具体实施方式

实施例1

1资料与方法：

1.1研究对象：

选取2018年6月-2019年6月在广东省中医院妇科门诊就诊的19名PCOS患者作为研究对象。纳入标准：①符合西医PCOS诊断标准者；②符合中医月经不调、不孕症、闭经的诊断标准者；③3个月内未使用任何激素类药物；④所选取的志愿者均符合采样前4周内未使用抗生素、益生菌或免疫抑制剂，无肠炎、急慢性胃肠道疾病、自身免疫性疾病等，无相关手术史。⑤招募前告知了用药前后需收集生物样本用于评估中医治疗效果观察。⑥所选志愿者在采样前均详细了解了采样流程及研究目的，并签署知情同意书。排除标准：高雄激素血症或排卵功能障碍(库欣综合征，21-羟化酶缺乏症，甲状腺疾病，雄激素分泌性肿瘤，先天性肾上腺增生和高泌乳素血症)。本研究获得广州中医药大学第二附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1标本取样 分别在PCOS患者初次被诊断为多囊卵巢综合征且未使用过药物时和治疗三个月后分别留取粪便标本，粪便标本避开经期采集，使用ML-001A粪便标本采集套装(深圳达云基因科技有限公司)，采集成形粪便(约5g)，-80℃冻存，后进行PCR扩增与测序。1.2.2

1.2.2实验室检测

1.2.2.1 DNA提取及文库制备 每个粪便样品的冷冻试样(约5g)，用Zymol DNA提取试剂盒提取DNA，DNA浓度和纯度使用NanoDrop系统(Thermo Fisher Scientific)进行测量并通过琼脂糖凝胶电泳估计分子大小，合格后进行PCR扩增并进行16s rDNA测序。

1.2.2.2 16s rDNA测序 取质量合格的基因组DNA样品30ng及对应的融合引物配置PCR反应体系，设置PCR反应参数进行PCR扩增，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化并溶于Elution Buffer，贴上标签，完成建库。使用Agilent 2100Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小，利用HiSeq平台进行测序。测序后首先进行数据过滤，剩余高质量Clean data用于后期分析；将reads拼接成 Tags再聚类成OTU并与数据库比对、物种注释；基于OTU和注释结果进行样品物种复杂度分析，组间物种差异分析等，测序由深圳华大基因股份有限公司完成。

1.2.2.3生物信息分析 所有16s rDNA测序的数据均用R语言进行分析，用KruskalWallis 检验对组间α-多样性进行对比分析；用偏最小二乘回归分析法进行组间PLS-DA判别分析；用Kruskal Wallis检验对四组间差异菌的相对丰度进行对比分析；使用Wilcox检验对于治疗前后两组间功能预测值进行比较；所有统计结果均以P＜0.05表示有统计学意义。组间标志菌种lefse分析，用非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验筛选出biomarker菌种(P＜ 0.05)，再用线性判别分析(LDA)对biomarker菌种评估差异显著物种的影响力(即LDA score)，取LDA＞2.0的菌种，为有统计学意义的标志菌种。

1.3中医治疗

1.3.1中医辨证 根据广州中医药大学第二附属医院体检中心中医体质评分量表，计算转化分数，偏颇体质中转化分数≥40即为是该种体质，分为阳虚质、阴虚质、气虚质、痰湿质、湿热质、血瘀质、特禀质、气郁质共8种偏颇体质。[转化分数＝(原始分-条目数/条目数×4) ×100]。

1.3.2中医药治疗 气化是自然周期节律调控机制的理论基础，气化运动是动态节律的动力，气化运动的形式为阴阳开阖枢，月经病的核心病机在厥阴气化。稀发排卵辨证思维是虚、寒、瘀、痰。根据体质用药：阳虚(当归四逆汤加减)、阴虚(麦门冬汤加减)、气虚(柴桂干姜汤加减或白术厚朴汤加减)、痰湿(温胆汤加减)、湿热(葛根芩连汤加减或柏子仁丸加减)、血瘀(温经汤加减)、气郁质(柴归汤加减或四逆散加减，其中柴桂汤为小柴胡汤加当归芍药散)。

1.3.3疗效判断 每月自行月经，BBT体温双向有排卵，其他临床表征明显改善，判定为治疗有效；2-3月未行月经，需要用达芙通或达英35治疗，判定为治疗无效。

2.结果

2.1一般情况 19例PCOS患者共38份粪便标本，其中有效组治疗前12份、有效组治疗后 12份、无效组治疗前7份、无效组治疗后7份。PCOS亚型分型中：I型12例、II型3例、 III型4例、IV型0例，具体信息见表1。

表1 治疗前后不同疗效四组各指标统计结果

2.2肠道微生物组学特征性研究

2.2.1多样性分析 有效组治疗前和治疗后，无效组治疗前和治疗后，对四组间肠道菌群α- 多样性的Shannon指数和Simpson指数以及β-多样性Pielou指数进行对比分析，未发现具有统计学意义的差异，见图1。

2.2.2判别分析(Partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)对不同疗效 PCOS患者治疗前和治疗后肠道菌群分别进行横断面对比分析，比较不同疗效PCOS患者同一时间点肠道菌群差异；判别分析结果显示，治疗前和治疗后，不同疗效PCOS患者均分别聚集到两个分类。并对不同疗效的两组PCOS患者，分别进行治疗前后的纵断面分析，也聚集到两个分类，见图2。

2.2.3LefSe(LDA Effect Size)分析 对四组受试者微生物丰度水平分别进行两组间LefSe 分析，在属水平有5个类群的LDA值大于2。有效组和无效组治疗前菌群结构对比分析发现，琥珀酸杆菌(Succinatimonas)在无效组治疗前明显富集；有效组和无效组治疗后菌群结构对比分析发现，嗜血杆菌(Haemophilus)和琥珀酸杆菌(Succinatimonas)在无效组治疗后明显富集，而嗜胆菌属(Bilophila)在有效组治疗后明显富集；有效组治疗前和治疗后菌群结构对比分析发现，肠杆菌科(Coriobacteriaceae)在有效组治疗后明显富集；无效组治疗前和治疗后菌群结构对比分析发现，厌氧杆菌(Anaerostipes)在无效组治疗前明显富集，治疗后显著减少，见图3。

2.2.4相对丰度变化分析

2.2.4.1两组间相对丰度分布 观察差异菌在两组间的相对丰度分布，发现有一种相对丰度＞1％的主要菌群肠杆菌科(Coriobacteriaceae)发生了变化。除了琥珀酸杆菌(Succinatimonas)在低丰度水平(相对丰度＜0.1％)发生变化外，其他3个菌群均在相对中等丰度(0.1％＜相对丰度＜1％)发生显著变化，见图4。

2.2.4.2四组间相对丰度分布 观察肠杆菌科和琥珀酸杆菌科在四组中的分布进行分析，发现肠杆菌科仅在治疗好转后的PCOS患者肠道内发生了显著的升高，在其他3组中均显示低丰度(P＜0.05)。琥珀酸杆菌科在有效组肠道内未检测到，仅在无效组中检测到(P＝0.002)，无效组治疗前琥珀酸杆菌科阳性率为42.86％，治疗后阳性率升高为57.14％，见图5。

2.2.5PICRUSt功能预测(Phylogenetic Investigation of Communities byReconstruction of Unobserved States，PICRUSt) 通过KO数据库比较筛选出不同组间微生物导致的代谢及功能差异，使用Wilcox检验对于功能预测值进行比较，选取统计学相关性最显著的18个功能种类，内分泌系统代谢功能在有效组治疗后PCOS患者中显著增加(P＝0.0242)，见图6。

2.3愈后判断模型

2.3.1 PCOS治疗有效组肠道菌群生物标志物的筛选

(1)提取PCOS患者有效组和无效组治疗前的粪便样品中DNA；

(2)16sDNA测序并分析计算出物种的相对丰度；

(3)使用R包随机森林模型筛选特征变量，进行1000次的交叉验证得到候选菌，利用 RF模型筛选的物种相对丰度对每一个体计算其治疗有效的概率，绘制ROC曲线，并计算出AUC 作为愈后判断模型效能评价参数，选取标志物组合数＜20，且判别效能最佳的组合，在模型中输出每个物种的重要性指数，重要性指数越高，代表该标志物用来判别有效组和无效组的重要性越高。

2.3.2愈后预测模型构建

通过随机森林模型筛选特征变量，进行交叉验证得到5个菌群的最优组合，ROC曲线图显示，当Faecalibacterium(栖粪杆菌属)、Actinomyces(放线菌属)、Succinatimonas(琥珀酸单胞菌属)、Butyricicoccus(丁酸梭菌属)、Streptococcus(链球菌属)5个菌属联合诊断时，AUC为88.57％，临界值为0.416，具有较好的愈后判断价值，见图7。

实施例1通过16s rDNA测序评估经中医药治疗后多囊卵巢综合征患者显著差异性微生物，为挖掘该核心菌群的关键功能，为应用于监测治疗效果奠定基础。