具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供一种青霉素增效减量联合抑菌剂及其制备方法，包括：

1.材料与仪器

化合物1，熊果酸对照品(四川省维克奇生物科技有限公司)；化合物2，齐墩果酸对照品(四川省维克奇生物科技有限公司)；化合物3，芹菜素对照品(四川省维克奇生物科技有限公司)；抗生素，青霉素；菌种，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌；培养基，营养琼脂、MH肉汤；二甲基亚砜溶液，天津市百世化工有限公司；生理盐水，四川科伦药业股份有限公司；氯化三苯四氮唑，天津市化学试剂研究所有限公司；磷酸氢二钠，天津市致远化学试剂有限公司；磷酸二氢钾，天津市致远化学试剂有限公司；电子分析天平，上海越平科学仪器有限公司；超净工作台，天津市泰斯特仪器有限公司；恒温水浴锅，常州市华普达教学仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，LS-35HD江阴滨江公司；超纯水机，型号：WP-UP-Y；高温灭菌箱，型号：DZF-6050；电冰箱，海尔539L；微孔板快速振荡器，其林贝尔科技有限公司；恒温隔水式培养箱，HPX-250湘仪离心机仪器有限公司；不可拆96孔板，德国Greiner公司；牛津杯，北京极泰远成科技有限公司；游标卡尺，上海量具刀具厂。

2.抗菌药物和培养基制备

用电子分析天平称取所需药品6mg，分别配置成初始浓度为1200μg/mL的25％DMSO药物原液，充分摇匀溶解后置于4℃保存，作为供试药液备用。称取本品21.0g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟，备用。将营养琼脂按比例用蒸馏水配制成500ml营养琼脂溶液，恒定温度为121℃，灭菌时间为30min。

3.1％的TTC染色液的配制

取1.973g的磷酸氢二钠和0.436g的磷酸二氢钾，溶于1L去离子水中，充分混合溶解，PH调至6.5-7.5之间，即得到需要的磷酸缓冲溶液。根据所需要的TTC工作液浓度，取1gTTC粉末加入到100ml混合的磷酸盐缓冲溶液中，即得到1％的TTC染色液。将其装入棕色瓶子内，4℃保存备用。

4.菌液的配制

本次实验分别选择革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)作为受试菌种，观察并分析提取物与青霉素联合用药时，对不同菌种产生的抑菌效果是否相同，初步判断是否具有广谱抗生素的抑菌特点。将放于4℃冰箱中冻存的处于休眠期的不同受试菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)置于37℃恒温培养箱中复苏24h后，在超净工作台中用接种环挑取适量菌落于生理盐水中，配制成对数生长期的菌种稀释成1*105cfu/ml的菌液，备用。

5.单药MIC的测定

取无菌96孔板(超净工作台杀菌)，在96孔板每个孔加入MH肉汤培养基90μL。在B/C/D三排(相当于重复对照)加入配好的同一种药液不同浓度各10μL。选取金黄色葡萄球菌为受试菌株，在每一孔中加入稀释好的菌液90μL。E/F/G三排(相当于重复对照)加入另一种药液的不同浓度，做相同处理。在同一块板上的第2列做一排阴性对照(仅加空白肉汤不加菌液)和在第3列做一排阳性对照(仅加菌液不加药液)。操作完成后，在每个孔中滴加10mg/mL(1％)氯化三苯四氮唑(TTC)10μL。将所有加样完成的96孔板置于微孔板快速振荡器上震动15分钟。完毕后置于培养箱内37℃恒温培养18-24h，取出观察结果，有细菌生长孔呈红色，以肉汤清亮无菌生长孔的最低浓度为该药物的MIC。

6.青霉素与其中一种药物联合的抑菌效果测定

根据药物A(青霉素)和药物B(任一提取物)的MIC浓度，通过棋盘稀释法，确定联合用药的稀释度，选择其中的6个浓度配比。37℃孵育18-24h后观察，有细菌生长孔呈红色。筛选出没有细菌生长的浓度配比，置于含有同一细菌的固体培养基中37℃孵育24h后，测量抑菌圈大小，通过与青霉素单独用药作对比，确定最佳组合效应时的浓度。

结果分析：记录单独应用两药的最低抑菌浓度MIC甲药单和MIC乙药单用，并选择最佳组合效应时两药联合时自的MIC甲药联用和MIC乙药联用，以计算FIC指数。利用此方法，将青霉素分别与齐墩果酸、熊果酸、芹菜素进行实验，分别挑选出最佳组合稀释度。FIC＝(A药联合时MIC/A药单测时)+(A药联合时MIC/A药单测时)

表1 FIC指数分析

Table 1 FIC index analysis

7.青霉素与其中两种药物联合的抑菌效果测定

取无菌96孔板(超净工作台杀菌)，按上述操作方法，在对应的孔中分别加入90μL肉汤培养基、90μL菌液、10μL配比好的药液以及10μL的TTC染液。37℃恒温培养18-24h，取出观察结果。挑选出没有细菌生长的浓度比，每个药物组合重复做三次，共三个药物组合。将其置于含有同一细菌的固体培养基中37℃孵育24h后，测量抑菌圈大小，进而确定青霉素与其中两种药物联合的抑菌效果。结果分析：三种药物联合应用MIC大于任意一种单药即为颉颃作用，与其中一种单药MIC相同为无关作用，小于任意一种单药为协同作用。

8.青霉素与三种药物共同联合的抑菌效果测定

分别用青霉素、齐墩果酸、熊果酸和芹菜素的MIC浓度作为最适浓度配制药液，置于含有同一细菌的固体培养基中，对细菌进行37℃观察培养24h后，测量抑菌圈大小，进而确定抑菌效果。

9.实验结果与分析

(1)不同药物对金黄色葡萄球菌的MIC确定

每种药物分别配制1200μg/mL、1000μg/mL、800μg/mL、600μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、90μg/mL、80μg/mL、70μg/mL、60μg/mL、50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、5μg/mL，共17个不同的浓度。通过上述实验操作，最终确定每种药物的MIC值。结果如表2所示。从表中可以看出，不同药物对金黄色葡萄球菌的MIC浓度是不同的。

表2不同药物对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果

Table 2 MIC determination results of different drugs againstStaphylococcus aureus

(2)青霉素与其中一种药物联合的抑菌效果

根据上述结论，采用棋盘稀释法确定两种药物联合用药的稀释度，每种抗菌药物最高浓度是MIC的2倍。药物配比浓度如表3、表4、表5所示。

表3青霉素与齐墩果酸联合用药稀释度

Table 3 Dilution of penicillin and oleanolic acid combination

表4青霉素与熊果酸联合用药稀释度

Table 4 Dilution of penicillin and ursolic acid combination

表5青霉素与芹菜素联合用药稀释度

Table 5 Dilution of penicillin and apigenin combination

通过对表中不同浓度比例进行实验，观察抑菌圈大小，得到青霉素与其中一种药物联合的最适浓度比。当青霉素：齐墩果酸＝5μg/mL:40μg/mL，青霉素：熊果酸＝5μg/mL:100μg/mL，青霉素：芹菜素＝5μg/mL:10μg/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好。根据此浓度比，进一步对大肠杆菌进行抑菌实验操作，对比青霉素与其中一种药物联合用药时对不同菌种抑菌效果的差异，结果如表6所示。

表6两种药物最适浓度联合用药对不同菌种抑菌效果对比

Table 6 Comparison of the antibacterial effect of the combination oftwo drugs at the optimum concentration on different strain

注：^**表示P<0.01，与空白组比较差异极显著；^A表示P<0.01，与药物单独用药比较差异极显著。

从表中可以得知，两种药物联合用药对不同菌种抑菌效果差异均为极显著。通过整体比较，不同药物浓度比对大肠杆菌的抑菌效果更明显一些。青霉素与齐墩果酸、芹菜素联合用药时，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现为相加作用，即两种抗菌药物联合药效与同样浓度两种药物抗菌作用总和保持一致。青霉素与熊果酸联合用药时，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现为无关用，即联合药物时的药物活性与单独用药作用相同，说明青霉素与熊果酸联合用药可能还受其他因素的影响，此现象还需要进一步深层次研究。

(3)青霉素与其中两种药物联合的抑菌效果

青霉素与其中两种药物联合用药，组合方式共三种，分别为：青霉素、芹菜素、齐墩果酸；青霉素、熊果酸、芹菜素和青霉素、熊果酸、齐墩果酸。以青霉素最小用量5μg/mL为基础，其他药物不同用量的组合比例进行抗菌试验。最终得出，当青霉素：芹菜素：齐墩果酸＝5μg/mL:10μg/mL:20μg/mL，青霉素：熊果酸：芹菜素＝5μg/mL:50μg/mL:5μg/mL，青霉素：熊果酸：齐墩果酸＝5μg/mL:100μg/mL:20μg/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好。根据此浓度比，进一步对大肠杆菌进行抑菌实验操作，对比青霉素与其中两种药物联合用药时对不同菌种抑菌效果的差异，结果如表7所示。

表7三种药物最适浓度联合用药对不同菌种抑菌效果对比

Table 7 Comparison of the antibacterial effects of the three drugs incombination with the optimal concentration on different strains

注：^**表示P<0.01，与空白组比较差异极显著；^A表示P<0.01，与药物单独用药比较差异极显著。

从表中可以得知，三种药物联合用药对不同菌种抑菌效果差异均为极显著。通过整体比较，当青霉素与芹菜素、齐墩果酸联合用药以及青霉素、熊果酸、芹菜素联合用药时，对大肠杆菌的抑菌效果比对金黄色葡萄球菌的抑菌效果更明显一些；当青霉素、熊果酸、芹菜素三者联合用药时，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果略显更好。从联合用药指数看，不管哪一种联合用药组合方式，均表现为明显的协同作用，即三种药物联合用药时的MIC浓度均小于每种药物单独用药时的MIC浓度。

(4)青霉素与三种药物共同联合的抑菌效果

通过用青霉素、齐墩果酸、熊果酸和芹菜素的MIC浓度作为最适浓度配制药液，分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行抗菌实验后，得到的结果如表8所示。

表8四种药物MIC浓度联合用药对不同菌种抑菌效果对比

Table 8 Comparison of antibacterial effects of four drugs incombination with MIC concentration on different strains

注：^**表示P<0.01，与空白组比较差异极显著；^A表示P<0.01，与药物单独用药比较差异极显著。

从表中可以得知，四种药物联合用药对不同菌种抑菌效果差异均为极显著。但不同药物浓度比对大肠杆菌的抑菌效果更明显一些。

(5)四种药物单独用药与联合用药对比

表9和表10分别记录了青霉素、熊果酸、齐墩果酸和芹菜素单独用药时的不同浓度对两种不同菌种的抑菌效果。从表中可以看出，每种药物单独用药时浓度越大，抑菌效果越明显。与空白组相比，均表现出极显著差异性，说明所筛选单独用药的浓度均有较好的抑菌效果。

表9 4种药物单独用药时不同浓度对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

Table 9 The antibacterial effects of 4drugs at differentconcentrations on Staphylococcus aureus when used alone

注：**表示P<0.01，差异极显著。

表10 4种药物单独用药时不同浓度对大肠杆菌的抑菌效果

Table 10 The antibacterial effect of 4kinds of drugs in differentconcentrations on E.coli when used alone

注：**表示P<0.01，差异极显著。

针对不同菌种，将单独用药与联合用药时的抑菌圈大小进行比较，得到如图1和图2所示柱状图。从图中可以看出，在选用青霉素最小浓度5μg/mL的前提下，联合用药后的抑菌效果均比四种药物单独用药的抑菌效果明显。针对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)，青霉素与两种药物联合用药的抗菌效果比与其中一种药物联合用药效果相对较好一些。但针对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)，青霉素与熊果酸、齐墩果酸三者共同联合用药的抗菌效果明显差于青霉素与熊果酸、齐墩果酸两者之一联合用药的抗菌效果。通过查阅相关文献，以及结合网络药理学中药物-细菌靶点进行进一步分析，得到如下结论：

熊果酸与齐墩果酸都是三萜类化合物，属于同分异构体(如图3)。吴群等实验结果表明作用机理相同的同一类药物联合用药的疗效有可能并不增强，而可能会增加毒性，或竞争细菌同一靶位，出现颉颃作用。从表11可以发现，两者治疗疾病的药物靶点基本保持一致，针对治疗大肠杆菌，熊果酸与齐墩果酸同时竞争MAPK8、MAPK3、ACE、IL6这4个靶点，因此当青霉素与熊果酸、齐墩果酸三者联合用药时表现为拮抗作用，比青霉素与熊果酸、齐墩果酸两者之一联合用药的抗菌效果差。

表11熊果酸与齐墩果酸药物-细菌靶点分析

Table 11 Analysis of ursolic acid and oleanolic acid drugs-bacterialtargets

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。