SEQ ID NO.12）
5’-GGGACAGATCAAGGTGGTGG-3’（SEQ ID NO.13）
测序引物对同上；
用于检测第9号外显子的PCR扩增引物对为：
5’-GAGTCTGGAGCATGTGGCA-3’（SEQ ID NO.14）
5’-GCACTGGGCCACCCAC-3’（SEQ ID NO.15）
测序引物对同上；
用于检测第10号外显子的PCR扩增引物对为：
5’-TGGCTGCATCAGCATTCGTA-3’（SEQ ID NO.16）
5’-GAAGGCTGCTGGGACATAGG-3’（SEQ ID NO.17）
测序引物对同上。
本发明还涉及检测CDC20基因是否发生突变的方法，具体如下：
对其中1号外显子，利用引物对：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，进行PCR扩增（扩增条件：92℃ 2分钟，92℃ 30秒，57℃ 1分钟，72℃ 3秒（此三步重复35个循环）， 72℃ 10分钟），然后利用相同的引物进行测序，将测序结果与UCSC中CDC20的标准序列（SEQ ID NO.1）进行比对，从而发现突变；
与上述条件相似，CDC20的第2-10号外显子，由相应的引物进行扩增（SEQ ID NO.4-NO.17）；
进行测序，再与UCSC中CDC20的标准序列（SEQ ID NO.1）进行比对，从而发现突变；通过PCR及一代测序，及与标准序列的比对，来检测CDC20基因是否发生突变。
本发明还提供检测CDC20基因是否发生突变的试剂盒。此试剂盒可以指导医生对疾病病因的判断、对疾病进行正确分类，从而告知患者采用IVF法还是ICSI法进行试管婴儿操作，以及是否适合继续施行体外受精-胚胎移植术（IVF）或单精子注射术（ICSI）（试管婴儿）。
本发明提供的试剂盒，包括上述扩增 CDC20的1-10号外显子的扩增引物SEQ IDNO.2-SEQ ID NO.17，及反应混合液；反应混合液包括DNA聚合酶、dNTP及缓冲液；
具体使用方法为：将引物用水稀释为10uM浓度的工作液。反应体系为10ul，其中，1ul样本DNA，0.5ul正向引物，0.5ul反向引物，5ul反应混合液及3ul的水组成。混合后，按上述条件进行PCR反应，而后进行一代测序。
上述试剂盒可用于检测卵子不成熟、受精及胚胎异常致原发性不孕的筛查。
本发明还提供用于研究药物治疗卵子不成熟、受精及胚胎异常致原发性不孕的基因修复靶位点（即实际检测出的病人的突变位点，比如在表1中列出了6个突变位点，实际检测过程中，通过与标准序列比对，可能会存在新的突变位点），并通过对靶位点的修复，从而使得CDC20可以行使正常功能，进而可以治疗此种疾病。即本发明还可以提供研究用于修复基因突变靶位点的药物，即治疗卵子不成熟、受精及胚胎异常致原发性不孕的药物。
本发明还可通过检测CDC20基因的突变，指导临床具有此基因突变的病人，是否合适进行试管婴儿术。常规临床中，不明原因的不孕夫妇需要进行试管婴儿来尝试繁衍后代。但是，如果病人通过检测发现具有CDC20的突变，那么此病人若尝试试管婴儿术则会失败。因为，具有此突变的病人的卵子是不成熟的或者部分成熟卵子受精后胚胎异常难以获得有效胚胎，因而无法完成后续试管婴儿的操作。因此，建议此类病人进行捐卵。
附图说明
图1为病人突变在CDC20一级结构上的分布展示。
具体实施方式
以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：样本的收集和外周血DNA的抽提
卵子不成熟、受精及胚胎异常致原发性不孕患者来自于中国上海复旦大学某附属医院上海集爱遗传与不育诊疗中心、中国上海交通大学某附属医院生殖中心。诊断标准由RudakE等人（Rudak E., DorJ.,KimchiM.,Goldman B.,Levran D and Mashiach S, Anomaliesof human oocytes from infertile women undergoing treatment by in vitrofertilization. FertilSteril. 1990 Aug; 54(2):292-6）提出。男方精液检查正常，女方患者雌性生殖器官、卵巢功能、性激素均正常，2次以上促排周期每次取到5个以上卵子，卵子大部分处于GV期，不能进行正常的减数分裂及成熟，或者部分成熟卵子受精后胚胎异常。在知情同意的前提下参加本课题的研究，采集血液，并签署知情同意书。所有入组患者均通过病史排除其他生殖内分泌疾病。本实验的对照人群为1000个生育功能正常的女性，取样本血液300ul，按试剂盒说明书提取DNA，用紫外分光光度仪检测DNA浓度和纯度。
实施例2：检测CDC20基因的突变
本发明采用PCR结合测序进行CDC20基因突变的寻找。其原理是先对 CDC20基因的10个外显子进行引物设计（可具体给出引物序列）及扩增，进行CDC20基因突变的寻找。（即将DNA样本与反应工作液（DNA聚合酶、dNTP，水及缓冲液）混合后混匀，依照PCR程序进行扩增。所得产物，经过纯化及进一步测序反应，在ABI3730测序上测序。结果分析通过HLA Fusion 软件(One lambda, CA, USA, HLA Fusion 3.0)进行。
实施例3：CDC20基因突变与因卵子不成熟、受精及胚胎异常而致原发性不孕
结果：我们共搜集到CDC20基因突变所致因卵子不成熟、受精及胚胎异常而致原发不孕患者5例。相应突变位点信息见下表（表1）。突变位点在结构上的分布见图1所示。
表1 病人CDC20基因突变信息
。
综上所述，本发明的具有如下重要实际意义：
（1）可以利用本发明提出的CDC20基因作为预测因卵子不成熟、受精及胚胎异常致女性不孕的标记基因；
（2）利用本发明提供的CDC20基因可用于评价或制备因卵子不成熟、受精及胚胎异常致女性不孕的筛查试剂盒；
（3）利用本发明，可以研究制备修复基因突变靶位点的药物，即治疗卵子不成熟、受精及胚胎异常致原发性不孕的药物；
（4）利用本发明提供的CDC20基因可用于指导临床具有此基因突变的病人，判断试管婴儿的成功可能性，并建议进行后续的捐卵。
序列表
<110> 复旦大学
珠海复旦创新研究院
<120> 一种判断女性原发不孕的标记CDC20基因及其检测试剂盒
<130> 001
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcacagt tcgcgttcga gagtgacctg cactcgctgc ttcagctgga tgcacccatc 60
cccaatgcac cccctgcgcg ctggcagcgc aaagccaagg aagccgcagg cccggccccc 120
tcacccatgc gggccgccaa ccgatcccac agcgccggca ggactccggg ccgaactcct 180
ggcaaatcca gttccaaggt tcagaccact cctagcaaac ctggcggtga ccgctatatc 240
ccccatcgca gtgctgccca gatggaggtg gccagcttcc tcctgagcaa ggagaaccag 300
cctgaaaaca gccagacgcc caccaagaag gaacatcaga aagcctgggc tttgaacctg 360
aacggttttg atgtagagga agccaagatc cttcggctca gtggaaaacc acaaaatgcg 420
ccagagggtt atcagaacag actgaaagta ctctacagcc aaaaggccac tcctggctcc 480
agccggaaga cctgccgtta cattccttcc ctgccagacc gtatcctgga tgcgcctgaa 540
atccgaaatg actattacct gaaccttgtg gattggagtt ctgggaatgt actggccgtg 600
gcactggaca acagtgtgta cctgtggagt gcaagctctg gtgacatcct gcagcttttg 660
caaatggagc agcctgggga atatatatcc tctgtggcct ggatcaaaga gggcaactac 720
ttggctgtgg gcaccagcag tgctgaggtg cagctatggg atgtgcagca gcagaaacgg 780
cttcgaaata tgaccagtca ctctgcccga gtgggctccc taagctggaa cagctatatc 840
ctgtccagtg gttcacgttc tggccacatc caccaccatg atgttcgggt agcagaacac 900
catgtggcca cactgagtgg ccacagccag gaagtgtgtg ggctgcgctg ggccccagat 960
ggacgacatt tggccagtgg tggtaatgat aacttggtca atgtgtggcc tagtgctcct 1020
ggagagggtg gctgggttcc tctgcagaca ttcacccagc atcaaggggc tgtcaaggcc 1080
gtagcatggt gtccctggca gtccaatgtc ctggcaacag gagggggcac cagtgatcga 1140
cacattcgca tctggaatgt gtgctctggg gcctgtctga gtgccgtgga tgcccattcc 1200
caggtgtgct ccatcctctg gtctccccat tacaaggagc tcatctcagg ccatggcttt 1260
gcacagaacc agctagttat ttggaagtac ccaaccatgg ccaaggtggc tgaactcaaa 1320
ggtcacacat cccgggtcct gagtctgacc atgagcccag atggggccac agtggcatcc 1380
gcagcagcag atgagaccct gaggctatgg cgctgttttg agttggaccc tgcgcggcgg 1440
cgggagcggg agaaggccag tgcagccaaa agcagcctca tccaccaagg catccgctga 1500
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggcgtgtt aaagccggt 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaggctg ctctcactca g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcagtgaggt gccaaaggaa 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaatcaacac ctcccttgcc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagacccgaa gttcctggtt c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcttgcactc cacaggtaca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggaagacct gccgttacat 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggactggtga gaatgacagc a 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagacgtgtc cagtgctgtc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcccaaccc tactcacctt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caaggtgagt agggttgggc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggacagatc aaggtggtgg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagtctggag catgtggca 19
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcactgggcc acccac 16
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggctgcatc agcattcgta 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggctgct gggacatagg 20