基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒
阅读说明：本技术 基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒 (Primer composition for gene mutation multiplex detection and kit thereof ) 是由 葛志琪 赵雨航 李锦� 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒；该引物组合物包括第二上游引物、探针、下游引物和至少两条不同的第一上游引物；其中,第一上游引物包括上游检测区和靶序列结合区：上游检测区有与第二上游引物具有相同序列的(a)部分,以及与探针具有相同序列的(b)部分；靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点,该扩增决定位点与突变型靶序列上的变异检测位点互补,且其上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区；不同的第一上游引物为靶序列结合区不同。本发明的引物组合物还包括野生型阻断剂。使用上述引物组合物或试剂盒检测多重基因突变,可提高检测灵敏度、特异性,减低检测成本；并且检测的准备度更高。(The invention discloses a primer composition for gene mutation multiplex detection and a kit thereof; the primer composition comprises a second upstream primer, a probe, a downstream primer and at least two different first upstream primers; wherein the first upstream primer comprises an upstream detection zone and a target sequence binding zone: the upstream detection region has a portion (a) having the same sequence as the second upstream primer and a portion (b) having the same sequence as the probe; the 3' end of the target sequence binding region has an amplification decision site which is complementary to a variation detection site on the mutant target sequence and has upstream thereof a mismatch region consisting of one or more bases which is not complementary to the target sequence; the different first forward primers differ for the target sequence binding region. Primer compositions of the invention also include a wild-type blocker. The primer composition or the kit is used for detecting multiple gene mutations, so that the detection sensitivity and specificity can be improved, and the detection cost can be reduced; and the detection readiness is higher.)
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基因多重突变检测用的数字PCR引物组合物及其试剂盒。
背景技术
数字PCR(digital PCR,dPCR)技术是一种核酸分子绝对定量技术，利用极限稀释的原理将一个荧光定量PCR反应体系分配到成千上万份单独的纳升级微反应器中，使得每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子(DNA靶标)，再同时进行单分子模板PCR扩增。不同于荧光定量PCR在每个扩增循环进行时采集荧光的方法，数字PCR在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行独立采集，最后通过泊松分布的原理及阳性/阴性的反应单元的比例得出目标分子的原始拷贝数或浓度。
相较于荧光定量PCR，数字PCR不依靠Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测，具有灵敏度高以及精确度高的优势。由于数字PCR在进行结果判读时仅判断“有/无”两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，所以数字PCR反应和结果判读受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高。此外，数字PCR实验中对反应体系进行分配的过程可以极大程度上在局部降低与靶标序列有竞争作用的背景序列浓度。因此，由于数字PCR具有更高的灵敏度和精确度，在需要以高灵敏度对拷贝量低的差异性核酸分子进行定量和检测时，体现出相比于传统的荧光定量PCR的显著优势。尤其是在复杂背景中检测稀有突变，如通过检测肿瘤患者外周血中的循环肿瘤DNA(ctDNA)，显示出巨大的优势，常用于对肿瘤患者的早期筛查、用药指导、预后判断以及复发监测应用中。
而现有的基因突变检测试剂，多采用①TaqMan探针法、②引物特异性区分法、③阻断野生型扩增法。其中①TaqMan探针法通常会采用分别针对突变型和野生型的竞争性探针，两种探针为类似于点突变检测的竞争性探针，或者在基因野生型模板上设计一条特异性探针，在基因的其它保守区域设计一条可以同时指示野生型和突变型模板的通用探针，利用两条探针测定的浓度差值来定量突变型模板的浓度，两种方法均需在探针的上下游设计扩增引物，导致扩增子较长，由于ctDNA呈高度随机的片段化分布，因此，较短的ctDNA片段可能会被漏检，降低检测灵敏度，同时，当某基因突变类型众多时，针对不同的突变类型需设计多种不同的突变型探针，费用较高，不利于大规模的推广使用。②引物特异性区分法是设计不同的突变型引物来特异性区分不同的突变类型，在其下游的保守区域设计一条探针及下游引物，在基因的其它保守区域设计一条可以同时指示野生型和突变型模板的通用探针及其上下游引物，此方法仍存在扩增子较长的问题，不利于较短的ctDNA的检测，另外对引物的特异性要求极高，易出现交叉反应。③阻断野生型扩增法常采用肽核酸(PeptideNucleic Acid，PNA)，锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)修饰来阻断野生型模板的扩增，目前，这些修饰价格高昂，不利于临床应用。因此需要一种灵敏度高，特异性好，成本低的引物探针设计方法来满足临床使用数字 PCR技术检测的需要。
本发明在常用检测方法的基础上进行改良，在一个反应管中同时检测多种临床常见、突变频率较高的突变基因，对于突变型别不进行分型处理。一管同时检测多种突变类型，具有一定的挑战性，一方面数字PCR的灵敏度极高，非常容易造成假阳性的出现；另一方面，一管内存在多条引物探针，它们之间的相互干扰作用不可忽视，所以对引物探针的特异性要求极高，需尽可能的避免交叉反应。因此在利用数字PCR技术构建多重基因突变检测体系时，如何提升体系的特异性，降低引物之间的相互干扰以及保护临床最常见突变亚型的检测性能，尤为重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种基于数字PCR的基因突变多重检测引物组合物和试剂盒；解决了基因突变多重检测体系由于引物众多相互干扰从而影响检测分析准确性和导致假阳性结果的问题。
一方面，一种基因突变多重检测用引物组合物，该引物组合物包括第二上游引物、探针、下游引物和至少两条不同的第一上游引物；
其中，所述第一上游引物从5’端至3’端依次包括上游检测区和靶序列结合区：
(1)上游检测区从5’端至3’端包括：与第二上游引物具有相同序列的(a)部分，以及与探针具有相同序列的(b)部分，及
(2)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点，所述扩增决定位点与突变型靶序列上的变异检测位点互补，且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区；
所述不同的第一上游引物上，所述靶序列结合区不同，所述上游检测区的(a)部分相同或不同，所述上游检测区的(b)部分相同；
在一些
具体实施方式
中，所述不同的第一上游引物上，所述靶序列结合区和所述上游检测区的 (a)部分均不相同所述上游检测区的(a)部分、(b)部分、靶序列结合区之间有碱基间隔或没有碱基间隔。
第二上游引物的序列与上游检测区的(a)部分完全相同，且不与任何靶核酸序列、第一上游引物、下游引物互补配对，其序列可自由更换。
探针的序列与上游检测区的(b)部分完全相同，且不与任何靶核酸序列、第一上游引物、下游引物互补配对，其序列可自由更换。
在一些实施方式中，该引物组合物还包括野生型阻断剂(blocker)。
所述野生型阻断剂为阻滞野生型基因序列扩增的阻断剂。
在一些具体实施方式中，所述野生型阻断剂的Tm值≥第一上游引物的Tm值＞第二上游引物的Tm值。
所述第一上游引物的Tm值是指第一上游引物与模板配对部分的Tm值。
在进行数字PCR扩增时，野生型阻断剂优先与野生型模板结合，避免第一上游引物与野生型模板的非特异性结合；然后，第一上游引物特异性结合突变型模板，对突变型模板进行预扩增；接着，第二上游引物对富集后的突变型模板进行扩增下游互补结合的探针，从而检测到对应的靶核酸序列。
第二上游引物和探针仅在第一上游引物对靶核酸进行特异性的与扩增后，才能与预扩增的产物进行配对结合，从而开始探针并将报告基团与猝灭基团相互分离，释放可检测的信号。
在一些具体实施方式中，所述野生型阻断剂为与野生型模板互补、包含常见突变区域序列的寡核苷酸；该寡核苷酸的长度为13～30bp，Tm值为50℃～80℃，GC含量为40％～80％；所述阻断剂的3’末端通过非羟基基团修饰，所述非羟基基团包括但不限于双脱氧碱基修饰、C6 spacer、C3 spacer、磷酸化修饰、氨基、卤代或其他修饰；在进一步地实施方式中，所述阻断剂的3’末端进行双脱氧碱基修饰。
在一些具体实施方式中，所述第一上游引物的长度为50～90bp，Tm值为50℃～80℃，GC含量为40％～80％。
在一些具体实施方式中，所述第二上游引物的长度为13～30bp，Tm值为50℃～80℃，GC含量为40％～80％。
在一些具体实施方式中，所述下游引物的长度为15～30bp，Tm值为55℃～75℃，GC含量为 40％～80％。
在本发明中，第一上游引物和第二上游引物优选使用相同的下游引物。
在一些具体实施方式中，所述野生型阻断剂的Tm值比第一上游引物的Tm值高5℃～20℃；或者，所述野生型阻断剂的Tm值与第一上游引物的Tm值相同。在进一步地优选实施方式中，所述野生型阻断剂的Tm值比第一上游引物的Tm值高10℃～15℃。
在一些具体实施方式中，所述第一上游引物的Tm值与所述第二上游引物的Tm值高5℃～20℃；在进一步地优选实施方式中，所述第一上游引物Tm值与所述第二上游引物的Tm值高10℃～15℃。
在一些实施方式中，所述不同的第一上游引物上，所述上游检测区的(a)部分相同或不同，所述上游检测区的(b)部分相同或不同。
当所述第一上游引物上的上游检测区的(a)部分和(b)部分变化时，其对应的第二上游引物和探针也要相应变化。
在一些具体实施方式中，所述下游引物与靶序列上互补配对的位置设置在变异检测位点下游的 1～150bp处。
在一些具体实施方式中，所述第一上游引物上靶序列结合区中错配区的长度为1～15个碱基；所述第一上游引物上扩增决定位点与错配区距离为1～15个碱基。
在一些具体实施方式中，所述探针修饰有报告基团，只有在探针被水解后，所述报告基团才是可检测的。在进一步地实施方式中，所述探针上带有报告基团和猝灭基团。在更进一步地实施方式中，所述报告基团可以是选自下组的荧光基团：：FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、Cy3等；所述淬灭基团可以选自下组：TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL、DDQI等。在一些实施方案中，所述探针除报告基团和淬灭基团外不带有任何其他修饰，所述其他修饰例如MGB、LNA、PNA、BNA、 SuperBase等。在一个优选实施方案中，本发明的探针为Taqman探针。在一个优选实施方案中，所述报告基团位于探针的5’端，淬灭基团位于探针的3’端。
第二方面，一种基因突变多重检测试剂盒，该试剂盒包括上述的引物组合物。
在一些选实施方案中，所述试剂盒还包括参考引物组合物，所述参考引物组合物为在靶序列的非突变并且保守位点处，设计与保守序列互补的参考上游引物rF、参考下游引物rR及参考探针rP。
所述参考引物组合物用于检测模板总量，包括野生型和突变型。
在一些具体实施方式中，所述rF，rR引物的长度5～30bp，Tm值55℃～75℃，GC含量40％～80％。
所述探针rP的5’末端进行荧光基团修饰，3’末端进行淬灭基团修饰，探针的长度为15～30bp， Tm值55℃～75℃，GC含量40％～80％。
在第三方面，一种EGFR基因19外显子突变检测用引物组合物，该引物组合物包括：
第一上游引物SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、 SEQ ID NO:6；
第二上游引物SEQ ID NO:9；
探针SEQ ID NO:10；
下游引物SEQ ID NO:11。
在一些具体实施方式中，一种EGFR基因19外显子突变检测用引物组合物，该引物组合物包括：
第一上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6；
第二上游引物SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9；
探针SEQ ID NO:10；
下游引物SEQ ID NO:11。
本发明的6条第一上游引物分别用于扩增19种临床常见、突变频率较高的EGFR基因19外显子缺失突变型，对突变型别不进行分型处理。一管检测19种突变型，除了突变频率高于50％或突变频率最高的突变型别的第一上游引物单独使用一条第二上游引物外，其它5条第一上游引物共用另一条第二上游引物。
在一些实施方式中，所述EGFR基因19外显子突变检测用引物组合物，还包括野生型阻断剂。
所述野生型阻断剂为与野生型模板互补、包含常见突变区域序列的寡核苷酸；该寡核苷酸的长度为13～30bp，Tm值为50℃～80℃，GC含量为40％～80％；所述阻断剂的3’末端通过非羟基基团修饰，所述非羟基基团包括但不限于双脱氧碱基修饰、C6 spacer、C3spacer、磷酸化修饰、氨基、卤代或其他修饰；在进一步地实施方式中，所述阻断剂的3’末端进行双脱氧碱基修饰。
在第四方面，上述引物组合物在制备EGFR基因19外显子突变检测试剂盒的应用。
本发明中所述技术方案与现有技术相比，其优点在于：
(1)假阳性少：本发明体系内引入的blocker寡核苷酸与野生型模板的特异性区域(常见突变缺失区域)的反义链完全互补，在PCR反应过程中，其优先与野生型模板紧密结合，竞争性地抑制突变型第一上游引物F1与野生型模板的非特异性结合，从而减少假阳性荧光信号的产生，尤其适用于利用数字PCR法进行突变检测。
(2)特异性高：本发明体系内的6条突变型F1引物之间可能会存在相互干扰的现象，为减弱交叉反应，保护临床最常见突变亚型p.E746_A750del(64.6％)的检测不受其它突变型第一上游引物F1 的干扰，额外添加针对此型的第二上游引物F2，即体系内添加2条不同的F2引物，除突变亚型 p.E746_A750del(64.6％)的F1引物单独使用一条F2引物外，其它5条F1引物共用F2引物。此方案不仅可以提高检测突变亚型p.E746_A750del(64.6％)时的扩增效率，同时可以确保其它突变亚型的检测不受影响，阈值划分清晰，检测结果准确可靠。
(3)成本低：本发明使用6条突变型F1引物来检测19种突变亚型，不同的突变亚型共同使用一条探针P，无需添加多条探针P即可完成多种突变亚型的同时检测，另外，引物探针也无需经过昂贵的PNA修饰或LNA修饰，大大减少引物探针使用成本，利于临床使用。
(4)靶核酸序列短：本发明所述引物探针设计方法的优势在于待测靶核酸长度短，由于探针P 在预扩增完成后才能与第一上游引物F1的5’端互补序列互相配对结合，因此实际与靶核酸序列配对结合的部分只有两部分：F1的3’端与靶核酸互补配对的序列以及下游引物R的序列。与本发明所述引物探针设计方法相比，TaqMan探针法以及ARMS法更加受限于靶核酸待测片段的序列，这是由于这两种方法均需要至少三部分与靶核酸序列配对：上游引物、探针、下游引物。因此本发明所述引物探针设计方法相较于TaqMan探针法以及ARMS法需要的靶核酸待测片段长度更短。而在高度片段化的游离DNA检测中，由于DNA的片段化是随机的，更短的检测片段可以检出更多的DNA靶标，从而大大提高检测的灵敏度。
(5)对靶核酸序列要求较低：与上述优点类似，本发明所述引物探针设计方法由于探针P在预扩增完成后才能与第一上游引物F1的5’端互补序列互相配对结合，因此实际与靶核酸序列配对结合的部分只有两部分：F1的3’端序列以及下游引物R的序列。因此对于复杂的靶核酸序列检测时，引物探针的设计难度相对于TaqMan探针法以及ARMS更低。
(6)降低了对软件的算法要求：本发明所述引物探针设计方法使野生型与突变型阈值划分更加清晰明显，因此软件能够更容易地自动划分阈值，得出突变比例。
(7)适用范围广：本发明所述反应体系可检测小于100bp的短片段DNA，且对PCR抑制物的耐受良好，可以适用于多种样本类型的核酸检测，包括福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)样本、新鲜组织样本、外周血样本、尿液样本、灌洗液样本、脑脊液样本、人工培养的细胞系样本、人工合成的质粒样本等。
附图说明
图1为本发明所述的引物探针设计方法；其中，图1A为第一上游引物F1的结构图，从5’端至 3’端依次包含上游检测区和靶序列结合区，其中靶序列结合区靠近的3’端可添加错配；上游检测区从 5’至3’端包含：与第二上游引物F2以及探针P相同的序列。图1B为本发明所述方案的检测原理，首先blocker寡核苷酸与野生型模板特异性结合，突变型第一上游引物F1和反向引物R特异性地富集待检测的突变型靶核酸序列，并新增一段与第一上游引物“上游检测区”互补的序列，供后续的第二上游引物F2及探针P进行配对识别。靶核酸模板富集后，使得第二上游引物F2及探针P识别预扩增产物上与第一上游引物“上游检测区”互补的序列，然后与反向引物R形成引物对并进行模板扩增，通过TaqMan探针原理释放荧光信号。在整个PCR反应过程中，参考引物rF与参考引物rR形成引物对扩增模板(突变型与野生型)，通过TaqMan探针rP释放荧光信号；
图2为实施例1中检测阴性对照样本的二维图；通道一信号为FAM信号，通道二信号为HEX信号；
图3为实施例1中检测突变样本(p.E746_A750del缺失突变)的二维图；
图4为实施例1中检测突变样本(p.E746_A750del缺失突变)及阴性对照样本的浓度及突变丰度图；
图5为实施例2中检测模拟临床样本(临床常见亚型)不同信号通道的一维图；5A为FAM信号，表示检测到的突变型数量；5B为HEX信号，表示检测到的野生型数量；
图6为实施例3中检测阴性对照样本的二维图；
图7为实施例3中检测突变样本(p.E746_A750del缺失突变)的二维图；
图8为实施例4所述的引物探针设计方法；首先利用第一上游引物F1和反向引物R特异性地富集待检测的靶核酸序列(突变型/野生型)，并新增一段与第一上游引物“上游检测区”互补的序列，供后续的第二上游引物F2及探针P进行配对识别。靶核酸模板富集后，利用退火温度的变化，使得第二上游引物F2及探针P识别预扩增产物上与第一上游引物“上游检测区”互补的序列，然后与反向引物R形成引物对并进行模板扩增，通过TaqMan探针原理释放荧光信号；
图9为实施例4检测阴性对照样本的二维图；
图10为实施例4检测突变样本(p.E746_A750del缺失突变)的二维图；
图11为对比例检测阴性对照样本的二维图；
图12为对比例检测突变样本(p.E746_A750del缺失突变)的二维图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
定义
术语“保守区域”是指DNA分子中的一个核苷酸片段，在序列、结构或功能上基本保持不变的区域。
术语“样品”是指来自任何受试者的生物样品，它用于检测是否存在一种或多种疾病，例如流感病毒或者其它呼吸道症状或疾病。这种样品可以包括来自皮肤或任何器官、血液、血浆、黏液、唾液等的组织样品。
术语“探针”是指可在合适的条件下与扩增的靶标核酸选择性杂交的寡核苷酸。探针序列可以为正义(例如，互补)序列(+)或者是编码链/正义链的反义(例如，反向互补)序列(-)。在动力学PCR形式中，检测探针可由具有5’报告染料(R)和3’猝灭染料(Q)的寡核苷酸组成。荧光报告染料(即，FAM(6-羧基荧黄素)等)典型地位于3’末端。在扩增和检测过程中检测探针作为TAQMAN探针。
此处所用术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，适当时候也指核糖核酸(RNA)。该术语也应理解为包括由核苷酸类似物所组成的RNA或DNA的等价物、类似物，以及可应用在所述技术方案中的单链(正义或反义)及双链多核苷酸。
本文所用术语“标记”是指任何可用于提供可检测(优选地为可定量的)信号的原子或分子，可与核酸或蛋白质通过共价键或非共价相互作用(例如，通过离子或氢键、或通过固定化、吸附等)连接。标记通常通过荧光、化学发光、放射性、比色法、质谱、X射线衍射或吸收、磁力、酶活性等提供所检测的信号。标记的具体实施例包括荧光团、发色团、放射性原子(特别是32p和125I)、电子致密试剂、酶和具有特定结合物的配体。
表皮生长因子受体EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域的激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号转导通路有关，在许多实体肿瘤中均存在EGFR 基因的高表达或异常表达。EGFR的酪氨酸激酶活性位点，主要位于其18～21号外显子之间。所以， EGFR的激活突变、耐药突变，也集中于此。最常见的激活突变为19外显子缺失突变(约占45％)和 21号外显子的L858R点突变(约占40％)，二者均可导致酪氨酸激酶结构域活化。携带EGFR突变的肿瘤患者，接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物(EGFR-TKIs)治疗后，可显著延长患者的无进展生存期(Progression Free Survival,PFS)和提高药物反应率。因此，EGFR基因突变状态的检测和监测对临床一线用药方案的制定、药物疗效及肿瘤转归与预后的监测具有至关重要的作用。
在亚裔非小细胞肺癌(Non small cell lung cancer，NSCLC)患者中，EGFR基因的突变频率高达20％～40％，尤其是不吸烟腺癌女性亚裔NSCLC患者中更常见。最常见的EGFR基因激活突变-19 外显子缺失突变，可高达30～40种类型，且超过50％的缺失突变类型中伴随着插入突变。广东省肺癌研究所吴一龙教授对440例拥有EGFR基因19外显子缺失突变的NSCLC患者的突变亚型进行分类发现，最常见的19号外显子突变亚型为p.E746_A750del(64.6％)，其次为p.L747_P753>S(8.4％)、 p.L747_T751del(4.3％)、p.L747_A750>P(3.4％)、p.E746_S752>V(2)(3.2％)、p.E746_S752>V(1.6％)、 p.L747_S752del(1.4％)，此研究结果与其他学者的报道基本一致(Su J,Zhong W,Zhang X,et al. Molecularcharacteristics and clinical outcomes of EGFR exon 19indel subtypes to EGFRTKIs in NSCLC patients[J].Oncotarget,2017,8(67).)。不同亚型的NSCLC患者使用EGFR-TKIs类药物治疗时，临床效果无显著性差异，因此，无需进行分型检测。
本发明提供了一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组合物(下述“本发明引物组合物”)：
其中，所述第一上游引物F1为针对EGFR基因19外显子常见突变缺失的引物，序列分别为SEQ ID NO:1～6，所述blocker挂核苷酸序列为SEQ ID NO:7，所述第二上游引物F2的序列为SEQ ID NO:8～9，其中SEQ ID NO:8针对最常见突变亚型p.E746_A750del的检测，所述突变型探针P的序列为SEQ ID NO:10，所述下游引物R的序列为SEQ ID NO:11；所述参考引物rF的序列为SEQ ID NO:12，所述参考引物rR的序列为SEQ ID NO:13，参考探针rP的序列为SEQ ID NO:14。由SEQ ID NO:10 所示的突变型探针在5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1。由SEQ ID NO:14所示的参考探针在5’端标记有HEX，3’端标记有BHQ1。
表1：
上述引物探针中，突变型F1引物(SEQ ID NO:1～6)全长60～70bp，野生型blocker寡核苷酸(SEQ ID NO:7)全长33bp。突变型F1引物(SEQ ID NO:1～6)针对EGFR基因19外显子的突变缺失类型，引物的3’端20～25个碱基与靶核酸序列配对。野生型blocker寡核苷酸与野生型模板配对结合。突变型F1引物5’端的20个碱基与对应的F2引物(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)的碱基序列相同。在突变型F1引物5’端第20～23个碱基至第40～43个碱基序列与对应的突变型探针P(SEQ ID NO:10) 的碱基序列相同。因此在突变型F1引物对靶核酸进行特异性扩增后，生成的扩增产物会被添加一段来自F1引物5’端的碱基序列及其互补序列，然后F2引物以及探针P才可以与对应的靶核酸模板配对结合并水解发出荧光信号。因为突变亚型p.E746_A750del总体占比高达所有EGFR基因19缺失突变的64.6％，为了提高这种突变类型检测的准确性，该突变类型的F1引物单独使用一条F2引物(SEQ ID NO:8)，其它5条F1引物则共用一条F2引物(SEQ ID NO:9)。
本发明还提供了一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的反应体系，包括上述引物组合物、样本DNA、DNA聚合酶以及缓冲液，依次进行靶核酸序列的特异性富集、富集后模板的特异性扩增以及荧光标记探针的水解。该反应体系包含以下步骤：
(1)首先在PCR反应的前几个循环，F1引物以及下游引物R可以特异性的扩增靶核酸序列，并在扩增产物的5’端引入F2序列、P序列及其互补序列，野生型blocker寡核苷酸与野生型模板结合，竞争性地抑制突变型F1引物非特异性结合野生型模板；
(2)在上述反应完成后，F2引物以及下游引物R可以与对应的富集后模板进行配对并扩增，从而利用DNA聚合酶的5’核酸外切酶活性切割与富集后模板结合的探针P；
(3)在整个PCR反应过程中，参考引物rF，rR扩增相应的靶序列，并利用DNA聚合酶的5’核酸外切酶活性切割与模板结合的探针rP。
本发明中所述的反应条件为：
(1)92℃～96℃预变性5～15分钟；
(2)92℃～95℃变性10～60秒，
55℃～75℃退火及延伸30～90秒，
步骤(2)反应35～50个循环；
(3)94℃～98℃灭活5～15分钟；
(4)4℃～15℃终止反应。
本发明的所述反应体系中引物探针浓度分别为：
F1引物的浓度为15nM～150nM；
F2引物的浓度为150nM～1500nM；
探针P及参考探针rP的浓度为50nM～800nM；
下游引物R及参考引物rF，rR的浓度为150nM～1800nM；
blocker寡核苷酸的浓度为150nM～1500nM。
优选地，本发明的所述反应体系中引物探针浓度分别为：
F1引物的浓度为30nM～60nM；
F2引物的浓度为300nM～600nM；
探针P的浓度为150nM～400nM；
下游引物R的浓度为300nM～900nM；
参考引物rF，rR的浓度为300nM～900nM；
blocker寡核苷酸的浓度为300nM～600nM。
在下述实施方式中，本发明中所述的EGFR基因19外显子缺失突变检测反应体系包含以下组分：
表2
本发明中使用的反应条件为：
(1)95℃预变性10分钟；
(2)94℃变性30秒，
65℃退火及延伸60秒，
步骤(2)反应45个循环；
(3)98℃灭活10分钟；
(4)10℃终止反应。
其中，本发明实施方式中，DNA样本是来自于癌症患者外周血浆中提取的游离DNA样本，或来自于片段化的细胞系DNA样本，或来自于人工合成的质粒DNA样本。由于该反应体系中，用于特异性富集靶核酸的上游引物F1与下游引物R之间的长度不超过100bp，因此特别适用于检测短片段的DNA样本。
在本发明所述的具体实施方案，将反应缓冲液和引物探针预混液按照表2所述的反应体系混合，以合适的方法从待测样本中提取DNA并加入到配制完成的反应体系中，然后进行数字PCR微反应器 (微滴)分区、PCR扩增以及荧光信号检测。根据荧光信号的有无，判断阴性/阳性微滴所占比例，得到靶核酸突变型样本以及野生型样本浓度，进而计算出该样本中靶核酸序列的突变丰度。
[(突变型浓度)/(突变型浓度+野生型浓度)]*100％
例如在待测样本中突变型探针(FAM荧光信号)检出EGFR基因19外显子突变型靶核酸浓度为 50拷贝/μL，同时参考探针(HEX荧光信号)检出体系内DNA总量(突变型+野生型)为10000拷贝 /μL，则该待测样本中EGFR基因19外显子突变的丰度为：
[(50拷贝/μL)/(10000拷贝/μL)]*100％＝0.5％
本发明中下述具体实施方案配合Bio-Rad公司QX200微滴式数字PCR系统及试剂耗材进行检测。其中2X ddPCR Supermix for ProbesddPCR可选用Bio-Rad公司产品，货号1863010；微滴发生油可选用Bio-Rad公司产品，货号1863005；ddPCR微滴发生卡可选用Bio-Rad公司产品，货号1864008；微滴发生时使用的密封条可选用Bio-Rad公司产品，货号1863009；微滴分析油可选用Bio-Rad公司产品，货号1863004；半裙边96孔板可选用Bio-Rad公司产品，货号12001925。本发明中所述试剂盒的检测结果可选用Bio-Rad公司QuantaSoft数字PCR分析软件进行数据分析，计算待测样本中靶核酸的浓度及突变丰度。
实施例1:
使用模拟临床样本(p.E746_A750del缺失突变)评估本实施方案性能
一、模拟临床样本制备
使用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit按照该试剂盒的操作说明书分别提取HEK-293T细胞、NCI-H1650细胞的DNA(p.E746_A750del缺失突变)，分别得到野生型模板(HEK- 293T细胞系DNA)及突变型模板(NCI-H1650细胞细胞系DNA)。
将两种模板分别进行超声打断处理，并经磁珠筛选纯化后利用数字PCR进行定量，根据定量结果配制突变丰度为10％的混合样本，作为的模拟临床样本使用(d1样本)。同时使用同样浓度的片段化野生型DNA制备成阴性对照(negative control)。
二、反应体系的制备
样本准备完成后，将本发明引物组合物按照表2中所述配比进行反应体系的配置，本实施例即本发明方案的实验原理如图1所示。
在微滴生成之前，将配制完成的含有待测模板的20μL反应液放置于金属浴中，95℃变性1min后，立即放置于2～8℃冰箱2～3min。
将冷却后的20μL PCR反应液加入到微滴发生卡的样本孔中，然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中，最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中，开始微滴生成。大约2分钟后，微滴制备完成，取出卡槽，从最上排孔中小心地转移出约40μL的微滴至96孔PCR板。
三、扩增读取
将96孔板进行封膜处理后，放置于PCR热循环仪中，使用表1中的引物组合物进行PCR扩增。
扩增的反应程序为：
(1)95℃预变性10分钟；
(2)94℃变性30秒，
65℃退火及延伸60秒，
步骤(2)反应45个循环；
(3)98℃灭活10分钟；
(4)10℃终止反应。
待PCR扩增结束，将96孔板放置于微滴分析仪中选择FAM/HEX通道进行信号读取。结果如图 2和图3所示，可以看出，在阴性对照的反应检测中无假阳性的荧光信号产生；使用模拟临床样本 (p.E746_A750del缺失突变)的反应检测时，其阈值划分清晰，数据统计难度低，准确性高。
使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析，得到EGFR基因19外显子突变型与野生型的拷贝数及浓度，并计算出突变丰度，结果如图4所示，p.E746_A750del缺失突变(d1样本)的突变丰度为10.1％。
本实施例为解决体系内假阳性荧光信号的产生，引入了blocker寡核苷酸(SEQ IDNO:7)，在进行PCR扩增时，blocker寡核苷酸优先与野生型模板结合，避免突变型F1引物与野生型模板的非特异性结合，从而消除假阳性荧光信号的产生。进一步地，针对临床最常见突变亚型(p.E746_A750del， 64.6％)的检测，为降低其它5条突变型F1引物对其检测模板时的干扰，体系内添加两条突变型F2 引物，即单独添加一条针对突变型F1-1引物(SEQ IDNO:1)的F2引物(即突变型F2-1，SEQ ID NO:8)；更加的降低了检测后的阈值划分难度；更进一步提高了分析的准确性。
实施例2
使用模拟临床样本(常见突变亚型)评估实验方案性能。
一、模拟临床样本的制备
使用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit按照该试剂盒的操作说明书分别提取 HEK-293T细胞、NCI-H1650细胞的DNA(p.E746_A750del突变(1))、HCC-827细胞的DNA (p.E746_A750del突变(2))，分别得到野生型模板(HEK-293T细胞系DNA)及2种突变型模板 (NCI-H1650细胞细胞系DNA、HCC-827细胞的DNA)。
将野生型模板与突变型模板分别进行超声打断处理，并经磁珠筛选纯化后分别配制2种突变与野生的混合样本，即D1样本(p.E746_A750del突变(1))，D2样本(p.E746_A750del突变(2))，作为模拟临床样本使用。
分别人工合成EGFR基因19外显子缺失突变质粒(p.L747_P753>S突变、p.E746_S752>V突变、 p.L747_T751del突变、p.L747_A750>P突变、p.L747_T751>P突变)，作为对应的突变型模板，将质粒超声打断并经磁珠筛选纯化后分别与片段化的HEK-293T细胞系DNA(野生型模板)进行混合，分别配制D3样本(p.L747_P753>S突变)、D8样本(p.E746_S752>V突变)、D13样本(p.L747_T751del 突变)、D15样本(p.L747_A750>P突变)、D19样本(p.L747_T751>P)模板。同时使用片段化野生型 DNA制备成阴性对照(negative control)，使用TEBuffer作为无模板对照(NTC)。
二、反应体系的制备和扩增读取
样本准备完成后，本发明引物组合物按照表2中所述配比进行反应体系的配置。微滴生成及PCR 反应过程，扩增读取过程同实施例1。、
扩增结果如图5所示，在检测上述7组缺失突变的模拟临床样本(临床常见亚型)时，检测的阈值划分清晰，且无假阳性荧光信号的产生；因此在检测临床常见亚型样本时，检测后数据分析难度低、准确性高。
实施例3
实施例3设计的引物组合物如下：即6条突变型F1引物共用一条F2引物(即突变型F2-1，SEQ ID NO:8)，对应的突变型F1-1的序列为(SEQ ID NO:15：ACTCGTACTCAGTCAACTCTCCTAACCGTTCCGCCTGTTCCAAACGTCGCTATCAARRCATCTCC) 观察对检测临床最常见突变亚型(p.E746_A750del)的影响(实施例3引物组合物)；其余5条第一上游引物分别为：SEQ IDNO:2～6；探针、下游引物、blocker寡核苷酸、参考引物组合物同实施例1。
实施例3引物组合物按照表3中所述配比进行反应体系的配置。野生型样本及模拟临床样本 (p.E746_A750del缺失突变，即d1样本)同实施例1，微滴生成及PCR反应过程，扩增读取过程同实施例1。
表3：
检测结果如图6和图7所示，在阴性对照反应中，无假阳性荧光信号的产生；在检测d1样本时，本实施例的检测结果显示，双阳性荧光信号略微偏向野生型探针的单阳性荧光信号，阈值划分难度相比于实施例1来说较大。
实施例4
实施例4的引物组合物设计如下：即在常见缺失突变区域设计野生型F1引物，此F1引物跨越常见缺失突变区域，与突变型F1引物形成竞争，在其5’端也添加一段不与模板配对的序列，其由两部分组成：野生型F2引物及野生型探针P，即其检测野生型模板的原理同突变型F1引物检测突变型模板，具体原理如图8所示。其体系内引物及探针序列如表4所示。
具体引物组合物为：
无blocker寡核苷酸，体系内添加两条突变型F2引物，即单独添加一条针对突变型F1-1引物 (SEQ ID NO:1)的F2引物(即突变型F2-1，SEQ ID NO:8)，具体引物组合物如表4所示。反应两组体系分别对应表5。
表4
表5：
此实施例4中使用的野生型样本及模拟临床样本(p.E746_A750del缺失突变，即d1样本)同实施例1，微滴生成及PCR反应过程，扩增读取过程同实施例1。
结果如图9～10所示，可以看出，当使用实施例4的引物组合物时，仅无blocker寡核苷酸。
检测阴性对照样本时，虽然出现少许假阳性荧光信号，但是体系特异性有所提高；
检测d1样本时，阈值划分清晰，数据分析容易，准确性较高。
对比例
对比例的引物组合物设计如下：
为无blocker寡核苷酸，6条突变型F1引物共用一条F2引物(即突变型F2-2，SEQ IDNO:9)，具体引物组合物如表4所示，仅无F2-1。反应两组体系分别对应表6。
表6：
此对比例中使用的野生型样本及模拟临床样本(p.E746_A750del缺失突变，即d1样本)同实施例1，微滴生成及PCR反应过程，扩增读取过程同实施例1。
当使用对比例的引物组合物，无blocker寡核苷酸和无F2-1；
检测阴性对照样本时，出现假阳性荧光信号，体系特异性不足；
检测d1样本时，双阳性荧光信号略偏向野生型探针的单阳性荧光信号，不利于阈值划分。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 迈克生物股份有限公司
<120> 基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒
<130> MB2019
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ccgtctcgca ttaacatatt cctaaccgtt ccgcctgttc caaagtcgct atcaarrcat 60
ctccg 65
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
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<211> 64
<212> DNA
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tctc 64
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<211> 20
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
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<400> 11
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<400> 12
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
ctctcgtctc agcctccatc c 21