具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此限制本发明。

实施例1

(1)白及块茎500g用75％乙醇提取1次(用量为10L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)上述步骤(1)所得75％乙醇粗提物用水溶解，经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每个有机溶剂萃取3次，每次水相和有机相的体积比1:1，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)中石油醚萃取物，经硅胶柱色谱分离，依次以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100:1，100:3，100:8，100:10洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得的石油醚：乙酸乙酯100:4～100:8流分经ODS色谱，用30:70，50:50，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(50:50～90:10)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝75:25，得到联苄1和2的消旋混合物(t_R＝40min)(收率为0.00011％)。化合物1和2的消旋混合物再经手性柱色谱分离，以正己烷：乙醇(75:25)为流动相洗脱得到新的化合物1(9.958min),2(11.304min)(收率各为0.00005％)。

(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(50:50～90:10)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以60:40甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到联苄3(t_R＝35min)(收率为0.00010％)。

根据化合物1-3的理化性质和波谱数据鉴定了其结构。

化合物1的结构鉴定数据如下：

紫色粉末(甲醇)。-30.4(c 1.0,MeOH),HR-ESI-MS给出准分子离子峰[M+H]⁺m/z：328.1539(calcd.328.1543for C₁₉H₂₂NO₄)，提示其分子式为C₁₉H₂₁NO₄。¹H NMR(600MHz,CD₃OD)：δ_H 7.06(1H,t,J＝7.8Hz,H-5')，6.60(1H,m,H-4')，6.58(1H,m,H-6')，6.62(1H,m,H-2')为一组间位取代苯环的氢信号，6.33(1H,d,J＝2.4Hz,H-4)，6.23(1H,d,J＝2.4Hz,H-6)为苯环上间位偶合的氢信号；δ_H 2.74-2.89(4H,m,H-α,α')为联苄类化合物亚甲基特征氢信号；δ_H3.75(3H,s,3-OCH₃)为一个甲氧基氢信号，5.03(1H,dd,J＝9.0,5.0Hz,H-5”)，2.39(1H,m,H-3”a)，2.50(1H,m,H-3”b)，2.06(1H,m,H-4”a)，2.32(1H,m,H-4”b)为5个脂肪族氢信号，包含两组亚甲基氢信号，为一组吡咯烷酮氢信号。¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)谱中给出19个碳信号：δ_C 143.3(C-1)，120.0(C-2)，161.4(C-3)，99.2(C-4)，159.0(C-5)，109.7(C-6)，144.3(C-1')，120.9(C-2')，158.5(C-3')，114.0(C-4')，130.4(C-5')，116.4(C-6')为12个sp²杂化碳信号；δ_C 55.9(3-OCH₃)，39.7(C-α')，36.7(C-α)为脂肪碳信号；181.5(C-2”)，32.2(C-3”)，27.4(C-4”)，53.4(C-5”)组成一个五元氮杂环-吡咯烷酮。

利用HSQC将所有的氢碳信号进行归属，并通过HMBC谱将取代基的位置进一步确定。在HMBC谱中，δ_H5.03(H-5”)与δ_C 143.3(C-1)，161.4(C-3)远程相关，提示吡咯烷酮连接在C-2位，δ_H 3.75(3-OCH₃)与161.4(C-3)的远程相关提示甲氧基连接在C-3位，因此确定了该化合物的结构。经检索为一未见文献报道的新化合物，命名为dusuanlansin E1。

表1化合物1和2的NMR数据归属

化合物2的结构鉴定数据如下：

紫色粉末(甲醇)。-30.4(c 1.0,MeOH),HR-ESI-MS给出准分子离子峰[M+H]⁺m/z：328.1539(calcd.328.1543for C₁₉H₂₂NO₄)，提示其分子式为C₁₉H₂₁NO₄。

由于化合物1和2是通过手性柱拆分得到的一对对映异构体，它们的氢碳谱数据是完全一致的(见表1)，不同的地方表现在CD谱图上，其中化合物1在195-220nm处为+cotton效应；而化合物2在该波长处为-cotton效应；经检索为一未见文献报道的新化合物，命名为dusuanlansin E2。

化合物3的结构鉴定数据如下：

深黄色粉末(甲醇)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰[M-H]^-m/z：405.1534(calcd.405.1555for C₂₁H₂₅O₈)，提示其分子式为C₂₁H₂₆O₈，¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)：δ_H7.17(1H,t,J＝7.8Hz,H-5')，6.84(1H,m,H-6')，6.89(1H,m,H-4')，6.83(1H,m,H-2')，6.13(1H,m,H-4)，6.21(2H,m,H-2,6)为苯环上的氢信号；4.80(d,J＝7.2Hz,H-1”)为糖端基氢信号，δ_H 2.81-2.88(4H,m,H-α,α')为联苄类化合物亚甲基特征氢信号；δ_H 3.65(3H,s,5-OCH₃)一个甲氧基氢信号。¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)谱中给出21个碳信号：δ_C 143.4(C-1)，108.2(C-2)，160.3(C-3,5)，98.9(C-4)，104.3(C-6)，143.1(C-1')，113.5(C-2')，157.5(C-3')，116.3(C-4')，129.0(C-5')，121.8(C-6')为12个sp²杂化碳信号；100.4(C-1”)，73.3(C-2”)，76.7(C-3”)，69.7(C-4”)，77.0(C-5”)，60.7(C-6”)为葡萄糖碳信号，δ_C 54.7(5-OCH₃)，36.7(C-α')，37.2(C-α)为脂肪碳信号。

表2化合物3的NMR数据归属

根据HSQC谱将氢碳信号一一归属，并结合HMBC谱确定取代基及糖片段的连接位置。4.80(H-1”)与157.5(C-3')的远程相关表明葡萄糖连接在C-3'位，以及3.65(5-OCH₃)与160.3(C-5)的相关表明甲氧基连接在C-5位；经检索为一未见文献报道的新化合物，命名为3-hydroxy-5-methoxybibenzyl-3'-O-β-D-glucopyranoside。

实施例2

(1)白及1000g用95％乙醇加热回流提取3次(用量：10L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经有机溶剂萃取，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇以水相和有机相的体积比1:1进行萃取，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)中石油醚萃取物，经硅胶柱色谱分离，依次以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100:2，100:4，100:8，100:10洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得的石油醚：乙酸乙酯100:4～100:7流分经ODS色谱，用30:70，60:40，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35，得到联苄1和2的消旋混合物(t_R＝40min)(收率为0.00011％)。化合物1和2的消旋混合物再经手性柱色谱分离，以正己烷：乙醇(75:25)为流动相洗脱得到新的1(9.958min),2(11.304min)(收率各为0.00005％)。

(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(60:40～50:50)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以60:40甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到联苄3(t_R＝35min)(收率为0.00011％)。

联苄类1-3的结构鉴定方法见实施例1。

实施例3

(1)白及800g用85％乙醇加热回流提取3次(用量：9.6L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经有机溶剂萃取，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇以水相和有机相的体积比1:1进行萃取，分别萃取4次，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)中石油醚萃取物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和丙酮混合溶剂100:1，100:3，100:5，100:7洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：丙酮100:5～100:7流分经ODS色谱，用30:70，60:40，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35，得到联苄1和2的消旋混合物(t_R＝36min)(收率为0.00011％)。化合物1和2的消旋混合物再经手性柱色谱分离，以正己烷：乙醇(75:25)为流动相洗脱得到新的1(9.058min),2(11.104min)(收率各为0.00005％)。

(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(60:40～50:50)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以55:45甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到联苄3(t_R＝36min)(收率为0.00011％)。

联苄类1-3的结构鉴定方法见实施例1。

实施例4

(1)白及1200g用95％乙醇加热回流提取2次(用量：18L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经有机溶剂萃取，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇以水相和有机相的体积比1:1进行萃取，分别萃取3次，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)中石油醚萃取物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和甲醇混合溶剂100:1，100:3，100:5，100:8洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：甲醇100:3～100:5流分经ODS色谱，用30:70，50:50，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(90:10)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为乙腈：水＝45:55，得到联苄1和2的消旋混合物(t_R＝46min)(收率为0.00010％)。化合物1和2的消旋混合物再经手性柱色谱分离，以正己烷：乙醇(77:23)为流动相洗脱得到新的1(9.008min),2(11.100min)(收率各为0.00005％)。

(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(50:50)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以53:47甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到联苄3(t_R＝36min)(收率为0.00013％)。

联苄类1-3的结构鉴定方法见实施例1。

实施例5

(1)白及600g用80％乙醇加热回流提取3次(用量：10L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经有机溶剂萃取，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇以水相和有机相的体积比1:1进行萃取，分别萃取3次，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)中石油醚萃取物，经硅胶柱色谱分离，依次以氯仿和丙酮混合溶剂100:1，100:3，100:5，100:6洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得的氯仿：丙酮100:5～100:6流分经ODS色谱，用30:70，45:55，60:40，65:35乙腈-水的混合溶剂梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得乙腈-水(45:55)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝66:34，得到联苄1和2的消旋混合物(t_R＝34min)(收率为0.00011％)。化合物1和2的消旋混合物再经手性柱色谱分离，以正己烷：乙醇(78:22)为流动相洗脱得到新的1(9.058min),2(11.104min)(收率各为0.00005％)。

(6)上述步骤(4)中所得乙腈-水(30:70)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以55:45甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到联苄3(t_R＝33min)(收率为0.00013％)。

联苄类1-3的结构鉴定方法见实施例1。

实施例6

(1)白及300g用90％乙醇加热回流提取3次(用量：3L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经有机溶剂萃取，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇以水相和有机相的体积比1:1进行萃取，分别萃取3次，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)中石油醚萃取物，经硅胶柱色谱分离，依次以氯仿和甲醇混合溶剂100:1，100:3，100:5，100:7洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得的氯仿：甲醇100:3～100:5流分经ODS色谱，用20:80，30:70，50:50，60:40，乙腈-水的混合溶剂梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得乙腈-水(50:50)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35，得到联苄1和2的消旋混合物(t_R＝36min)(收率为0.00011％)。化合物1和2的消旋混合物再经手性柱色谱分离，以正己烷：乙醇(75:25)为流动相洗脱得到新的1(9.058min),2(11.104min)(收率各为0.00005％)。

(6)上述步骤(4)中所得乙腈-水(20:80)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以30:70乙腈-水的混合溶剂为流动相，得到联苄3(t_R＝36min)(收率为0.00014％)。

联苄类1-3的结构鉴定方法见实施例1。

实施例7实施例1-6中制备得到的新联苄类1-3的抗神经炎症活性测试

(1)实验原理：小胶质细胞活化介导的慢性炎症反应是神经退行性疾病的发生、发展过程中的重要环节，抑制小胶质细胞的激活可能成为药物发现的一个新的靶点。LPS激活小胶质细胞释放NO、促炎症细胞因子和活性氧等。本实验通过建立体外LPS激活BV2小胶质细胞异常活化的筛选模型，以激活小胶质细胞释放NO为指标，评价新联苄类1-3抗炎活性。

(2)实验方法：

①小鼠小胶质细胞系BV2的培养

细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以DMEM培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清及50μM 2-巯基乙醇的细胞培养液。小胶质细胞以约4×10⁵cells/ml的浓度在5％CO₂，37℃培养瓶中传代培养，至第三天贴壁细胞约占培养瓶底面积50-60％，以胰酶消化贴壁细胞，传代至另一培养瓶。以-80℃超低温冰箱冻存复苏后的BV2作为第一代，选择第3-8代BV2细胞进行实验。

②药物配制方法

测试化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为50mM，储存于-20℃。临用时用DMEM培养液将其进行稀释，依次稀释为100μM、30μM、10μM、3μM、1μM。DMSO终浓度<1‰。

③Griess法检测化合物对LPS激活小胶质细胞的抑制作用

取对数生长期的BV2小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至3×10⁵cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO₂的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，同时进行加药处理。每种化合物设剂量1、3、10、30、100μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/ml。细胞加药后继续培养24h后，收集上清液，Griess比色法检测上清液中NO^2-含量。

④MTT法检测化合物对小胶质细胞细胞成活率的影响

取对数生长期培养的BV2小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至3×10⁵cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO₂的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成新鲜培养液，同时进行加药处理。每种化合物设剂量1、3、10、30、100μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/ml。细胞加药后继续培养24h，然后向细胞液中加入MTT溶液，10μl/well，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3h，吸除培养液，然后加入100μl的DMSO溶液，测定其光密度OD值。数据处理，利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品6个孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式计算细胞成活率(cell viability，CV％)。

细胞成活率％＝样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100％

⑤统计方法

全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p>0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p<0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。

⑥IC₅₀的计算方法

将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC₅₀。

(3)实验结果：见表3

表3联苄类1-3抑制小胶质细胞活化作用实验结果

显著性:^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001与LPS诱导组相比；^###P<0.001与对照组相比。

结果可知，实施例1-6中制备得到的新联苄类化合物1(100μM)、2(100μM)及3(30μM，100μM)能够显著的抑制LPS诱导的过度活化的BV2小胶质细胞NO的释放。