鉴别白僵菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用

文档序号：574321 发布日期：2021-05-21 浏览：1次 >En<

阅读说明：本技术 鉴别白僵菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用 (Specific primer, kit and method for identifying beauveria bassiana and application of specific primer, kit and method ) 是由钱正明李春红谢美霞黄琦贺媛吴姿于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一组鉴定球孢白僵菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用。本发明适用于检测或辅助检测待测样品是否含有球孢白僵菌,鉴定或辅助鉴定待测样品含有球孢白僵菌。本发明提供的特异性引物对通过PCR技术可以快速、准确、灵敏地实现上述应用,且引物的特异性强,耐受性好,准确度高,灵敏度高,重复性好,适用范围广,能鉴别劣质中药材是否含有球孢白僵菌。(The invention provides a group of specific primers, a kit and a method for identifying beauveria bassiana and application thereof. The method is suitable for detecting or assisting in detecting whether the sample to be detected contains the beauveria bassiana or not, and identifying or assisting in identifying that the sample to be detected contains the beauveria bassiana. The specific primer pair provided by the invention can quickly, accurately and sensitively realize the application through a PCR technology, has strong specificity, good tolerance, high accuracy, high sensitivity, good repeatability and wide application range, and can identify whether inferior Chinese medicinal materials contain beauveria bassiana or not.)

技术领域

本发明生物学技术领域，具体涉及鉴别白僵菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用。本发明技术适用于检测或辅助检测待测样品中是否含有球孢白僵菌；鉴定或辅助鉴定待测样品中是否为球孢白僵菌。

背景技术

白僵菌为寄生于昆虫上的一种病原真菌，为双核亚界，子囊菌门，盘菌亚门，粪壳菌纲，肉座菌亚纲，肉座菌目，虫草菌科，白僵菌属。白僵菌的分布范围很广，从海拔几米至2000多米的高山均发现过白僵菌的存在，白僵菌可以侵入6个目15科200多种昆虫、螨类的虫体内大量繁殖，同时产生白僵素(非核糖体多肽类毒素)、卵孢霉素(苯醌类毒素)和草酸钙结晶，这些物质可引起昆虫中毒，打乱新陈代谢以致死亡。因此，发明一种能快速鉴别药材中是否含有球孢白僵菌的技术迫在眉睫。

近年来，随着中药鉴定学的发展，中药鉴定的新技术和新方法不断被应用，其中分子生物学的引入，使得可以从基因层面解决中药品种混乱的问题。如专利CN 107164471A介绍了一种检测僵蚕中白僵菌的方法，但该方法只针对鉴别僵蚕的真伪。

目前对白僵菌的鉴别，一直缺少特异验证多种物种中是否含有白僵菌的引物，缺乏一种快速鉴别中药材是否含有球孢白僵菌的分子鉴定方法。

发明内容

本发明为解决现有技术中扩增效果较差、引物对适用范围较窄的问题，提供了一组基于球孢白僵菌ITS基因设计的特异性引物TF2/TR1或TF2/TR2，扩增效果好，不仅能鉴别药材中是否含有球孢白僵菌，而且可以能鉴别僵蚕药材的真伪，同时该引物的特异性强，耐受性好，准确度高，灵敏度高，重复性好，适宜推广应用。本发明适用于检测或辅助检测待测样品是否含有球孢白僵菌，鉴定或辅助鉴定待测样品是否含有球孢白僵菌。

具体的，

一方面，本发明提供了一种鉴别球孢白僵菌的特异性引物对TF2/TR1或TF2/TR2，其序列如表1所示：

一方面，本发明提供了一种球孢鉴别白僵菌的特异性引物对TF2/TR1，其序列如表1所示：

一方面，本发明提供了一种球孢鉴别白僵菌的特异性引物对TF2/TR2，其序列如表1所示：

表1鉴别球孢白僵菌的特异性引物序列

一方面，本发明提供了一种鉴别白僵菌的试剂盒，包括表1所示的引物对TF2/TR1和或TF2/TR2。

一方面，本发明提供了一种鉴别白僵菌的试剂盒，包括表1所示的引物对TF2/TR1和TF2/TR2。

一方面，本发明提供了一种鉴别白僵菌的试剂盒，包括表1所示的引物对TF2/TR1或TF2/TR2。

在一些实施例中，本发明提供了一种鉴别白僵菌的试剂盒，包括表1所示的引物对TF2/TR1。

在一些实施例中，本发明提供了一种鉴别白僵菌的试剂盒，包括表1所示的引物对TF2/TR2。

另一方面，本发明提供了鉴别白僵菌的方法，包括使用本发明所述的引物或本发明所述的试剂盒。

另一方面，本发明提供了一种鉴定白僵菌的方法，包括步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)中的基因组DNA为模板，利用权利要求1-2任一项所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒进行PCR扩增，获得扩增产物；

(3)将步骤(2)中获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测待测样品。

在一些实施例中，PCR扩增体系为：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL或Pfu Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各0.75-1.25μL，DNA模板量为0.08-264.3ng，无菌双蒸水补足至25μL。

在一些实施例中，PCR扩增体系为：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL或Pfu Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各0.75-1.25μL，DNA模板量为0.08-100ng，无菌双蒸水补足至25μL。

在一些实施例中，TF2/TR2的PCR扩增体系适用于TF2/TR1。

在一些实施例中，PCR扩增体系为：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，浓度为88.1ng/μL的DNA模板1μL，无菌双蒸水补足至25μL。

在一些实施例中，PCR扩增体系为：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1.25μL，浓度为8.81ng/μL的DNA模板1μL，无菌双蒸水补足至25μL。

在一些实施例中，PCR扩增体系为：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各0.75μL，浓度为0.881ng/μL的DNA模板1μL，无菌双蒸水补足至25μL。

在一些实施例中，TF2/TR1的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10-30s，48-66℃退火10-30s，72℃延伸10-20s，25-35轮；72℃最后延伸5min。

在一些实施例中，TF2/TR1的PCR扩增程序为：TF2/TR1的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，30轮；72℃最后延伸5min。

在一些实施例中，TF2/TR1的PCR扩增程序为：TF2/TR1的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。

在一些实施例中，TF2/TR2的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10-30s，48-70℃退火10-30s，72℃延伸10-20s，25-35轮；72℃最后延伸5min。

在一些实施例中，TF2/TR2的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s，30轮；72℃最后延伸5min。

在一些实施例中，TF2/TR2的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，64℃退火15s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min；

在一些实施例中，TF2/TR2的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，64℃退火10s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min；

在一些实施例中，TF2/TR2的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s，35轮；72℃最后延伸5min；

在一些实施例中，TF2/TR2的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s，25轮；72℃最后延伸5min。

在一些实施例中，对获得的扩增产物琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定；琼脂糖凝胶电泳方法：PCR产物5μL+1μL 6x Loading Buffer，电压120V，电流为300mA，时间30min；鉴定白僵菌特征在于，可以获得大小为200-300bp唯一条带。

另一方面，本发明提供了一种使用本发明所述的方法鉴定白僵菌的试剂盒。

另一方面，本发明提供了本发明所述引物的应用，其特征在于，包括：

制备用于检测或辅助检测白僵菌的试剂盒；

检测或辅助检测待测样品中是否含有白僵菌；

制备用于鉴定或辅助鉴定白僵菌的试剂盒；

鉴定或辅助鉴定待测样品中是否为白僵菌。

另一方面，本发明提供了本发明所述方法的应用，其特征在于，包括：

检测或辅助检测待测样品中是否含有白僵菌；

鉴定或辅助鉴定待测样品中是否为白僵菌。

详细说明

本发明将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出。本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。有很多文献和相似的物质与本发明申请相区别或抵触，其中包括但绝不限于术语的定义，术语的用法，描述的技术，或如本发明申请所控制的范围。

本发明所使用的“引物”是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR(聚合酶链式反应)技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

本发明所使用的“鉴定白僵菌的方法”包括但不限于检测或辅助检测待测样品中是否含有球孢白僵菌；鉴定或辅助鉴定待测样品中是否为球孢白僵菌。

本发明所使用的“琼脂糖凝胶电泳方法”为用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用，本发明使用的琼脂糖凝胶浓度为2％。

本发明所使用的“PCR扩增体系”是指PCR体外扩增所需试剂的一个组合。PCR为聚合酶链式反应的缩写，是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。本发明所使用的扩增体系含有PrimeSTAR Max DNA Polymerase或Pfu Mix或PCR Mix 12.5μL、引物各1μL、模板1μL、ddH₂O 9.5μL。

本发明所使用的“2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase”为PCR反应中使用的一种扩增预混液，含有PrimeSTAR HS DNA聚合酶、2mM Mg²⁺、0.4mM dNTP。

本发明所使用的“Pfu Mix”为PCR反应中使用的一种扩增体系，含有Pfu DNA聚合酶、0.4mM dNTP、100mM KCl、20mM Tris-HCl、3mM MgCl₂、溴酚蓝。

本发明所使用的“PCR Mix”为PCR反应中使用的一种扩增体系，含有0.1U/μL TaqDNA聚合酶、0.4mM dNTP、100mM KCl、20mM Tris-HCl、3mM MgCl₂、溴酚蓝。

本发明所使用的“Loading Buffer”是一种琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液，本发明所用的上样缓冲液为6x Loading Buffer，组成为：30mM EDTA、36％(V/V)甘油、0.035％(W/V)二甲苯蓝、0.05％(W/V)溴酚蓝。

本发明所使用的“mM”为浓度单位mmol/L的缩写。

TF1序列为序列表中SEQ ID NO.1：CCATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCT

TF2序列为序列表中SEQ ID NO.2：CGTCCCCAAGGGGAGGTC

TR1序列为序列表中SEQ ID NO.3：CCGGGGACCTCAAACTCT

TR2序列为序列表中SEQ ID NO.4：CGGCCCGCCGGGGACCTC

本发明提供的球孢白僵菌特异性引物对TF2/TR1、TF2/TR2特异性强，扩增效果好，耐受性好，灵敏度高，适用条件广，可以鉴别冬虫夏草，蛹虫草子实体，，粉拟青霉，宛氏拟青霉，金龟子绿僵菌，凉山虫草，戴氏虫草，亚香棒虫草，新疆虫草，地蚕，白草，蛹虫草，蝉花等多种物种是否含有球孢白僵菌，也可用于鉴别中药材僵蚕的真伪。

附图说明

图1球孢白僵菌阳性样品引物筛选凝胶电泳图，其中1、2分别代表样品S1和S2，N代表阴性对照品溶液，M代表Marker。

图2球孢白僵菌伪品引物筛选凝胶电泳图，其中A：TF1/TR1；B：TF1/TR2；C：TF2/TR1；TF2/TR2，1～14代表S39～S52；15代表S26；；16代表S34；17代表S23；N代表阴性对照(无菌双蒸水)。

图3TF2/TR2不同退火温度考察凝胶电泳图，其中1代表S20；2代表S21；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

图4TF2/TR2不同反应时间考察凝胶电泳图，其中1代表S20；2代表S21；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

图5TF2/TR2不同反应轮数考察凝胶电泳图，其中1代表S20；2代表S21；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

图6TF2/TR2不同引物量考察凝胶电泳图，其中1代表S20；2代表S21；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

图7TF2/TR2不同酶考察凝胶电泳图，其中1代表S20；2代表S21；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

图8TF2/TR2不同模板量考察凝胶电泳图，其中1-6依次代表S20模板量264.3ng/132.15ng/88.1ng/8.81ng/0.881ng/0.0881ng,N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

图9TF2/TR2重复性考察凝胶电泳图，其中1-6代表S21；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

图10TF2/TR2中间精密度考察凝胶电泳图，其中1-6代表S21；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

图11TF2/TR2引物对用于球孢白僵菌的快速PCR鉴别，其中A为TF2/TR2与球孢白僵菌样品PCR扩增，1-2代表S1-S2，3-14代表S10-S21，；B为TF2/TR2伪品鉴别，1-13代表S26-S38，14代表S19，以S19作为阳性对照溶液；C为TF2/TR2伪品鉴别，1-14代表S39-52，15代表S19，以S19作为阳性对照溶液，N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

图12TF2/TR1引物对用于球孢白僵菌的快速PCR鉴别，其中A为TF2/TR1与球孢白僵菌样品PCR扩增,1-23代表S1-S23；B为TF2/TR1伪品鉴别,1-10代表S29-S38,11代表S19,以S19作为代表阳性对照溶液；C为TF2/TR1伪品鉴别,1-14代表S39-S52，15代表S19，以S19作为代表阳性对照溶液；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。

具体实施方式

为能进一步解释本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与方案，结合以下附图与具体实施方式对本发明的详述进行进一步地解释。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种修改和改动，这些等价形式同样落于本发明所要求保护的范围内。

实施例1：白僵菌引物的制备

1、样品来源

样品共52批，其中白僵菌样品25批，伪品27批(冬虫夏草，蛹虫草子实体，，粉拟青霉，宛氏拟青霉，金龟子绿僵菌，凉山虫草，戴氏虫草，亚香棒虫草，新疆虫草，地蚕，白草，蛹虫草，蝉花，发酵冬虫夏草菌粉)，具体样品信息见表2：

表2样品信息表

注：混合混末*是指人为制作含有球孢白僵菌的虫生真菌样品，即将蛹虫草子实体(S30、S31)、凉山虫草(S39)、戴氏虫草(S40)、亚香棒虫草(S41)、新疆虫草(S42)、地蚕(43)、白草(S44)、蛹虫草(S45)的粉末按照50:1(g/g)的比例分别与球孢白僵菌冻干粉末(S20)混合均匀后得到样品S10～S18。因较难搜集自然界含有球孢白僵菌的虫生真菌样品，所以人为制作含有球孢白僵菌的样品用以验证。若市面上的药材含有球孢白僵菌可通过该方法快速鉴别。

2、实验仪器和试剂

表3实验仪器

表4实验试剂

3、DNA提取

取样品30mg至2mL离心管中，利用天根高效植物基因组提取试剂盒提取球孢白僵菌样品以及伪品的DNA。提取物分装5μL/管，放置-20℃备用

4、ITS通用引物PCR扩增反应

取球孢白僵菌DNA提取物，利用ITS通用引物对ITS5F/ITS4R进行PCR扩增反应，PCR产物由测序公司(广州天一辉远基因科技有限公司)测序。

通用引物对：ITS5F：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

ITS4R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR扩增体系：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL，10μmol/L的ITS5F/4R引物对各1μL，DNA模板量(浓度为10ng/μL)为1μL，补充无菌双蒸水至25μL。

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性45s，64℃退火45s，72℃延伸1min，35轮；72℃最后延伸10min。

3、PCR产物测序设计特异性引物

基于ITS基因核酸片段设计特异性引物对：将测序得到的球孢白僵菌基因组序列，通过BLAST数据库比对，获得并下载同源性高的基因序列，应用DNAMAN软件将测得的序列与下载的序列一同进行比对，找到变异位点比较多的片段，将该片段导入引物设计软件Primer Premier 5.0，设计出4对球孢白僵菌特异性引物具体如下：

表5基于球孢白僵菌ITS基因核酸片段设计的扩增引物对序列

4、ITS特异性引物筛选

取2批球孢白僵菌阳性样品(S1、S2)作为模板，利用上述4对引物进行PCR扩增筛选引物，PCR产物进行凝胶电泳分析。

取1批球孢白僵菌阳性样品(S1)和16批球孢白僵菌伪品样品(S26、S34、S39～S52)作为模板，利用上述4对引物进行PCR扩增筛选引物，PCR产物进行凝胶电泳分析。

其中，

PCR扩增体系：2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，DNA模板(浓度为<100ng/μL)1μL，无菌双蒸水9.5μL

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。(此PCR扩增条件参考Max DNA Polymerase说明书)琼脂糖凝胶电泳：取PCR产物5μL，往其中加入1μL 6×Loading Buffer，混匀后取5μL样品加入到凝胶点样孔中，同时在样品的一侧的凝胶孔中加入5μL的DL500 DNA Maker，之后立即进行电泳，电压为120V、电流为300mA、时间为30min。

引物筛选结果：

a.球孢白僵菌阳性样品作为模板筛选引物

设计的4对引物对均可以分别扩增出预期的目标条带，阴性样品无条带，结果可靠，如图1所示。

b.球孢白僵菌伪品样品作为模板筛选引物

如图2所示，对于TF1/TR1引物对，S34样品出现与球孢白僵菌样品(S1)一致的预期目标条带，该引物对不能鉴别粉拟青霉样品；TF1/TR2引物对出现较多的非特异性条带；TF2/TR1引物对、TF2/TR2引物对仅球孢白僵菌样品出现预期目标条带，非特异性条带较少；各阴性样品均无条带出现，结果可靠。

因此，设计的4对引物中，TF2/TR1、TF2/TR2可以作为鉴别白僵菌的特异性引物。

实施例2：TF2/TR2引物对PCR扩增条件和程序研究

取球孢白僵菌样品S20、S21，提取DNA，利用TF2/TR2引物对进行PCR扩增。

1、退火温度考察

PCR扩增体系：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL，TF2、TR2引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度：<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。

阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，48℃/50℃/53℃/55℃/57℃/60℃/62℃/64℃/66℃/68℃/70℃退火30s，72℃延伸20s，30轮；72℃最后延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，退火温度为48℃～70℃，球孢白僵菌样品溶液均在200～300bp之间有相同的单一DNA条带，70℃时目标条带的亮度较淡；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置均未出现条带，结果可靠。说明在本实验设置的退火温度48℃～70℃范围内，TF2/TR2引物对皆可对球孢白僵菌进行鉴定，本实验最终选择64℃作为退火温度。结果如图3所示。

2、反应时间考察

PCR扩增体系：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL，TF2、TR2引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度：<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。

阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可

PCR扩增程序：设置三种反应时间1/2/3

表2不同反应时间参数设置

琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，三种不同的反应时间下球孢白僵菌供试品溶液均在200～300bp之间有相同的单一DNA条带；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置均未出现条带，结果可靠。说明本实验设置的不同反应时间对球孢白僵菌特异性PCR快速检测结果皆无影响。结果如图4所示。

3、反应轮数考察

PCR扩增体系：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL，TF2、TR2引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度：<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。

阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s，25/30/35轮；72℃最后延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，三个不同的反应轮数球孢白僵菌供试品溶液均在200～300bp之间有相同的单一目标DNA条带；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置均未出现条带，结果可靠。本实验设置的反应轮数为25轮～35轮皆对球孢白僵菌特异性PCR快速检测结果无影响。结果如图5所示。

实施例3：TF2/TR2引物对耐用性研究

1、不同引物量考察

取球孢白僵菌样品S20、S21，提取DNA，利用TF2/TR2引物对进行PCR扩增。

PCR扩增体系：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL，TF2、TR2引物(10μmol/L)各0.5μL/0.75μL/1μL/1.25μL，DNA模板量(浓度：<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。

阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可。