基于基因检测与血栓弹力图结合预测氯吡格雷疗效及应用
阅读说明：本技术 基于基因检测与血栓弹力图结合预测氯吡格雷疗效及应用 (Prediction of clopidogrel curative effect based on combination of gene detection and thromboelastogram and application ) 是由 蓝晓红 周永刚 魏玮 臧菊香 李祥 张烨 于浩 陈颖 唐佳丽 陈曙东 吴冬妮 于 2021-03-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,提供基于基因检测与血栓弹力图结合预测氯吡格雷疗效及其应用,旨在提出在冠心病患者中采用CPY2C19基因多态性与血栓弹力图(Thrombelastograghy,TEG)检测结合预测氯吡格雷抗血小板疗效,可对高危患者、高密度脂蛋白水平降低或者基因测定为中代谢、慢代谢型的冠心病患者进行TEG的二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)抑制率结果确认。确保氯吡格雷的治疗疗效,减少急性心血管不良事件发生,提升临床药师参与个体化药物治疗的服务水平。(The invention belongs to the technical field of biology, provides a method for predicting clopidogrel curative effect based on combination of gene detection and a thromboelastogram and application thereof, and aims to provide a method for predicting clopidogrel antiplatelet curative effect by combining CPY2C19 gene polymorphism and Thromboelastogram (TEG) detection in patients with coronary heart disease, and can confirm the Adenosine Diphosphate (ADP) inhibition rate result of TEG on patients with high risk and high-density lipoprotein level reduction or patients with coronary heart disease with gene determination of medium metabolism and slow metabolism. The therapeutic effect of clopidogrel is ensured, the occurrence of acute cardiovascular adverse events is reduced, and the service level of clinical pharmacists participating in individualized drug therapy is improved.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于基因检测与血栓弹力图结合预测氯吡格雷疗效及应用，尤其是CYP2C19基因多态性结果在预测氯吡格雷抗血小板疗效中的应用。
背景技术
CYP2C19是CYP450家族中最重要的药物代谢酶之一，许多内源性底物、及临床大约2％的药物都由其催化代谢，研究发现CYP2C19可影响到氯吡格雷等许多药物的代谢。而其基因多态性是引起个体和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的重要原因。
CYP2C19基因野生型为CYP2C19*1/*1型，中国人群较常见的等位基因是CYP2C19*2型、CYP2C19*3型和CYP2C19*17型，其中CYP2C19*2、CYP2C19*3型可引起CYP2C19基因编码的酶活性减弱，代谢底物的能力减弱，造成活性代谢产物不能生成，导致氯吡格雷抵抗，此基因型携带者称为弱代谢者。中国人群中弱代谢者99％为*2和*3型等位基因。CYP2C19基因编码的酶活性增强，此基因携带者称为强代谢者。因此，2010年美国FDA要求氯吡格雷说明书上建议使用该药前检测CYP2C19基因多态性。
氯吡格雷是目前临床应用最为广泛的抗血小板药物之一，其属于血小板膜表面ADP受体阻滞剂，是一种前体药物，代谢过程受到肝脏P450酶基因(如CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4/5、2B6和1A2等)多态性的影响。研究显示，上述的多种基因多态性中，CYP2C19的基因多态性与氯吡格雷抵抗相关性最大。有些基因突变个体由于该药物无法代谢产生活性，而导致药物无效，严重危及患者的生命。因此，如何准确预测氯吡格雷抗血小板反应的差异，实现冠心病患者的个体化治疗，始终是临床药学领域研究的焦点和亟待解决的问题。
CYP2C19基因多态性在不同人种分布差异较大，CYP2C19*1、*2、*3和*17在不同人群所占比例稳定且较高。CYP2C19*2等位基因分布在黄种人、白种人和黑种人分别为：29％、12％和15％。CYP2C19酶存在多种突变等位基因，其中CYP2C19*1最常见，决定着药物的正常代谢；CYP2C19*2和CYP2C19*3是功能缺失等位基因，均能造成CYP2C19酶活性的降低或完全丧失，从而对经其代谢的药物疗效产生影响，检测这两个位点可覆盖99％以上的中国人群。
TEG方法于1948年由德国学者Harter发明，目前为临床围术期监测凝血功能最重要的指标。以其为主要监测手段的体外循环术中凝血功能监测方法已在50多个国家广泛使用。近来通过TEG技术评估抗血小板药物的效果也迅猛发展，在指导个体化抗血小板药物治疗中发挥了重要作用。
目前，临床上普遍采用的血小板聚集率检测仅对血小板功能粗略估计，但准确性差，且无法明确是否为氯吡格雷抵抗造成的血小板抑制异常，但是TEG能够不用特殊处理，动态监测整个凝血及纤溶过程，相比较其他传统的凝血检测方法，更加的快捷、简单化，且通过不同诱导途径可明确，缺点是价格稍贵。
心血管系统血栓形成与血管内皮破损、脱落，血流速度改变，血液凝固性增加，血管内放置支架等因素密切相关。而冠心病患者PCI术后支架内血栓形成主要与支架贴壁不良、未严格控制冠心病的危险因素、内皮愈合不良、氯吡格雷抵抗等相关。除药物相互作用、合并疾病等临床环境因素外，遗传因素很大程度上(遗传度为73％)与氯吡格雷抵抗相关。研究表明，氯吡格雷的反应性与心血管事件的遗传决定因素密切相关。新英格兰杂志对实行PCI的1535名患者进行了RCT研究，结果显示：CYP2C19慢代谢型与正常代谢型相比心血管事件发生率分别为21.5％、13.3％，慢代谢型较正常代谢型患者心血管事件风险增加了60％、3.58倍。但该CYP2C19中、慢代谢型仅能解释约12％的氯吡格雷反应性个体间差异，且该变异型对ACS和PCI术后患者抗血小板药物效果的预测有限。因此，单纯药物基因组学研究难以为氯吡格雷治疗患者提供充分的个体化用药信息，有必要探索新的预测氯吡格雷抗血小板反应性方法，并与之结合，减少冠心病患者急性心血管事件的发生。
发明内容
本发明的目的是提供基于基因检测与血栓弹力图结合预测氯吡格雷抗血小板疗效及其应用，可对高危患者、高密度脂蛋白水平降低或者基因测定为中慢代谢型的冠心病患者进行TEG的ADP抑制率结果确认。确保氯吡格雷的治疗疗效，减少急性心血管不良事件发生，提升临床药师参与个体化药物治疗的服务水平。
本发明的目的是提供基于基因检测与血栓弹力图结合预测氯吡格雷疗效，包括以下步骤：
1)抽取冠心病患者静脉血，利用CYP2C19试剂盒检测CYP2C19基因多态性代谢类型；
2)另抽取冠心病患者静脉血，并加入抗凝剂；
3)将步骤2)中血样通过血栓弹力图分析仪制得血栓弹力图检测氯吡格雷ADP抑制率；
4)结合步骤1)中CYP2C19基因多态性代谢类型和步骤3)得到的ADP抑制率分析患者对氯吡格雷的抑制效果。
作为优选，所述CYP2C19试剂盒可检测CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的基因多态性。
作为优选，所述抗凝剂为枸橼酸钠抗凝剂或者肝素钠抗凝剂。
本发明还提供一种如前述所述的基于基因检测与血栓弹力图结合预测氯吡格雷在冠心病患者中的疗效及应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过检测不同患者的CYP2C19基因多态性，并结合血栓弹力图分析ADP抑制率，给与冠心病患者治疗方案决策，减少急性心血管不良事件发生。
附图说明
图1为2054例冠心病患者CYP2C19基因多态性分布图；其中，a为超强代谢型、b为强代谢型、c为中代谢型、d为慢代谢型。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明所要解决的技术问题为如何预测冠心病患者抗血小板药物氯吡格雷治疗疗效或氯吡格雷抵抗，避免或减少因抗血小板药物疗效不佳导致的急性心血管事件发生。
为解决上述问题，本发明首先公开了服用氯吡格雷的冠心病患者PCR检测CYP2C19的基因多态性与血栓弹力图检测ADP抑制率相结合，系统预测氯吡格雷的抗血小板疗效及临床应用。
实施例1利用CYP2C19试剂盒检测CYP2C19基因多态性代谢类型
(1)试剂准备
从冰箱中取出CYP2C19试剂盒，PCR反应液、阳性对照品和空白对照品，平衡至室温，待各组分充分融解后，振荡混匀，快速离心10s。根据该次实验所要的反应数(n)，按23ul/孔分装量将每种反应液分别分装到n个反应管中，PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-20±5℃冰箱冷冻避光保存。n＝样本数+空白对照+弱阳性对照。
(2)样本DNA提取
试剂使用前先在溶液漂洗液PWB中加入无水乙醇，加入体积60ml。250ul血液加650ul细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向细胞核沉淀中加200ul缓冲液GS，振荡至彻底混匀。在上述样品中加200ul缓冲液GB和20ul蛋白酶K，充分颠倒混匀，56℃放置10min(期间颠倒混匀数次)，最后溶液应变清亮。上述样品室温放置2-5min后，加350ul缓冲液BD，充分颠倒混匀。将上述样品加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的溶液，将吸附柱放入收集管中。吸附柱中加500ul缓冲液GDB，12000rpm离心30S，倒掉收集管中的溶液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加600ul溶液漂洗液PWB，12000rpm离心30S，倒掉收集管中的溶液，将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，室温静置2min。吸附柱转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空+70ul洗脱缓冲液TB进行洗脱，室温静置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集至离心管中。
(3)加样
将待测样本的基因组DNA，弱阳性对照、空白对照，分别加入已装有3种PCR反应液的反应管中，即每个待测样本分别用此3种PCR反应液进行检测，加入量为2ul/孔。盖好PCR反应管，记录样本加样情况。将PCR反应管转移到核酸扩增区上机检测。若临时情况不能立即上机，建议将加好模板的PCR反应管放于2-8℃条件保存，并在24h内尽快上机检测。
(4)PCR扩增
开机并进行仪器性能自检。取样本准备区准备好的PCR反应管，放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序。设置仪器扩增相关参数，并开始进行PCR扩增。反应结束后，根据扩增曲线，划定合适基线和荧光阈值，得到不同通道Ct值并进行结果判定。判定结果分为：超强代谢型、强代谢型、中代谢型、慢代谢型。利用荧光定量PCR法检测所述CYP2C19代谢类型，如为中、慢代谢基因型或同时为高危患者、高密度脂蛋白水平降低患者，则需要行TEG检测氯吡格雷ADP抑制率。
CYP2C19不同位点的等位基因对氯吡格雷的代谢作用强度不同，在各等位基因中，*1为正常功能等位基因，*2和*3为功能缺失或降低等位基因，*17为功能增强等位基因。本实施例中共采集2054例冠心病患者的静脉血样，分析CYP2C19基因多态性，实验结果如表1和图1所示。
表1
实施例2通过血栓弹力图分析仪制得血栓弹力图得到ADP％抑制率
(1)实验前配液
从试剂包中分别取出试剂A、试剂B、试剂C和H2O；打开试剂A瓶盖，取40ul H2O加入试剂A瓶中，盖上试剂A瓶盖，充分摇匀；打开试剂B瓶盖，取40ul H2O加入试剂B瓶中，盖上试剂B瓶盖，充分摇匀；打开试剂C瓶盖，取40ul H2O加入试剂C瓶中，盖上试剂C瓶盖，充分摇匀。
(2)装杯
在TEG的四个通道上依次装载普通杯、巴曲酶杯、二磷酸腺苷杯和花生四烯酸杯。
(3)激活
用1ml移液器移取枸橼酸钠抗凝全血样本1ml到试剂1瓶中，颠倒试剂瓶5次使之充分混匀，静置4min激活血液。
(4)检测
普通杯检测：激活完成后，移取20ul试剂2至普通杯杯底，然后移取340ul试剂1瓶中的血液到普通杯中，将测试杯推至顶端，将测试杆拨至“测试”位中。
巴曲酶杯检测：打开试剂A瓶吸取10ul加入巴曲酶杯，再加入肝素化血样360ul，抽吸三次，将测试杯推至顶端，将测试杆拨至“测试”位。
二磷酸腺苷杯检测：打开试剂A瓶吸取10ul，然后打开试剂B瓶吸取10ul加入二磷酸腺苷杯，再加入肝素化血样360ul，于杯中混吸三次，将测试杯推至顶端，将测试杆拨至“测试”位。
花生四烯酸杯检测：打开试剂A瓶吸取10ul，然后打开试剂C瓶吸取10ul加入花生四烯酸杯，再加入肝素化血样360ul，于杯中混吸三次，将测试杯推至顶端，将测试杆拨至“测试”位。
凝血过程约30min结束，如观察纤溶过程需延长至1h，测试完成后，在软件界面点击“停止”，卸去测试杯，按实验室要求丢弃处理。
查看抑制率：点击软件上的“复合”，再点击普通杯、巴曲酶杯和二磷酸腺苷杯三个通道的测试结果图，进行复合显示，点击“完成”即可查看ADP的抑制率信息。点击普通杯、巴曲酶杯和花生四烯酸杯三个通道的测试结果图，进行复合显示，即可查看AA的抑制率信息。
检验结果解释：抑制率＜50％，提示药物没能起到好的抗凝效果，存在一定程度的药物抵抗；抑制率≥50％，提示药物起效，抑制明显。
随机选取30例冠心病患者，根据其血栓弹力图分析ADP抑制率，并结合其CYP2C19基因多态性确定氯吡格雷抗血小板治疗方案，结果如表2所示。
表2
本发明通过检测冠心病患者的CYP2C19基因多态性，确定患者的氯吡格雷代谢类型，并结合患者的ADP抑制率，确定氯吡格雷的给药方案，避免因统一的给药方案，耽误冠心病患者的抗血小板治疗的疗效，以减少或避免急性心血管不良事件发生。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何的简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。