牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗及其制备方法
阅读说明：本技术 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗及其制备方法 (Bivalent live vaccine for bovine viral diarrhea and bovine infectious rhinotracheitis and preparation method thereof ) 是由 闫喜军 孟庆森 李真光 和彦良 陈超阳 宋妮 季烨 王宇菲 武华 于 2020-10-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗的制备及其应用,属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。该疫苗包含活的牛病毒性腹泻病毒NMM株和牛传染性鼻气管炎病毒JSM株。制备该疫苗的步骤包括,1)两种有效毒株的获得和致弱培养；2)MDBK细胞悬浮培养分别制备病毒抗原；3)以滴度为10～(4.7)TCID-(50)的浓度进行配比、分装,添加20%的冻干保护剂后冷冻干燥。所制备牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗病毒滴度在10～(3.5)TCID-(50)的浓度下可获得病毒滴度分别为10～(7.3)TCID-(50)和10～(7.8)TCID-(50)的灭活疫苗同样的免疫效果,超剂量接种安全性评价及效力试验评价结果显示,本发明所述牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗具有低成本、高功效及接种安全的特点。(The invention discloses a preparation method and application of a bovine viral diarrhea and bovine infectious rhinotracheitis bivalent live vaccine, and belongs to the technical field of animal vaccines and veterinary biological products. The vaccine comprises a live bovine viral diarrhea virus NMM strain and a bovine infectious rhinotracheitis virus JSM strain. The preparation method of the vaccine comprises the steps of 1) obtaining and weakening culture of two effective strains; 2) respectively preparing virus antigens by MDBK cell suspension culture; 3) to a titer of 10 4.7 TCID 50 The concentration of the active ingredients is proportioned and subpackaged, and then the active ingredients are frozen and dried after 20 percent of freeze-drying protective agent is added. The virus titer of the prepared bovine viral diarrhea and bovine infectious rhinotracheitis bivalent live vaccine is 10 3.5 TCID 50 At a concentration of 10 virus titers respectively 7.3 TCID 50 And 10 7.8 TCID 50 The inactivated vaccine has the same immune effect, and the results of the overdose inoculation safety evaluation and the efficacy test evaluation show that the bovine viral diarrhea and bovine infectious rhinotracheitis bivalent live vaccine has the characteristics of low cost, high efficacy and safe inoculation.)
技术领域
本发明属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，具体地说，涉及一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea/Mucosal Disease，BVD/MD）是由病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的，临床表现为腹泻、发热、白细胞减少、黏膜糜烂溃疡、腹泻或咳嗽为主要特征的一种传染病，可使牛出现BVDV持续性感染，多数持续性感染动物外观健康，但生产性能下降，且成为重要的传染源，对我国养殖业威胁较大，并造成了严重的经济损失，是危害养牛业的重要病原之一，该病最早于1946年发现于美国，后呈爆发式全球流行。上个世纪80年代该病在我国即有流行的报道，血清学调查表明我国BVDV平均感染率为56.5%，其中阳性率最高的省份高达84.9%，最低为5.2%，该病流行范围几乎已经遍布我国各地，给我国养牛业造成了巨大的危害和经济损失。农业部发布的第96号公告，将牛病毒性腹泻定义为三类疫病。世界动物卫生组织（OIE）列为必须上报疫病。
牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛疱疹病毒I型（BHV-I）病毒引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，表现为上呼吸道及气管黏膜发炎、呼吸困难、流鼻涕及流泪等症状，还可引起生殖系统损害 , 继发性的细菌感染能导致更严重的呼吸道疾病。本病可表现为多种类型，包括呼吸道型、生殖道感染型、脑膜炎型和眼炎型。本病给养牛业造成较大的经济损失。它可延缓育肥牛的成长和增重；小牛感染后出现脑炎等症状 , 有时也发生眼结膜炎和角膜炎。乳牛患病后，产乳量大减，甚至完全停止产乳。该病于二十世纪50年代初最早见于美国，目前世界范围内流行。我国于1980年首次从新西兰进口种牛中发现此病，目前在大部分省份的奶牛、地方黄牛和水牛均有IBRV感染。血清流行病学调查研究表明，我国牛传染性鼻气管炎血清阳性率从3%～70%不等，平均阳性率达到38%。在病原学研究进展，近些年来从多个地区分离到了IBRV，感染牛场的奶牛产奶量下降，死淘率增加，造成了巨大的经济损失。随着我国养牛业的发展，该病对我国奶牛业和肉牛业的影响越来越大。
目前，预防牛病毒性腹泻/黏膜病和牛传染性鼻气管炎多采用疫苗接种，商品化疫苗主要是弱毒活疫苗和灭活疫苗，二者各有优缺点。灭活疫苗诱导产生的免疫反应持续时间较短，需要多次接种，且不能诱导细胞毒T淋巴细胞反应。目前我国商品化的疫苗很少，养牛业面临着巨大的威胁，进口疫苗价格昂贵，疫情发生时无法快速获得。在临床研究中发现，BVDV和IBRV往往混合感染。因此国内急需研制牛病毒性腹泻/粘膜病、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗，以达到一针防两病，提高免疫效果，节省劳动力，降低成本的目的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种利用MDBK细胞悬浮生产牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗的方法。
本发明牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗，该疫苗有效成分包含活的牛病毒性腹泻I型病毒抗原和牛传染性鼻气管炎病毒抗原；牛病毒性腹泻I型病毒抗原含量不低于103.5TCID50/ml，牛传染性鼻气管炎病毒抗原含量不低于10 3.5TCID50/ml条件下配制混合均匀形成病毒混合液，加入冻干保护液混匀后分装。
进一步地，活性成分为牛病毒性腹泻I型病毒NMM株和牛传染性鼻气管炎病毒JSM株。
进一步地，牛病毒性腹泻I型病毒为连续传代培养的致弱病毒毒株NMM株，牛传染性鼻气管炎病毒为连续传代培养的致弱病毒JSM株。
进一步地，病毒抗原生产方法为两种病毒分别接种悬浮培养的MDBK细胞获得。
进一步地，悬浮培养的MDBK细胞由0.25%胰酶消化的单层MDBK细胞制备。
进一步地，所述活疫苗两种病毒液配苗滴度不低于104.7TCID50/ml。
进一步地，所述冻干保护剂为明胶蔗糖保护剂，分别含明胶2%，蔗糖5%和硫脲1%。
进一步地，病毒混合液与冻干保护剂的混合比例为4:1。
根据上述牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗的技术方案，详细的制备方法为：
1. 抗原生产毒株：牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗，其病原生产毒株为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NMM株和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）JSM株。两种制苗用毒株分别F85和F111，能被特异性阳性血清中和，免疫荧光试验出现特异性荧光，经细菌、霉菌、支原体和外源病毒检测合格无污染的免疫原性良好的减毒或弱毒性病毒株。
2. 宿主细胞培养；取生长良好的MDBK细胞接种到细胞培养瓶中，当细胞长成致密单层时用0.25%胰酶消化成单个细胞并计数。
3. 牛病毒性腹泻病毒毒液生产：按一定细胞接种密度接入细胞一级生物反应器中培养，当细胞密度达到标准（不低于2.5×106个/ml）时，（以MOI为0.04～0.06）接种牛病毒性腹泻病毒生产毒种NMM株，特定条件下培养一定时间后（37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50%的条件下培养48～60小时），收获病毒液，测定病毒含量并进行无菌检验后，置-15℃以下保存，备用。
4. 牛传染性鼻气管炎病毒毒液生产：按上述MDBK细胞培养程序，（以MOI为0.01～0.03）接种牛传染性鼻气管炎病毒生产毒种JSM株，特定条件下培养一定时间后（37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50%的条件下培养24～36小时），收获病毒液，测定病毒含量并进行无菌检验后，置-15℃以下保存，备用。
5. 配苗及分装：将二种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中I型牛病毒性腹泻病毒含量不低于104.7TCID50/ml，牛传染性鼻气管炎病毒含量不低于104.7TCID50/ml，计算二种成分的配苗用量，准确量取后混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将I型牛病毒性腹泻病毒与牛传染性鼻气管炎病毒混合液与冻干保护剂按照4:1比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装。
6. 二联活疫苗超剂量接种安全性试验：使用3～7月龄BVD、IBR抗原抗体均为阴性健康犊牛20头，分为4组，每组5头，分别接种3批制品，10头份/头（正常剂量为1头份/ml），对照组，每头接种1ml PBS溶液，疫苗接种后连续14日对试验动物进行测温及临床症状观察。
7. 二联活疫苗效力试验：使用3～7月龄BVD、IBR抗原抗体均为阴性健康犊牛40头，试验分为4组，每组10头，分别接种3批该疫苗制品，注射剂量为1头份/ml/头。对照组注射PBS。免疫后28日，从各免疫组和对照组各随机取5头犊牛，每头犊牛鼻内喷镀BVDV JL株F7代病毒6ml，攻毒后，每日测定直肠温度，攻毒后隔日采血，测定白细胞数和病毒分离，至攻毒后8日结束。剩余各免疫组和对照组犊牛各5头，每头牛鼻内喷雾IBRV LN01/08株F3代病毒4ml，每日测定犊牛体温，每日观察犊牛临床症状，包括食欲、呼吸症状、精神状态、鼻和眼部变化，同时对鼻拭子样品进行病毒分离，至攻毒后7日结束。观察记录各实验犊牛生理状况。
8. 二联活疫苗与灭活疫苗功效比对试验：使用3～7月龄BVD、IBR抗原抗体均为阴性健康犊牛30头，试验分为3组，每组10头，第1组接种二联活疫苗，每头份疫苗中病毒含量滴度不低于103.5TCID50。第2组接种BVD-IBR二联灭活疫苗，每头份疫苗病毒滴度分别为107.3TCID50和107.8TCID50。第3组为PBS对照组。免疫后28日，从各免疫组和对照组各随机取5头犊牛，每头犊牛鼻内喷镀BVDV JL株F7代病毒6ml，攻毒后，每日测定直肠温度，攻毒后隔日采血，测定白细胞数和病毒分离，至攻毒后8日结束。剩余各免疫组和对照组犊牛各5头，每头牛鼻内喷雾IBRV LN01/08株F3代病毒4ml，每日测定犊牛体温，每日观察犊牛临床症状，包括食欲、呼吸症状、精神状态、鼻和眼部变化，同时对鼻拭子样品进行病毒分离，至攻毒后7日结束。结果显示，疫苗接种后28日，本二联活疫苗与BVD-IBR二联灭活疫苗取得了相同的效果，而对照组则出现相应患病症状。
本发明的有益效果在于：
1、本发明所述牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗是采用无附着载体的悬浮细胞培养技术生产；
2、牛病毒性腹泻病毒NMM株与牛传染性鼻气管炎JSM株为连续传代的致弱毒株，在病毒含量远低于灭活疫苗滴度的情况下，就可以发挥高效的免疫功能；
3、该方法有效降低了生产成本；
4、所生产的二联活疫苗免疫动物后安全、有效。
附图说明
图1 悬浮培养的MDBK细胞。
图2 BVDV JL毒株攻毒后，白细胞病毒分离荧光照片情况。其中，a、免疫组为阴性；b、对照组为阳性。
具体实施方式
以下结合附图和实施例具体说明本发明。
一、疫苗制备
1. 制苗毒株
牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea/Mucosal Disease，BVD/MD）NMM株和牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）JSM株，均为华威特（江苏）生物制药有限公司保存。
其中，I型牛病毒性腹泻病毒毒株采集自内蒙古某牛场疑似患病牛血清（PCR检测阳性），血清接种MDBK细胞后分离得到1株病毒，通过RT-PCR检测、基因测序、中和试验和免疫荧光试验，证实该病毒为BVDVI型病毒，命名为BVDV1 NM01株。为了获得制苗用毒种，将分离到的BVDV1 NM01株在MDBK细胞上连续传代致弱，每8～10代进行一次克隆纯化，随着病毒在细胞上传代适应，病毒滴度可达到107.0 TCID50/ml，将该分离得到毒株持续传代培养至F80代，F35和F80代病毒均能被BVDV阳性血清中和。动物试验结果表明，F35和F80代病毒对牛无致病力，且具有良好的免疫原性。经序列分析，F3和F80代病毒E2基因同源性为97.8%。我们选用该分离毒的传代致弱株作为制苗用毒株，并将其命名为BVDV1 NMM株。作为制苗用原始毒种，纯净性检测显示该毒株无菌、无支原体以及其它外源病毒污染，对MDBK细胞适应性好，经检验其病毒含量为107.6 TCID50/ml，TCID50稳定但对牛的毒力较弱，能被I型BVDV特异性阳性血清中和，免疫荧光试验出现特异性荧光，安全性和免疫原性良好，病毒感染健康牛除鼻孔出现水样或粘性分泌物外，未见其它明显病理变化。
牛传染性鼻气管炎病毒JSM株采集自江苏省镇江市某牛场出现咳嗽、体温升高、鼻内排出脓性鼻液的牛的鼻拭子（PCR检测IBRV抗原阳性），经MDBK细胞传代培养获得。特异性中和试验、免疫荧光试验、PCR和基因测序等鉴定结果表明该病毒为牛传染性气管炎病毒（IBRV），命名为IBRV JS01株，将IBRV JS01株F3在MDBK细胞上进行克隆纯化连续传代至F105代，随着病毒在细胞传代次数的增加，F10代病毒的效价即可达108.0 TCID50/ml以上。对不同代次病毒致病性研究结果表明， F70代病毒接种组有1头牛体温升高超过40.0℃，仅1个温次，F105代病毒接种牛体温均正常，F70和F105代病毒接种牛均未表现临床症状，表明F70和F105代病毒已无致病力。F70和F105代病毒接种试验动物攻毒后保护率均为5/5，且各代次病毒均能被IBRV特异性阳性血清中和，表明F70和F105代病毒具有良好的免疫原性。故我们将该分离得到的病毒株连续传代至F105代的致弱株，作为制苗用原始毒株，并将其命名为IBRV JSM株。纯净性检测显示该毒株无菌、无支原体以及其它外源病毒污染，对MDBK细胞适应性好，经检验其病毒含量为108.5 TCID50/ml，能被IBRV特异性阳性血清中和，免疫荧光试验出现特异性荧光，安全性和免疫原性良好，病毒感染健康牛后未表现临床症状。
2. 抗原生产
（1）病毒宿主细胞培养：取生长良好的MDBK细胞接种到细胞培养瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25%胰酶消化成单个细胞并计数，作为接种反应器的宿主备用。
（2）制苗用I型牛病毒性腹泻病毒液的制备：取生长良好的MDBK细胞，按1.2×105个/ml～2.0×105个/ml细胞接种密度接入细胞一级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度不低于2.5×106个/ml时，以MOI为0.04～0.06接种牛病毒性腹泻病毒生产毒种NMM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50%的条件下培养48～60小时。收获病毒液，置-15℃以下保存，测病毒含量并进行无菌检验备用。
（3）制苗用牛传染性鼻气管炎病毒的制备：取生长良好的MDBK细胞，按1.2×105个/ml～2.0×105个/ml细胞接种密度接入细胞一级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度不低于2.5×106个/ml时，以MOI为0.01～0.03接种牛传染性鼻气管炎病毒生产毒种JSM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50%的条件下培养24～36小时。收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用。
3. 病毒含量测定
（1）I型牛病毒性腹泻病毒NMM株病毒含量测定：将毒种或疫苗（疫苗先用稀释液稀释成1头份/ml）用含3.5%马血清的DMEM培养基将稀释好的疫苗作10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-54个稀释度，接种培养16～20小时MDBK细胞的96孔培养板，每个稀释度接种8孔，0.1ml/孔，同时设正常细胞对照孔，置37℃、含5%CO2培养箱培养，观察4日，用Reed-Muench法公式计算TCID50。
（2）牛传染性鼻气管炎病毒JSM株病毒含量测定：将毒种或疫苗（疫苗先用稀释液稀释成1头份/ml）用含2%马血清的DMEM培养基将稀释好的疫苗作10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-54个稀释度，接种培养16～20小时MDBK细胞的96孔培养板，每个稀释度接种8孔，0.1ml/孔，同时设正常细胞对照孔，置37℃、含5%CO2培养箱培养，观察4日，用Reed-Muench法公式计算TCID50。
4. 配苗及分装
检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将二种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中I型牛病毒性腹泻病毒病毒含量不低于104.7TCID50/ml，牛传染性鼻气管炎病毒含量不低于104.7TCID50/ml，计算二种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将I型牛病毒性腹泻病毒与牛传染性鼻气管炎病毒混合液与冻干保护剂按照4:1比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
二、疫苗应用测试
1.牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗超剂量接种安全性试验
为评价牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗（NMM株+JSM株，悬浮培养）接种安全性试验，使用3～7月龄BVD、IBR抗原抗体均为阴性健康犊牛20头，分为4组，每组5头，第1组至第3组为疫苗接种组，分别接种该3批制品（批号为：2016001、2016002、2016003），10头份/头（正常剂量为1头份/ml），第4组为对照组，每头接种相应体积PBS溶液，疫苗接种后连续14日对试验动物进行测温及临床症状观察。试验表明，接种疫苗后，未见明显异常。结果表明，牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗（I型，NMM株+JSM株，悬浮培养）10倍剂量接种对犊牛安全。
2. 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗效力试验
使用3～7月龄BVD、IBR抗原抗体均为阴性健康犊牛40头，试验分为4组，每组10头，第1组至第3组分别接种3批该疫苗制品（批号为：2016001、2016002、2016003），注射剂量为1头份/头。第4组为PBS对照组。免疫后28日，从各免疫组和对照组各随机取5头犊牛，每头犊牛鼻内喷镀BVDV JL株F7代病毒6ml，攻毒后，每日测定直肠温度，攻毒后隔日采血，测定白细胞数和病毒分离，至攻毒后8日结束。剩余各免疫组和对照组犊牛各5头，每头牛鼻内喷雾IBRV LN01/08株F3代病毒4ml，每日测定犊牛体温，每日观察犊牛临床症状，包括食欲、呼吸症状、精神状态、鼻和眼部变化，同时对鼻拭子样品进行病毒分离，至攻毒后7日结束。
试验于攻毒后14日结束，攻毒试验结束后，统计每组动物的保护情况，结果显示，疫苗接种后28日，二联苗组攻击BVDV JL株强毒后3批疫苗制品的保护率分别为：80%、80%、100%，BVDV阴性对照组攻击BVDV JL株强毒后发病率为100%；二联苗组攻击IBRV LN01/08株强毒后3批疫苗制品的保护率分别为：80%、100%、100%，IBRV阴性对照组攻击IBRV LN01/08株强毒后发病率为100%。
3. 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗与灭活疫苗对比测试
使用3～7月龄BVD、IBR抗原抗体均为阴性健康犊牛30头，试验分为3组，每组10头，第1组接种二联活疫苗，每头份疫苗中I型牛病毒性腹泻病毒NMM株和牛传染性鼻气管炎病毒JSM株病毒含量不低于103.5TCID50。第2组接种市场某品牌BVD-IBR二联灭活疫苗，每头份疫苗病毒滴度分别为107.3TCID50和107.8TCID50。第3组为PBS对照组。免疫后28日，从各免疫组和对照组各随机取5头犊牛，每头犊牛鼻内喷镀BVDV JL株F7代病毒6ml，攻毒后，每日测定直肠温度，攻毒后隔日采血，测定白细胞数和病毒分离，至攻毒后8日结束。剩余各免疫组和对照组犊牛各5头，每头牛鼻内喷雾IBRV LN01/08株F3代病毒4ml，每日测定犊牛体温，每日观察犊牛临床症状，包括食欲、呼吸症状、精神状态、鼻和眼部变化，同时对鼻拭子样品进行病毒分离，至攻毒后7日结束。
试验于攻毒后14日结束，攻毒试验结束后，统计每组动物的保护情况，结果显示，疫苗接种后28日，牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗与市场某品牌BVD-IBR二联灭活疫苗取得了相同的效果，而对照组则出现相应患病症状。活疫苗的病毒含量远低于灭活疫苗病毒含量（表1）。因此，牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗的应用可以大大降低疫苗生产的费用。
表1 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗与灭活疫苗比对及测试结果
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