一种规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法
阅读说明：本技术 一种规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法 (Screening and culturing method for large-scale preparation of human extracellular matrix ) 是由 沈政 程顺巧 江振华 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法,S1、材料取样：对人体的皮肤表面进行消毒杀菌,从中取样带有细胞经脱处理的皮肤,并对该细胞进行低温的保存,待需要使用时取出；S2、基质分离：利用冷酶交联剂法进行脱细胞处理,本发明涉及细胞培养技术领域。该规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法,通过对细胞外基质的取样,并进行外界的环境模拟试验操作,并进行比对后,不仅在操作的过程中避免细胞或是细胞外基质受到外界的细菌等影响,而且可以使得操作更加的简单化,同时在进行实验后,更能选用出相对性价比较高的环境方案,从而实现了自动规模化的生产制备,而且极大的提高了细胞外基质培养成功的存活率。(The invention discloses a screening and culturing method for preparing human extracellular matrix in large scale, which comprises the following steps of S1: sterilizing the skin surface of a human body, sampling skin with cells subjected to removal treatment, storing the cells at low temperature, and taking out the cells when in use; s2, matrix separation: the invention relates to the technical field of cell culture, and discloses a method for carrying out cell removal treatment by using a cold enzyme cross-linking agent method. According to the screening and culturing method for preparing the human extracellular matrix on a large scale, the extracellular matrix is sampled, external environment simulation test operation is carried out, and after comparison, influence of cells or the extracellular matrix on external bacteria and the like is avoided in the operation process, operation can be simplified, and meanwhile, an environment scheme with higher relative cost performance can be selected after experiment, so that automatic large-scale production and preparation are realized, and the survival rate of successful culture of the extracellular matrix is greatly improved.)
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，具体为一种规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法。
背景技术
多细胞有机体中，细胞周围由多种大分子组成的复杂网络，称作细胞外基质；细胞外基质主要由5类物质组成，即胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖，其在上皮或内皮细胞的基底部者为基底膜，而在细胞间黏附结构者为间质结缔组织，且在胚胎发育或愈伤再生时，上皮细胞正是沿着基底层发展的，由此可知，调节细胞生长、发育的若干信息正是通过胞外基质传递的。
根据专利名称为：一种细胞治疗用临床治疗级表皮干细胞应用人类细胞外基质筛选及规模化培养制备方法，专利公开号为：CN104312970A，其中包括利用三种培养液对细胞进行消化、清洗等处理操作，得到相对应的实验结果，并筛出免疫原性细胞安全获得免疫逃逸，延长移植时间增加组织工程临床应用，促进创面愈合与皮肤疾病提供了绝对优势临床治疗级细胞的解决方案。
但是现有的规模化制备中还存在以下的问题，由于细胞对应的活性不同，无法较长时间的保持细胞对应的活性程度，而且培养的过程中，所受到的外界因素较多，所培养的细胞存活率较低，为此，本发明提供了一种规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法，解决了现有的规模化制备无法保持长时间的细胞活性程度，以及存活率较低的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法，具体包括以下步骤：
S1、材料取样：对人体的皮肤表面进行消毒杀菌，从中取样带有细胞经脱处理的皮肤，并对该细胞进行低温的保存，待需要使用时取出；
S2、基质分离：利用冷酶交联剂法进行脱细胞处理，然后通过细胞的消化、破壁和离心对细胞进行处理，静止一端时间后产生细胞悬液，接着并对细胞悬液进行分离和清洗，从而得到所需的细胞皮内壁下的细胞外基质，将得到的细胞外基质进行储存；
S3、培养试验：从所得到的细胞外基质取出相同容量的9等份，分别放置在对应的9个培养皿中，并对培养皿中加入相同的培养液，利用该培养液进行扩增培养，然后将其放置在不同的环境下进行不同时长的培养，并观察器在培养过程中的变化；
S4、活性检测：在对应的时间完成后的培养皿优先进行检测，通过杀菌消毒后的提取管进行提取，并对提取管中的细胞外基质溶液放入到检测试剂盒中进行检测，得出对应的结果进行比对。
优选的，所述S1中所取用的为人体皮肤的皮肤组织细胞，并将其放置在5摄氏度的储存箱中保存。
优选的，所述S2中冷酶交联剂法是利用利用双功能或多功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，形成共价键连接来制备固定化酶。
优选的，所述S2中利用培养液对该细胞进行细胞的消化的终止，并通过破壁机对细胞进行破壁，对破壁后的细胞利用离心机进行离心处理，离心速度为15Kr/min，需要重复操作2-3次，然后待其静止。
优选的，所述S2中的细胞悬液进行过滤，分为清液和细胞外皮，对细胞外皮进行收集，并将细胞外皮内壁下的细胞外基质提取出来后进行保存。
优选的，所述S3中所取出的9等份细胞外基质均为0.25mg，其中对培养皿加入的培养液均为等份的100ml溶液，进行扩增培养。
优选的，所述S3中所实验的环境分别为：实验环境1：5摄氏度下培养，且培养的时长分别为1h、2h和5h；实验环境2：20摄氏度下培养，且培养的时长分别为1h、2h和5h；实验环境3：37摄氏度下培养，且培养的时长分别为1h、2h和5h。
优选的，所述S4中所采用的提取管通过高温杀菌消毒，且提取管不进行重复使用，同时提取的容量均为5ml进行检测。
有益效果
本发明提供了一种规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法，通过在S1、材料取样：对人体的皮肤表面进行消毒杀菌，从中取样带有细胞经脱处理的皮肤，并对该细胞进行低温的保存，待需要使用时取出；S2、基质分离：利用冷酶交联剂法进行脱细胞处理，然后通过细胞的消化、破壁和离心对细胞进行处理，静止一端时间后产生细胞悬液，接着并对细胞悬液进行分离和清洗，从而得到所需的细胞皮内壁下的细胞外基质，将得到的细胞外基质进行储存；S3、培养试验：从所得到的细胞外基质取出相同容量的9等份，分别放置在对应的9个培养皿中，并对培养皿中加入相同的培养液，利用该培养液进行扩增培养，然后将其放置在不同的环境下进行不同时长的培养，并观察器在培养过程中的变化；S4、活性检测：在对应的时间完成后的培养皿优先进行检测，通过杀菌消毒后的提取管进行提取，并对提取管中的细胞外基质溶液放入到检测试剂盒中进行检测，得出对应的结果进行比对，S1中所取用的为人体皮肤的皮肤组织细胞，并将其放置在5摄氏度的储存箱中保存，S2中冷酶交联剂法是利用利用双功能或多功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，形成共价键连接来制备固定化酶，S2中利用培养液对该细胞进行细胞的消化的终止，并通过破壁机对细胞进行破壁，对破壁后的细胞利用离心机进行离心处理，离心速度为15Kr/min，需要重复操作2-3次，然后待其静止，S2中的细胞悬液进行过滤，分为清液和细胞外皮，对细胞外皮进行收集，并将细胞外皮内壁下的细胞外基质提取出来后进行保存，S3中所取出的9等份细胞外基质均为0.25mg，其中对培养皿加入的培养液均为等份的100ml溶液，进行扩增培养，S3中所实验的环境分别为：实验环境1：5摄氏度下培养，且培养的时长分别为1h、2h和5h；实验环境2：20摄氏度下培养，且培养的时长分别为1h、2h和5h；实验环境3：37摄氏度下培养，且培养的时长分别为1h、2h和5h，S4中所采用的提取管通过高温杀菌消毒，且提取管不进行重复使用，同时提取的容量均为5ml进行检测，通过对细胞外基质的取样，并进行外界的环境模拟试验操作，并进行比对后，不仅在操作的过程中避免细胞或是细胞外基质受到外界的细菌等影响，而且可以使得操作更加的简单化，同时在进行实验后，更能选用出相对性价比较高的环境方案，从而实现了自动规模化的生产制备，而且极大的提高了细胞外基质培养成功的存活率。
附图说明
图1为本发明的培养方法流程图；
图2为本发明的活性检测结果对比表图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：一种规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法，具体包括以下步骤：
S1、材料取样：对人体的皮肤表面进行消毒杀菌，从中取样带有细胞经脱处理的皮肤，并对该细胞进行低温的保存，待需要使用时取出；
S2、基质分离：利用冷酶交联剂法进行脱细胞处理，然后通过细胞的消化、破壁和离心对细胞进行处理，静止一端时间后产生细胞悬液，接着并对细胞悬液进行分离和清洗，从而得到所需的细胞皮内壁下的细胞外基质，将得到的细胞外基质进行储存；
S3、培养试验：从所得到的细胞外基质取出相同容量的9等份，分别放置在对应的9个培养皿中，并对培养皿中加入相同的培养液，利用该培养液进行扩增培养，然后将其放置在不同的环境下进行不同时长的培养，并观察器在培养过程中的变化；
S4、活性检测：在对应的时间完成后的培养皿优先进行检测，通过杀菌消毒后的提取管进行提取，并对提取管中的细胞外基质溶液放入到检测试剂盒中进行检测，得出对应的结果进行比对。
优选的，S1中所取用的为人体皮肤的皮肤组织细胞，并将其放置在5摄氏度的储存箱中保存。
本发明实施例中，S2中冷酶交联剂法是利用利用双功能或多功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，形成共价键连接来制备固定化酶。
本发明实施例中，S2中利用培养液对该细胞进行细胞的消化的终止，并通过破壁机对细胞进行破壁，对破壁后的细胞利用离心机进行离心处理，离心速度为15Kr/min，需要重复操作2-3次，然后待其静止。
本发明实施例中，S2中的细胞悬液进行过滤，分为清液和细胞外皮，对细胞外皮进行收集，并将细胞外皮内壁下的细胞外基质提取出来后进行保存。
本发明实施例中，S3中所取出的9等份细胞外基质均为0.25mg，其中对培养皿加入的培养液均为等份的100ml溶液，进行扩增培养。
本发明实施例中，S3中所实验的环境分别为：实验环境1：5摄氏度下培养，且培养的时长分别为1h、2h和5h；实验环境2：20摄氏度下培养，且培养的时长分别为1h、2h和5h；实验环境3：37摄氏度下培养，且培养的时长分别为1h、2h和5h。
本发明实施例中，S4中所采用的提取管通过高温杀菌消毒，且提取管不进行重复使用，同时提取的容量均为5ml进行检测。
对比实验
采用上述的S3培养实验中，将装有相同培养物的9个培养皿放置在环境温度为5摄氏度、20摄氏度和37摄氏度下分别培养1h、2h和5h，根据最后试剂检测盒检测出的活性指数可以得出，如图2所示，该培养皿中的产物在20摄氏度的温度下培养2h的活性数值最高，因此为最佳的培养方案，且其余的均可培养，相对的活性指数较低。
综上，通过对细胞外基质的取样，并进行外界的环境模拟试验操作，并进行比对后，不仅在操作的过程中避免细胞或是细胞外基质受到外界的细菌等影响，而且可以使得操作更加的简单化，同时在进行实验后，更能选用出相对性价比较高的环境方案，从而实现了自动规模化的生产制备，而且极大的提高了细胞外基质培养成功的存活率。
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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