Chmp2b蛋白靶向抑制剂及在缺血性心脏病中的应用
阅读说明：本技术 Chmp2b蛋白靶向抑制剂及在缺血性心脏病中的应用 (CHMP2B protein targeted inhibitor and application thereof in ischemic heart disease ) 是由 马恒 李天� 穆楠 余璐 于 2021-01-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物技术领域,具体涉及CHMP2B蛋白靶向抑制剂及其在制备预防或治疗缺血性心脏病药物中的应用。本发明为CHMP2B蛋白靶向抑制剂用于治疗缺血性心脏病提供了重要理论依据,为现有缺血性心脏病的预防和治疗提供了新的药物解决方案。同时为已知药物二甲双胍或其可药用盐发掘了新的制药用途,扩宽了该药物的治疗范围。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to a CHMP2B protein targeted inhibitor and application thereof in preparing medicines for preventing or treating ischemic heart diseases. The invention provides an important theoretical basis for the application of the CHMP2B protein targeted inhibitor in treating the ischemic heart disease, and provides a new drug solution for the prevention and treatment of the existing ischemic heart disease. Meanwhile, the new pharmaceutical application of the known medicament metformin or the pharmaceutically acceptable salt thereof is developed, and the treatment range of the medicament is widened.)
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种CHMP2B蛋白靶向抑制剂及在缺血性心脏病中的应用。
背景技术
《中国心血管病报告2019》数据显示，心血管病是国人首要死亡原因，高于肿瘤及其他疾病。其中，冠心病所致心肌梗死是国人致死率及致残率的重要原因。目前冠心病的发病率整体仍呈上升趋势、居高不下，多数患者在接受经皮冠状动脉介入术后生活质量较差，目前尚无治愈方法。
心肌细胞是高度分化的终末细胞，细胞生存过程中的异常事件或蛋白质失稳态主要靠细胞自身完成，高效、可靠、准确的进行蛋白质降解和再利用。心肌细胞在对抗损伤的过程中生物大分子出现异常的蓄积可引起细胞内稳态的失衡，最终导致细胞死亡。自噬作为一种有效防止异常蛋白和细胞器蓄积的生理学进程，对于保持细胞自我更新和能量的动态平衡至关重要。心肌细胞自噬功能障碍可导致心肌缺血再灌注损伤显著加重。同样，心肌缺血再灌注损伤也可破坏心肌自噬功能。因此，积极提高心肌在缺血再灌注过程中的自噬功能是有效的心肌保护策略。
目前对于缺血性心脏病药物主要依赖他汀类、硝酸酯类、β受体拮抗剂等药物，但这些药物不能从根本上治愈缺血性心脏病。因此探索新的治疗策略以提高疗效，改善缺血性心脏病患者预后，具有重要的临床意义。靶向调控缺血再灌注心肌自噬的关键因子在临床中的应用极富前景，其独特的治疗方案符合精准靶点干预的医学理念。
发明内容
本发明的第一目的在于提供CHMP2B蛋白靶向抑制剂在制备预防或治疗缺血性心脏病药物中的应用。
荷电多泡体蛋白2B(CHMP2B，Charged multivesicular body protein 2B)作为胞内分选体复合物(ESCRT-III)的一个组成部分，是自噬稳态的必要分子。首先，本发明通过体内、体外试验研究发现了在缺血再灌注小鼠中，CHMP2B 过表达与心肌缺血易损之间关系。
体内试验以野生型(Wide type，WT)C57 BL/6J小鼠为研究对象，通过开胸，连接呼吸机，心肌腺病毒点注射方式使小鼠心肌成功过表达CHMP2B蛋白，注射3日后通过腹腔注射戊巴比妥钠，连接呼吸机，对冠状动脉前降支进行结扎和解除结扎构建体内心肌缺血再灌注(MI/R)损伤模型。其中缺血30min，再灌注2h(信号通路检测)或4h(组织学/形态学检测)。免疫组织化学结果检测发现，相比于空白对照组，心肌CHMP2B蛋白大量表达，LC3 II/I和p62 水平显著升高，(MI/R)小鼠心肌梗死面积增加，外周血LDH和CK-MB水平升高。超声心动图结果显示左室射血分数(EF％)和左心室短轴缩短率(FS％) 显著减退，MI/R死亡率显著升高。相比于CHMP2B蛋白过表达组，MI/R+ CHMP2B过表达组心肌损伤和死亡率更高，上述结果证实：CHMP2B过表达/ 过度积累可导致MI/R损伤加重，出现心肌缺血易损。
体外试验采用大鼠H9c2心肌细胞系为研究对象，采用95％N2和5％CO2的气体参数，缺氧15h，复氧1h构建心肌细胞缺氧复氧模型(H/R)。H/R导致心肌细胞活力下降，细胞分泌液中CK-MB活性和LDH水平升高。通过转导 CHMP2B过表达腺病毒48h后发现，CHMP2B显著提高了细胞中LC3 II/I、 LAMP1以及p62的蛋白水平，增加了H/R下心肌细胞凋亡率，加重了H/R损伤。
本发明通过研究发现，在MI/R处理的小鼠体内以及H/R处理的心肌细胞中，CHMP2B，Charged multivesicular body protein 2B蛋白积累升高，累积的 CHMP2B可诱导自噬通量受损，从而增强心肌缺血易损性。体内和体外试验均表明，上调CHMP2B蛋白水平可抑制心肌细胞自噬通量，导致H/R心肌细胞恶化和MI/R损伤。即本发明首次发现并证实了CHMP2B的积累反而损害心脏自噬功能，增强心脏系统对缺血再灌注损伤的脆弱性。这一发现表明CHMP2B 的积累增加了心肌缺血的风险，是治疗缺血性心脏病的潜在靶点。
其次，本发明通过研究发现了二甲双胍调控Atrogin-1和CHMP2B蛋白之间的相互作用关系。免疫沉淀(IP)结果证实，Atrogin-1和CHMP2B在H9c2 心肌细胞中具有明确的相互结合效应。Atrogin-1表达可促进CHMP2B蛋白降解。Atrogin-1，也称为MAFbx或Fbx32，是一种在骨骼肌和心肌中特异的E3 泛素连接酶。目前为止，未见关于Atrogin-1和CHMP2B之间内在关系的相关报道。本发明通过研究证实了CHMP2B是Atrogin-1降解的底物，Atrogin-1通过泛素依赖途径降解CHMP2B，进而在心肌缺血再灌注损伤中发挥关键作用。
最后，本发明研究发现了二甲双胍通过特异性抑制CHMP2B蛋白的表达而发挥心肌保护作用的新的作用机制。试验结果表明：1.对心肌细胞中外源性二甲双胍处理，免疫印迹结果发现二甲双胍可以激活pAMPK水平。相比于H/R 组，二甲双胍能进一步上调pAMPK水平。2.对心肌细胞给与外源性二甲双胍处理，免疫印迹结果发现二甲双胍可以激活Atrogin-1通路，下调CHMP2B通路。3.在H/R和MI/R条件下，CHMP2B信号表达上调，给与二甲双胍处理可以降低CHMP2B的积累。4.在H/R和MI/R条件下，自噬流受阻，表现为LC3 水平上调，底物标志p62过度积聚，给与二甲双胍处理维持自噬流功能稳态。 5.相比于MI/R条件下，心肌CHMP2B过表达小鼠心肌梗死面积增加，外周血 LDH和CK-MB水平升高。超声心动图结果显示左室射血分数(EF％)和左心室短轴缩短率(FS％)显著减退，MI/R死亡率显著升高，给与外源性二甲双胍可以降低心肌损伤指标，提高心功能和缺血后生存率。
上述试验结果证实了二甲双胍能够通过激活AMPK/Atrogin-1通路，促进累积的CHMP2B降解，进而发挥缺血心肌保护作用。具体的，二甲双胍通过激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)上调Atrogin-1，使得Atrogin-1与CHMP2B的相互作用增强，促进CHMP2B蛋白在H/R以及MI/R心肌细胞中的降解，从而抑制了CHMP2B 的积累诱导的自噬损伤和缺血易损性。即二甲双胍治疗可通过AMPK依赖途径促进Atrogin-1降解CHMP2B，维持心肌自噬通量在MI/R下的稳态。一方面，这一结果揭示了二甲双胍在心肌保护中的全新的作用机制，丰富了对心肌缺血保护的认知范围，为缺血性心脏病的预防和治疗提供了新的药物；另一方面，这提示了二甲双胍在开发成为CHMP2B蛋白靶向抑制剂中的用途。德国学者报道：较正常对照组相比，阿尔茨海默症患者海马胞质 CHMP2B阳性颗粒空泡包涵体的神经元数量更多(BrainRes.2019.PMID: 30414727 DOI:10.1016/j.brainres.2018.11.008)。这提示CHMP2B蛋白靶向抑制剂可能对阿尔兹海默症的治疗具有一定作用。因此，作为本发明的变形，本发明还涉及二甲双胍在制备治疗或预防与CHMP2B蛋白过表达相关的疾病中的用途。
根据本发明所述的应用，所述二甲双胍为二甲双胍或其可药用盐，所述二甲双胍可药用盐优选为二甲双胍盐酸盐，相比于二甲双胍其水溶性更佳，利于患者服用。一日给药剂量为100mg/kg小鼠体重，或者不超过2550mg/kg人体体重。
根据本发明所述的应用，所述缺血性心脏病为急性心肌梗塞、慢性缺血性心脏病中的任意一种。
根据本发明所述的应用，在用于预防或治疗缺血性心脏病时，所述 CHMP2B蛋白靶向抑制剂药物可单独使用，或与包括他汀类、硝酸酯制剂、β受体拮抗剂以及水杨酸类在内的一种或多种药物联合使用。因此本发明还涉及将CHMP2B蛋白靶向抑制剂与其它现有的治疗缺血性心脏病药物组合使用的情况。
本发明的再一目的在于提供一种抑制CHMP2B蛋白表达的药物制剂。
根据本发明所述的药物制剂，其含有二甲双胍或其可药用盐作为活性成分，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋型剂作为辅助性成分。所述药物制剂的剂型优选为口服剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂，优选为片剂。所述药物制剂为常释、延释、缓释或控释的药物制剂。所述药物制剂可根据常规的药物制剂学工艺制备得到。
本发明的有益效果为：
1、本发明通过体内MI/R和体外H/R实验首次证实了抑制CHMP2B的积累利于心肌自噬通量的稳态，进而有助于减轻MI/R或H/R诱导的心肌细胞死亡和心肌功能障碍，因此，CHMP2B蛋白是治疗缺血性心脏病的潜在靶点。本发明提供的CHMP2B蛋白靶向抑制剂在制备预防或治疗缺血性心脏病药物中的应用，为现有缺血性心脏病的治疗提供了新的药物解决方案，对于改善缺血性心脏病患者预后，具有重要的临床意义。
2、本发明首次发现二甲双胍可以通过AMPK/Atrogin-1依赖的途径对 CHMP2B进行及时的降解，有效改善自噬流。这是二甲双胍心肌保护作用的新机制,丰富了对心肌保护机制的认识，提示了二甲双胍可开发成为CHMP2B蛋白靶向抑制剂用于治疗或预防与CHMP2B蛋白过表达相关的疾病。因此，本发明为已知药物二甲双胍或其可药用盐发掘了新的制药用途，开拓了一个新的应用领域。
附图说明
图1A：H9c2细胞Atg 5、LC3 II/I、LAMP1以及p62蛋白的代表性免疫印迹图；
图1B：细胞活力、CK-MB活性以及LDH水平定量结果；
图2A：空白对照组、模型组以及治疗组CHMP2B蛋白印迹图；
图2B-2C：通过微阵列方法分析三名汉族冠心病患者和三面汉族健康人外周血CHMP2B mRNA表达情况；
图3A：CHMP2B、LC3 II/I、LAMP1以及p62蛋白代表性的免疫印迹图；
图3B：空白腺病毒和CHMP2B过表达腺病毒组心肌细胞给予bafilomycin A1(10nM)或DMSO处理后，CHMP2B、LC3 II/I以及p62蛋白代表性的免疫印迹图；
图3C：使用流式细胞术V-FITC/PI方法测得细胞凋亡率，B2+B4象限代表凋亡率；
图4A：各组p-AMPKα、AMPKα、Atrogin-1以及CHMP2B代表性的免疫印迹图；
图4B：H9c2细胞给与二甲双胍(2.5mmol/L)或Compound C(20μmol/L) 处理12h后，各组p-AMPKα、AMPKα、Atrogin-1以及CHMP2B代表性的免疫印迹图；
图4C：qRT-PCR测得Atrogin-1的mRNA相对表达量；
图5A：H9c2细胞给予Myc-Atrogin-1和Flag-CHMP2B质粒标签，使用免疫沉淀(IP)法检测Atrogin-1和CHMP2B蛋白相互结合情况；
图5B-5C：H9c2细胞给予MG-132(10μM)处理12及24h结果；
图5D：5C图的定量灰度值结果分析；
图5E：IP结果显示：Atrogin-1与CHMP2B蛋白在C57小鼠心肌内相互结合；
图6A：免疫组化结果显示CHMP2B蛋白过表达(标尺：100μM)；
图6B：C57小鼠在MI/R前72h注射Ad-CHMP2B、p-AMPKα、AMPKα、 Atrogin-1、CHMP2B、p62以及LC3 II/I代表性的免疫印迹图；
图6C：左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴收缩率(LVFS)；
图6D：LDH水平；
图6E：CK-MB活性；
图6F：心律失常指数；
图7A：Ad-CHMP2B、p-AMPKα、AMPKα、Atrogin-1、CHMP2B、p62以及LC3 II/I代表性的免疫印迹图片；
图7B-图7C：左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴收缩率(LVFS)；
图7D：LDH水平；
图7E：CK-MB活性；
图7F：心律失常指数；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例一：心肌CHMP2B蛋白水平、心肌自噬功能、心肌缺血损伤之间关系的实验研究
1.材料和实验设计
1.1体内实验
1.1.1实验材料
雄性C57BL/6J小鼠(3-4月龄)，购自第四军医大学实验动物中心。本研究得到第四军医大学动物伦理实验委员会的批准(IACUC-20200602)。动物按 12:12小时的白昼/黑夜模式饲养，自由饮食。
1.1.2实验分组及给药
将小鼠随机分为治疗组和对照组。治疗组采用腹腔注射的方式给予北京Solarbiol公司盐酸二甲双胍(100mg/kg/d)，生理盐水作对照，连续给药7天。对照组小鼠给予等量的生理盐水。
1.1.3在体缺血再灌注手术(MI/R)
小鼠采用2％异氟醚麻醉，气管插管，小动物呼吸机机械通气(成都泰盟有限公司，中国)。左外侧开胸，用7-0号尼龙缝线结扎左前降支(LAD)，缺血30分钟，再灌注后2小时(信号分子检测)或4小时(形态学检测)。
1.2体外实验
1.2.1实验材料
H9c2细胞是来源于BD1X大鼠的胚胎心肌组织所衍生的亚克隆细胞系，购于中国科学院上海细胞库。采用改良的杜氏培养基(DMEM，Gibco公司，美国)、10％胎牛血清(Gibco公司，美国)、青霉素链霉素混合物(Gibco公司，美国)和1％(Solarbiol公司，北京)。细胞培养在37℃、5％CO2的条件中培养。每两天换液一次，在细胞达到70-80％的融合度时进行实验。
1.2.2实验分组及给药
将H9c2细胞随机分为处理组、模型组及空白对照组。处理组给予盐酸二甲双胍(以下均用二甲双胍代指，2.5mmol/L)处理12h，模型组以及空白对照组均给予DMEM培养基处理12h，其中模型组的气体环境为缺氧复氧环境。
1.2.3缺氧/复氧损伤(H/R)
除空白对照组外，其余各组H9c2细胞首先在含95％N2和5％CO2的缺氧孵育盘(Billups-Rothenberg公司,美国)中处理15小时，然后再复氧(95％空气和5％CO2)1小时。
2.分子、形态学及功能学实验
2.1免疫印迹和免疫沉淀
兔抗p-AMPKα(#2535)、AMPKα(#5832)、CHMP2B(#76173)、α-微管蛋白 (#9099)、p62(#16177)、LC3B(#3868)和atg5(#12994)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司(Danvers,USA)；兔抗Atrogin-1(Muscle atrophy box F gene 1, ab168372)和LAMP1(ab24170)抗体购自美国Abcam公司；绵羊抗CHMP2B (AF7509)购自美国R&D System公司，MG-132(10μM)和Bafilomycin-A1 (Baf-A1,10nM)购自美国MCE公司。免疫沉淀使用美国Invitrogen公司的免疫沉淀试剂盒。增强化学发光检测试剂盒购自德国Millipore公司。
2.2免疫组织化学和免疫荧光
按照既往文献报道方法(Yan et al.Circulation 136(22),2162-2177；Zhao etal. Ann Transl Med 8(10),647)，对心脏切片进行免疫荧光、免疫组化染色，对H9c2 细胞固定后进行免疫荧光实验。
2.3细胞生存能力
采用Solarbiol公司的CCK-8试剂盒测定细胞活力。100μL的H9c2细胞培养液加10μL CCK-8溶液。37℃孵育1小时后，使用酶标仪(Molecular Devices, CA,USA)测定450nm处的吸光度。
2.4心肌损伤检测
在MI/R后24小时采集血液样本，通过分光光度法检测CK-MB活性和LDH 浓度。
2.5腺病毒转染
用Ad-CHMP2B(GemmaPharma公司，上海)转染H9c2细胞。本研究采用腺病毒滴度为1.0×1010pfu/mL，感染比例(multiplicity of infection,MOI)为100:1。转染48h后，给予二甲双胍处理。
使用Rattus Flag-CHMP2B质粒和Myc-Atrogin-1质粒(RR212771,OriGene,Rockville,MD,USA)用于IP实验。通过DNA合成法构建5’和3’端含有Not I 和Kpn I酶切位点的Rattus CHMP2B完整开放阅读框(open reading frame,ORF) (上海生工公司)。合成cDNA插入到pFlag-CMV-2载体中。GFP-mRFP-LC3 病毒是研究自噬通量的腺病毒工具(20812860)。细胞经GFP-mRFP-LC3腺病毒(1.0×1010pfu/mL,汉恒公司,上海，中国)处理，MOI为100:1。转染48h 后给细胞注射二甲双胍。
2.6流式细胞术分析
细胞用Tyrisin(Solarbiol,China,Beijing)收集并给与PBS洗涤3次。用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)染色进而在FACSCalibur流式细胞仪分析(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)。
2.7 qRT-PCR
提取RNA并实时定量PCR。本研究使用的引物序列如下(5’-3’):Atrogin-1 正向GGGAGTACTAAGGAGCGCCA，反向TCTGGACCAGCGTGCATAAG； Actin正向GTCCCTCACCCTCCCAAAAG，反向GCTGCCTCAACCTCAACCC。
2.8超声心动图和心电图
使用Vevo 2100(visualsonics,Canada)进行超声心动描记。用2％异氟醚麻醉小鼠。给小鼠四肢连接电极获得左心室(LV)高分辨率二维模式图像，进而分析左室缩短分数(LVFS)和射血分数(LVEF)。
3.数据处理
数据以平均值±平均标准偏差(SEM)表示。采用单因素方差分析和Dunnett 检验来分析组间统计差异。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0(San Diego, CA,USA)进行。p≤0.05为视为有统计学差异。
4.结论
(1)二甲双胍可防止H/R诱导的心肌细胞自噬障碍和细胞损伤
在H/R处理的H9c2细胞中，模型组Atg5、LC3 II/I、LAMP1和p62的表达水平显著升高(图1A)，说明自噬流受阻。体外荧光结果证实了自噬小体的积累。与模型组相比，二甲双胍治疗组显著降低H/R心肌细胞p62水平，表现为Atg5、LC3 II/I、LAMP2水平(图1A)以及黄色荧光降低。此外，二甲双胍治疗组可保护H/R诱导的心肌细胞损伤，提高细胞活力，并抑制CK-MB活性和LDH浓度水平(图1B)。图1中，M：二甲双胍；V：给与DMEM处理； H/R：缺氧复氧；RLU：相对发光值；与空白对照组比*p≤0.05，与模型组比#p ≤0.05。
(2)CHMP2B在H/R下的心肌细胞中过度积累。相比于健康人，CHMP2B mRNA在冠心病患者外周血中上调
与空白对照组相比，CHMP2B水平在H/R诱导的自噬受损心肌细胞中显著升高(约3.8倍)(图2A)。二甲双胍治疗组可抑制CHMP2B水平，恢复心肌细胞自噬流水平(图2A)。
(3)CHMP2B过表达降低心肌细胞自噬水平，加剧心肌MI/R的易损性。
我们评估了自噬抑制与CHMP2B积累之间的关系。分别用空白腺病毒 (Ad-Con)以及CHMP2B过表达腺病毒(Ad-CHMP2B)感染H9c2细胞48h。腺病毒介导的CHMP2B过表达显著提高了细胞中LC3 II/I、LAMP1和p62的蛋白水平(图3A)。用巴非霉素A1(Baf-A1)处理后测定自噬指标。Baf-A1 处理48h后，Ad-Con组LC3 II/I和p62蛋白水平升高。然而，在过表达CHMP2B 的心肌细胞上却未显示出任何显著的变化(图3B)，这意味着过度CHMP2B 积累已经造成自噬障碍。CHMP2B相关的自噬通量抑制增强了H/R诱导的心肌细胞凋亡(图3C)。这些结果表明，虽然CHMP2B介导了基础条件下的自噬，但过量的CHMP2B积累可抑制自噬，增强H/R诱导的心肌细胞死亡。
此外，我们通过美国国家生物技术信息中心的GEO数据库(序列号： GSE71226)分析了冠心病患者的临床资料。从中国汉族冠心病患者和健康对照者的外周血中提取的总RNA样本，我们用火山图分析了这些数据。芯片结果显示相比于健康人，冠心病患者CHMP2BRNA水平上调。这些结果表明， CHMP2B的积累与自噬功能障碍和缺血性损伤有关。
(4)二甲双胍通过AMPK抑制CHMP2B在H/R处理的心肌细胞中的积累
二甲双胍治疗组显著增强了H/R处理心肌细胞中AMPK的磷酸化，增强了 Atrogin-1(一种肌肉特异性泛素连接酶)的表达，并抑制CHMP2B在H/R心肌细胞中的积累(图4A)。此外，二甲双胍通过AMPK途径上调了Atrogin-1 蛋白和mRNA的表达水平(图4B和图4C)，同时抑制了CHMP2B的水平。然而，这些作用被AMPK活性Compound C(CC,20μM)阻断(图4B-4C)。AMPK 抑制剂导致心肌细胞自噬功能降低，这使得自噬流被阻断。我们还发现Atrogin-1 和CHMP2B蛋白在心肌细胞中共定位。在H/R损伤期间，二甲双胍处理显著增强了Atrogin-1和CHMP2B的荧光共定位。这些结果表明，Atrogin-1直接与 CHMP2B相互作用，二甲双胍在H/R条件下通过激活AMPK调控这一过程。
(5)CHMP2B被Atrogin-1降解
我们通过体外实验证实了Atrogin-1与CHMP2B的相互作用。在H9c2细胞中，flag标记的CHMP2B与myc标记的Atrogin-1蛋白相互结合(图5A)。心肌细胞的蛋白酶体抑制剂mg-132(10μM)处理会导致CHMP2B泛素化(图 5B)，并出现时间依赖性效应(图5D)。我们的体内实验证实Atrogin-1和 CHMP2B之间相互作用(图5C-5E)。这些结果显示：CHMP2B是心肌细胞中 Atrogin-1的泛素化降解底物。
(6)体内CHMP2B的积累可降低自噬水平，加重MI/R损伤
3-4月龄C57野生型小鼠心室注射CHMP2B过表达的腺病毒 (Ad-CHMP2B)或空白腺病毒(Ad-Con)48小时，并用GFP标记感染的心肌组织。免疫荧光和免疫组化结果显示，成功建立了Ad-CHMP2B过表达的体内模型(图6A)。我们发现过表达的CHMP2B对AMPK磷酸化和Atrogin-1表达无影响。然而，心肌组织中LC3 II/I和p62水平显著升高，并在MI/R期间维持着较高水平(图6B)。在体内实验中,过表达CHMP2B显著加重心肌MI/R 损伤,表现为射血分数和LVFS的减少(图6C)、LDH和CK-MB的上调(图 6D-F),升高的心律失常指数(图6F)。过表达的CHMP2B显著提高了MI/R 损伤小鼠的死亡率。我们还发现，CHMP2B过表达可降低自噬水平，二甲双胍的心脏保护作用可上调CHMP2B处理下的自噬水平。
(7)二甲双胍增强心肌AMPK/Atrogin-1通路，防止MI/R损伤中CHMP2B 的积累
与对照组相比，体内MI/R损伤抑制AMPK磷酸化，降低Atrogin-1水平，但心肌CHMP2B水平缺升高。此外，心肌LC3 II/I和p62在MI/R心脏积聚，表明自噬流受损(图7A)。二甲双胍治疗可显著提高MI/R心脏AMPK磷酸化水平和Atrogin-1水平，有效抑制CHMP2B的积累。这些作用与LC3 II/I和p62 水平的降低有关，这表明自噬水平得到活化(图7A)。在体内，二甲双胍治疗增强了Atrogin-1和CHMP2B在MI/R下心肌的共定位。二甲双胍治疗可抑制心肌收缩功能障碍(图7B-D)，保护心脏免受MI/R损伤(图7D、F)，降低心律失常严重指数(图7F)，并显著降低MI/R损伤小鼠的死亡率。
实施例2二甲双胍片剂的制备
将盐酸二甲双胍与常规辅料混合，按照常规方法制备获得盐酸二甲双胍片剂。口服，成人一次0.25g，一日3次。
实施例3二甲双胍缓释片剂的制备
将盐酸二甲双胍与常规辅料混合，按照常规方法制备获得盐酸二甲双胍缓释片剂。口服，成人一次0.5g，一日1次。
实施例4二甲双胍肠溶片剂的制备
将盐酸二甲双胍与常规辅料混合，按照常规方法制备获得盐酸二甲双胍肠溶片剂。口服，成人一次0.25g，一日3次。
实施例5二甲双胍胶囊剂的制备
将盐酸二甲双胍与常规辅料混合，按照常规方法制备获得盐酸二甲双胍胶囊剂。口服，成人一次0.25g，一日3次。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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