一种丝状真菌快速pcr模板的简易制备方法
阅读说明：本技术 一种丝状真菌快速pcr模板的简易制备方法 (Simple preparation method of filamentous fungus rapid PCR template ) 是由 赵杰宏 桂艳玲 韩洁 唐光甫 满海乔 于 2021-01-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种丝状真菌快速PCR模板的简易制备方法,包括以下步骤：(1)培养待检测的丝状真菌,得到菌丝体；(2)挑取丝状真菌的菌丝放入盛有蒸馏水的玻璃试管中得到菌丝混合液；(3)将含有菌丝混合液的玻璃试管进行超声处理；(4)将超声处理过的菌丝混合液直接作为DNA模板进行PCR扩增。本发明的方法不需要液氮研磨,不需要添加任何提取试剂,简单快捷、省时省力。克服现有丝状真菌DNA提取时间长、添加试剂多、需要仪器多的缺点。本发明方法提取的DNA模板经PCR反应能够获得稳定、可靠的实验结果,成本低廉,效果良好,适合用于大批量样品快速分析,也适合于仪器条件不完善的实验室开展检测。(The invention discloses a simple preparation method of a filamentous fungus rapid PCR template, which comprises the following steps: (1) culturing the filamentous fungi to be detected to obtain mycelium; (2) picking hyphae of filamentous fungi and putting the hyphae into a glass test tube filled with distilled water to obtain hyphae mixed liquor; (3) carrying out ultrasonic treatment on the glass test tube containing the hypha mixed solution; (4) and directly using the hypha mixed solution after ultrasonic treatment as a DNA template for PCR amplification. The method disclosed by the invention does not need liquid nitrogen grinding, does not need to add any extraction reagent, and is simple, quick, time-saving and labor-saving. Overcomes the defects of long extraction time, more added reagents and more required instruments of the existing filamentous fungi DNA. The DNA template extracted by the method can obtain stable and reliable experimental results through PCR reaction, has low cost and good effect, is suitable for rapid analysis of mass samples and is also suitable for laboratory development detection with incomplete instrument conditions.)
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种丝状真菌快速PCR模板的简易制备方法。
背景技术
PCR即聚合酶链式反应，作为分子生物学领域最基本的技术，广泛用于动物、植物和微生物的基因扩增和遗传分析，但是PCR的时间和成本受反应DNA模板的影响很大。目前，DNA的提取方法大多采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基磺酸钠(SDS)法或者市场化的试剂盒。这些方法虽能获得较高质量DNA，但是需要加入很多试剂，并且操作步骤复杂耗时，增加了实验的时间和成本。因此，针对性改良反应的DNA模板实现快速PCR有重要应用价值。尽管在植物研究领域已经开发出Chelex-100提取法、碱裂解法、细胞壁裂解液法、机械破壁联合微波法等，这些方法一定程度上缩短了PCR模板的制备时间，但需要的试剂、仪器或步骤仍然很多，实验成本较高，难以适应大规模快速检测的需要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备简单、快速、安全和经济的丝状真菌快速PCR模板的简易制备方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种丝状真菌快速PCR模板的简易制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以常规培养基培养待检测的丝状真菌，得到菌丝体；
(2)挑取丝状真菌的菌丝放入内部盛有蒸馏水的玻璃试管中得到菌丝混合液；
(3)将步骤(2)得到的含有菌丝混合液的玻璃试管进行超声处理；
(4)将步骤(3)超声处理过的菌丝混合液直接作为DNA模板进行PCR扩增。
在一些实施方式中，步骤(1)中待检测的丝状真菌采用固体培养基上培养或液体培养基中培养。
在一些实施方式中，步骤(2)进一步包括：挑取米粒大小的丝状真菌菌丝块20mg，放入盛有1ml水的玻璃试管中。
在一些实施方式中，步骤(3)进一步包括：将含有菌丝混合液的玻璃试管在40Hz超声波条件下处理5-10min。
在一些实施方式中，步骤(4)进一步包括：超声处理后的菌丝混合液直接作为DNA模板，添加到PCR反应体系中进行PCR扩增。
在一些实施方式中，所述的菌丝混合液的上清液直接作为DNA模板；或者菌丝混合液经50～65℃高温水浴10-15min后取上清液作为DNA模板；或者菌丝混合液经1000～6000rpm离心后取上清液作为DNA模板；或者菌丝混合液经50～65℃高温水浴10～15min，再经1000～6000rpm离心后取上清液作为DNA模板。
在一些实施方式中，所述步骤(4)进一步包括：吸取菌丝混合液的上清液1～3μl添加到PCR反应体系中进行PCR扩增。
在一些实施方式中，所述丝状真菌包括紫红曲霉(Monascus purpureus)和蝉棒束孢(Isaria cicadae)。
本发明的有益效果是：本发明的方法与其他方法相比，不需要液氮研磨，不需要添加任何提取试剂，简单快捷、省时省力。克服现有快速检测技术的不足：丝状真菌DNA提取时间长、添加试剂多、需要仪器多等缺点。本发明方法提取的DNA模板经PCR反应能够获得稳定、可靠的实验结果，成本低廉，效果良好，非常适合用于大批量样品快速分析，也适合于仪器条件不完善的实验室开展检测。
附图说明
图1为超声处理红曲菌丝后取上清液直接作为DNA模板PCR产物的电泳图；
图2为超声处理红曲菌丝上清液与试剂盒提取DNA分别做模板PCR对比图；
图3为超声处理红曲菌丝后再经高温和离心处理的上清液作为DNA模板PCR产物的电泳图；
图4为超声处理蝉棒束孢菌丝后取上清液直接作为DNA模板PCR产物的电泳图。
具体实施方式
下面结合结合具体实施例对发明作进一步详细的说明。
图1～图4示意性地显示了根据本发明的一种丝状真菌快速PCR模板的简易制备方法得到的丝状真菌作为DNA模板PCR产物的电泳图。
一种丝状真菌快速PCR模板的简易制备方法，包括以下步骤：
(1)以常规培养基培养待检测的丝状真菌，得到菌丝体；待检测的丝状真菌可以采用固体培养基上培养或液体培养基中培养。丝状真菌包括但不限于紫红曲霉(Monascuspurpureus)和蝉棒束孢(Isaria cicadae)。
(2)用接种针挑取米粒大小丝状真菌的菌丝块约20mg，放入内部盛有1ml蒸馏水的玻璃试管中得到菌丝混合液；
(3)将步骤(2)得到的含有菌丝混合液的玻璃试管40Hz超声波条件下进行超声处理5-10min。
(4)将步骤(3)超声处理过的菌丝混合液直接作为DNA模板进行PCR扩增。
以菌丝混合液的上清液直接作为DNA模板；或者菌丝混合液经50～65℃高温水浴10-15min后取上清液作为DNA模板；或者菌丝混合液经1000～6000rpm离心后取上清液作为DNA模板；或者菌丝混合液经50～65℃高温水浴10～15min，再用离心机以1000～6000rpm离心处理后取上清液作为DNA模板。
菌丝混合液的上清液添加到PCR反应体系中进行PCR扩增的添加量为1～3μl。
实施例1
采用固体沙氏培养基纯化培养紫红曲霉，用接种针从固体沙氏培养基纯化培养的紫红曲霉上挑取少许菌丝，米粒大小约20mg，放入盛有1mL蒸馏水的玻璃试管中。然后将试管放入超声波清洗机中进行超声处理，超声处理条件为40Hz、8min。取超声处理后的菌液1μL直接作为DNA模板进行PCR扩增。反应体系20μL，通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)各1μL，2×Taq PCR Mix 10μL，最后用ddH2O补足20μL，在PCR仪中94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应结束后，取5ul扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得了清晰正确的PCR产物，参照图1。图1为超声处理红曲菌丝后取上清液直接作为DNA模板PCR产物的电泳图。其中，PCR扩增产物为ITS片段(579bp)。M：DL1000Marker；图中1～4为4个红曲样品的PCR结果。
实施例2
采用固体沙氏培养基纯化培养紫红曲霉，用接种针挑取紫红曲霉菌丝放入盛装有1ml蒸馏水的试管中，使菌丝分散于水中。然后将试管放入超声波清洗机进行超声处理，超声处理条件为40Hz、8min。然后再将试管放入60℃水浴中保温15min，然后放入离心机中以6000rpm离心处理1min，取上清液2μL进行PCR扩增。同时用DNA提取试剂盒提取纯化的DNA做模板，取2μL进行PCR扩增，与超声产物做DNA模板PCR结果进行对比。选用CtnC-F/CtnC-R和CtnD-F/CtnD-R引物对分别扩增紫红曲霉的CtnC和CtnD基因，反应体系为20μL，引物各1μL，2×Taq PCR Mix 10μL，最后用ddH2O补至20μL，在PCR仪中94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应结束后，取5ul扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。两种DNA模板均获得清晰稳定的PCR产物，参照图2。图2为超声处理红曲菌丝上清液与试剂盒提取DNA分别做模板PCR对比图。其中，PCR扩增产物为CtnC(316bp)和CtnD(346bp)序列。M：DL 1000Marker；图中，1：扩增CtnC；2：扩增CtnD；S：超声处理菌丝上清液做DNA模板；K：试剂盒提取DNA做模板。
实施例3
采用液体沙氏培养基纯化培养紫红曲霉，用接种针从液体沙氏培养基中挑取紫红曲霉菌丝放入装有1ml蒸馏水的试管中，使菌丝分散于水中。然后将试管放入超声波清洗机中进行超声处理，超声处理条件为40Hz、8min。后再将试管放入60℃水浴中保温15min，再放入离心机以6000rpm离心处理30s，采用4个处理条件分别进行实验得到处理样品：超声、超声+离心、超声+高温、超声+高温+离心，分别吸取2μL上清液作为DNA模板进行PCR。四种处理的样品均能扩增出清晰的条带，其中超声+高温+离心的样品效果最好，参照图3。图3为超声处理红曲菌丝后再经高温和离心处理的上清液作为DNA模板PCR产物的电泳图。其中，PCR扩增产物为ITS(579bp)片段。M：DL 1000Marker；图中，1：超声对照；2：超声+离心；3：超声+高温；4：超声+高温+离心。
实施例4
用接种针从固体沙氏培养基纯化培养的3种蝉棒束孢(Isaria cicadae)菌株上挑取少许菌丝，放入加盛有1mL蒸馏水的玻璃试管中，使菌丝分散于水中。然后将试管放入超声波清洗机中进行超声处理，超声处理条件为40Hz、8min。取超声过的菌液2μL直接作为DNA模板进行PCR扩增。通用引物ITS1和ITS4各1μL，2×Taq PCR Mix 10μL，最后用ddH2O补足20μL。在PCR仪中94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应结束后，取5ul扩增产物电泳检测，获得了清晰正确的PCR产物，参照图4。图4为超声处理蝉棒束孢菌丝后取上清液直接作为DNA模板PCR产物的电泳图。其中，PCR扩增产物为ITS片段(约560bp)。M：DL1000 Marker；图中1～3为3个蝉棒束孢菌种样品的PCR结果。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。
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