具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

本公开的实施例提供了一种抗癌药物，包括2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑或其具有生物电子等排体结构的衍生物，2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑的结构如下式I所示：

本公开中的抗癌药物具有广谱性，对多种癌细胞，如宫颈癌细胞、乳腺癌细胞及对其他药物耐药的耐药细胞都具有杀伤作用。同时，该化合物对正常细胞的杀伤作用低，毒副作用小，相比于其他同类衍生物抗癌效果更佳。细胞膜是一种选择性的功能屏障，对质子及其他离子非常重要，离子梯度可用于二级运输过程，驱动底物的选择性摄取及代谢产物的排出。质子动力势(Δp)由pH梯度(ΔpH)和跨膜电势(Δψ)组成，是细胞的一种能量中间体，可用于驱动溶质运输、ATP合成等过程。质子动力势通过特殊的转运蛋白相互连接，也通过H⁺磷酸电势相连。通过膜的质子或离子的被动通量的增加可能导致Δp(或者钠动力)的降低，这会损害膜在能量转导和从环境中筛选细胞质的正常功能。膜电位分析表明，2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑及其组合物使线粒体膜受损，且组合物对线粒体膜的破坏程度加强，说明其存在耗散质子动力势中跨膜电位的能力。同时2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑及组合物对细胞杀伤效果随着pH值的增加而降低，该化合物也可能存在耗散质子动力势中pH梯度的能力。同时，抗癌药物2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑的溶血性低，在含量达25μg/mL时低于5％，可视为不溶血。2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑分子结构简单，在较低浓度下可杀伤癌细胞，且对正常细胞的杀伤能力较弱，具有选择性和高疗效。相比于传统的抗肿瘤药物，可以无需使用载体即可进行癌症治疗，具有较大的临床应用前景。

本公开的另一实施例提供了一种抗癌药物组合物，包括2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑和苯硼酸类聚合物，药物与苯硼酸的物质的量比范围为2∶1～1∶8，其中苯硼酸类聚合物的结构如下式II所示，其中，m为50～200的整数，n为40～100的整数，

抗癌组合物，其中含有的苯硼酸结构可与2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑的氨基通过供体-受体相互作用的方式连接，这种连接方式对活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)具有响应性，癌细胞内过量活性氧可以选择性释放药物，从而增强抗癌作用，且正常细胞内不存在过量ROS，其在正常细胞内释放能力弱。同时抗癌组合物对线粒体膜电位的破坏能力增强，对pH值的敏感性增强，抗癌效果比2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑更强。

物质的量比是抗癌药物比式II化合物中苯硼酸为2∶1至1∶8之间，苯硼酸类聚合物对2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑的接载率为30％～80％。该聚合物中苯硼酸所在链段为疏水链段，乙二醇所在链段为亲水链段，其在水中会形成胶束结构。本发明中，先使苯硼酸与药物配位，再分散于水中形成胶束。苯硼酸与药物是物质的量比为1∶1配位的，因此在比例为1∶1时效率最高，实施例中也选用1∶1作为比例。

在上述实施例的基础上，抗癌药物组合物的组合方式为苯硼酸类聚合物与2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑中的氨基之间存在特定的配位相互作用。

抗癌药物组合物通过苯硼酸中的硼与2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑中的氮形成硼氮配位，这种配位作用使得该组合物对ROS具有响应性，能有效杀死癌细胞，且对正常细胞毒性小，毒副作用小。

苯硼酸类聚合物中苯硼酸所在链段的聚合度为50～200，乙二醇所在链段的聚合度为40～100。该聚合度范围内的苯硼酸类聚合物可接载较多抗癌药物且不会由于分子量过大引起聚合物难以溶解于水中。

本公开还提供了一种制备基于苯硼酸与氨基配位相互作用的组合物的方法，方法如下：

S1，将2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑和苯硼酸类化合物在有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中反应，得到配位相互作用的结构。

S2，将所得组合物放入水或水与甲醇的共混溶剂中透析掉多余未接上的2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑。

本公开的实施例还提供了一种根据前述抗癌药物组合物，包括2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑和苯硼酸类聚合物，用于预防和治疗癌症的用途。

通过将2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑和辅料苯硼酸类聚合物结合，增强了抗癌作用，并减少了对正常细胞的伤害；同时抗癌组合物对线粒体膜电位的破坏能力增强，对pH值的敏感性增强，抗癌效果比2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑更强。

下面通过具体实施方式对本发明作进一步说明。实施例中使用的试剂购自国药集团化学试剂有限公司及上海碧云天生物技术有限公司，细胞购自中科院上海细胞库。

实施例1

2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑及其与苯硼酸类聚合物的组合物的体外抗癌评价

采用MTT法测体外抗癌效果：取癌细胞(HeLa)加入到96孔板中，在培养箱中孵育24h，每孔加100μL细胞液，每孔接种数量为6×10³至8×10³之间，且每孔接种数量大致相同。将2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑(式I)及组合物配置为0.5mg/mL的浓度，这里得到配位相互作用的结构所用溶剂为DMF，其中抗癌药物组合物中2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑与苯硼酸类聚合物中苯硼酸物质的量之比为1∶1，苯硼酸类聚合物中苯硼酸所在链段的聚合度为100，乙二醇所在链段的聚合度为44。吸取培养基，加入配置好的含不同浓度抗癌药物及组合物的培养基(组合物以其中接入的抗癌药物的含量计算浓度)，抗癌药物浓度为0.5μg/mL至10μg/mL，在培养箱中孵育24h。吸取培养基，每孔加入100μL噻唑蓝(MTT)溶液孵育4小时后，吸取MTT溶液，每孔加入120μL二甲亚砜(DMSO)。用酶联免疫检测仪在490nm下测定光吸收值，根据与对照组(加药步骤中未加抗癌药物及组合物只加培养基)的光吸收值对比，绘制出细胞存活率曲线。同时，在小鼠结肠癌细胞CT26、人乳腺癌细胞MDA-MB-231及小鼠成纤维细胞(正常细胞)L929中进行类似的体外抗肿瘤测试。图1示出了抗癌药物及组合物对各种癌细胞具有显著的细胞毒性作用，且对正常细胞的毒性作用较低，且抗癌药物组合物在较低的浓度下对癌细胞有更强的杀伤作用。此外，用光学显微镜观察用抗癌药物孵育过的细胞，发现当抗癌药物浓度较高时，细胞变圆，发生凋亡，最后成为悬浮的死细胞，说明抗癌药物会改变细胞形态并使其凋亡。

实施例2

2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑的质子动力势相关评价

质子动力势相关实验通过MTT法进行评价。取5个离心管，向内加入10mL带血清的培养基，用1M的盐酸和1M的氢氧化钠调节其pH值，分别调节为5.4、6.4、7.4、8.4、9.4待用。取癌细胞(HeLa)加入到96孔板中，在培养箱中孵育24h，每孔加100μL细胞液，每孔接种数量为6×10³至8×10³之间，且每孔接种数量大致相同。将2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑(式I)配置为0.5mg/mL的浓度。取不同pH值的培养基，分别配置成含不同浓度抗癌药物的培养基，抗癌药物浓度为0.25μg/mL至10μg/mL，吸取原培养基，加入新配置的不同pH值的含抗癌药物的培养基，在培养箱中孵育24h。吸取培养基，每孔加入100μL MTT溶液孵育4小时后，吸取MTT溶液，每孔加入120μL二甲亚砜(DMSO)。用酶联免疫检测仪在490nm下测定光吸收值，根据与对照组(加药步骤中未加抗癌药物只加培养基)的光吸收值对比，绘制出不同pH值下细胞存活率曲线。图2示出了抗癌药物对低pH值毒性大，随着pH值逐渐升高，抗癌药物对细胞的毒性逐渐变小。

实施例3

2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑及组合物的膜电位变化评价

通过线粒体膜电位检测试剂盒JC-1对细胞染色并用荧光显微镜观察颜色变化，对膜电位进行评价，其中试剂盒JC-1购自上海碧云天生物技术有限公司，型号为C2006。取癌细胞(HeLa)加入到24孔板，在培养箱中孵育24h，每孔加400μL细胞液，每孔接种数量为2×10⁴至4×10⁴之间，且每孔接种数量大致相同。吸出原培养基，加入配置的2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑(式I)浓度为10μg/mL的培养基，培养箱中孵育4h。取适量JC-1(200X)，按照每50μL JC-1(200X)加入8mL超纯水的比例稀释JC-1。剧烈涡旋震荡充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mL JC-1染色缓冲液(5X)，混匀后即为JC-1染色工作液。吸取培养基，每孔加入400μL JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。在孵育期间，按照每1mL JC-1染色缓冲液(5X)加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。37℃孵育结束后，吸除上清，JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。加入1mL含血清的培养基，荧光显微镜下观察并在红色和绿色两种通道下拍摄照片(红色通道：λex＝543nm，绿色通道：λex＝488nm)。使用Image J软件计算红绿通道的平均荧光强度，计算得λ_543nm/λ_488nm的比值。线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，产生红色荧光；线粒体膜电位较低时，JC-1不能在线粒体基质聚集，JC-1作为单体，可产生绿色荧光。对于抗癌药物组合物(其中抗癌药物组合物中2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑与苯硼酸类聚合物中苯硼酸物质的量之比为1∶1)进行类似的操作。图3示出了对照组(加药步骤中未加抗癌药物只加培养基)与抗癌药物组和抗癌药物组合物组线粒体膜电位的分析结果。λ_543nm/λ_488nm的比值越小表明膜被破坏的程度越高，跨膜电位降低程度高，Δψ耗散程度高。从分析结果可以看出，组合物对膜电位的破坏作用是最强的。

实施例4

2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑及组合物的溶血评价

抗癌药物及组合物的溶血性通过药物在各个浓度下是否使红细胞破裂进行评价。从ICR小鼠眼眶取1mL左右血液，加入适量PBS混匀，放入离心机中在800r/min下离心3min，弃去上清液，留下下层红细胞。再用PBS反复洗涤两次，至上清液澄清，留下下层红细胞。取0.8mL红细胞加入PBS配置为0.2％红细胞悬浮液。用1mL离心管取900μL红细胞悬浮液，向其中分别加入5μg/mL至50μg/mL的2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑(式I)及组合物(组合物以其中接入的抗癌药物的含量计算浓度)，其中抗癌药物组合物中2-氨基-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫代]-1，3，4-噻二唑与苯硼酸类聚合物中苯硼酸物质的量之比为1∶1，混合均匀后在37℃培养箱中孵育1小时。孵育后，用离心机在800r/min下离心3min，取100μL上清液至96孔板，用酶联免疫检测仪在576nm下测定光吸收值。该实验的对照组为PBS组以及曲拉通组，PBS组为阴性对照，曲拉通组为阳性对照。图4示出抗癌药物及组合物的溶血率，在药物含量为50μg/mL时，溶血率仍低于10％，证明药物不具有溶血性，可以很好的应用于生物体内不会产生溶血方面的影响。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。