一种鼠疫菌显色分离培养基的制备方法
阅读说明：本技术 一种鼠疫菌显色分离培养基的制备方法 (Preparation method of plague bacterium chromogenic isolation medium ) 是由 谢辉 田富彰 张雪飞 李君� 马龙 熊浩明 祁芝珍 冯建萍 杨晓艳 赵海红 游培 于 2021-02-09 设计创作，主要内容包括：本申请公开了一种鼠疫菌显色分离培养基的制备方法,包括如下步骤：步骤S1：在基础成分中加入蒸馏水,调节其pH值,再进行高压灭菌处理；步骤S2：待步骤S1中的产物冷却至55℃时,加入抑菌成分,配置成指示性显色培养基。本申请的鼠疫菌显色分离培养基的制备方法,以CIN琼脂为基础,添加抑菌成分,制成指示性显色培养基,获得配制方法简单、配制成本低、分离效率更高的鼠疫菌显色分离培养基。鼠疫菌指示性显色培养基的工作原理是使用适当显色底物,在细菌特异性酶的作用下,发色基团游离并附着于菌落上,使菌显示一定的颜色。(The application discloses a preparation method of a plague bacteria chromogenic isolation medium, which comprises the following steps: step S1: adding distilled water into the basic component, adjusting pH, and autoclaving; step S2: and (4) when the product in the step S1 is cooled to 55 ℃, adding bacteriostatic components to prepare an indicative chromogenic culture medium. According to the preparation method of the plague bacteria chromogenic isolation medium, the CIN agar is used as a base, the bacteriostatic component is added to prepare the indicative chromogenic culture medium, and the plague bacteria chromogenic isolation medium which is simple in preparation method, low in preparation cost and higher in separation efficiency is obtained. The operation principle of the indicative chromogenic culture medium for the plague bacteria is that a proper chromogenic substrate is used, and under the action of bacteria specific enzyme, chromogenic groups are dissociated and attached to bacterial colonies, so that the bacteria display certain color.)
技术领域
本申请涉及培养基技术领域，特别是涉及一种鼠疫菌显色分离培养基的制备方法。
背景技术
目前，鼠疫菌检测已有多种分子生物学方法和免疫方法，但传统的鼠疫细菌学方法仍然是鼠疫检测的“金标准”，鼠疫菌的分离培养在鼠疫防治工作中占有十分重要的地位，如果被检材料含菌量少，腐败严重，或含有鼠疫噬菌体，仅靠普通琼脂分离鼠疫菌是非常困难的，需采用选择敏感培养基同时也必须靠专业人员丰富经验才能挑选出可疑菌落，比较传统的选择敏感培养基均是在培养基成分中加入能抑制其它杂菌生长，又能促进鼠疫菌发育的物质，比如龙胆紫培养基、胆碲铜紫培养基等，这些培养基可以抑制腐败材料中的变形杆菌和大肠杆菌，但是鼠疫菌菌落很不典型，对鼠疫菌的分离仍然有影响。
显色培养基自1974年法国CHROMagar公司研发以来，因其准确性、敏感性和特异性高而被广泛应用。该培养基是使用培养法对微生物进行检验的重要工具，国外研制的耶尔森菌选择性培养基(CIN琼脂)被ISO委员会推荐使用，但因其价格昂贵，有时断货，在鼠疫疫情应急时不能及时供应，因此不能作为常规培养基应用。因此，需要研究一种适合鼠疫疫情应急时制作方便、供给无障碍、鼠疫菌易于分离筛选的显色培养基。
发明内容
本申请的目的在于克服上述问题或者至少部分地解决或缓减解决上述问题。
根据本申请的一个方面，提供了一种鼠疫菌显色分离培养基的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：在基础成分中加入蒸馏水，调节其pH值，再进行高压灭菌处理；
步骤S2：待步骤S1中的产物冷却至55℃时，加入抑菌成分，配置成指示性显色培养基。
可选地，所述步骤S2中，所述抑菌成分为0.5％～1.5％胆盐。
可选地，所述步骤S2中，所述抑菌成分为1％胆盐。
可选地，所述步骤S1中，基础成分包括如下组分：
蛋白胨20g，酵母菌2g，甘露醇12g，K2HPO42g，NaCl 1g，亚硫酸钠0.25g，中性红0.03g，结晶紫0.001g，琼脂15g，赫氏消化液200ml，去氧胆酸0.36g。
可选地，所述步骤S2中，所述抑菌成分为1g胆。
可选地，所述步骤S1中，加入的蒸馏水的体积为1000ml。
可选地，所述步骤S1中，所调节的pH值为7.0～7.4。
可选地，所述步骤S1中，所述高压灭菌处理的压力为0.15MP，温度为121℃，时间为30min。
可选地，所述步骤S1中所采用的赫氏消化液的制备方法如下：
取自来水5000ml加入搅碎去脂腱牛肉3000g,煮沸30min，待冷却至56℃加入猪胰脏250g,无水碳酸钠50-60g,充分混匀矫正PH值为7.8，加入氯仿80-100ml，扎紧瓶口，置于37振荡温箱内消化7-9日，测氨基氮达到500-800mg/L即可。
本申请的鼠疫菌显色分离培养基的制备方法，以CIN琼脂为基础，添加抑菌成分，制成指示性显色培养基，获得配制方法简单、配制成本低、分离效率更高的鼠疫菌显色分离培养基。鼠疫菌指示性显色培养基的工作原理是使用适当显色底物，在细菌特异性酶的作用下，发色基团游离并附着于菌落上，使菌显示一定的颜色。
根据下文对本申请的具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本申请的上述以及其他目的、优点和特征。
具体实施方式
本申请实施例中所采用的实验菌株，耶尔森氏菌属的鼠疫菌(EV菌株)、假结核杆菌、小肠结肠炎杆菌以及常见致病菌的变形杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、A群链球菌均由青海地方病预防预制所鼠疫菌株专业菌库提供。
本申请实施例中所采用的培养基原料，蛋白胨、酵母菌、K2HPO4、甘露醇、NaCI、亚硫酸钠、中性红、结晶紫、琼脂、胆盐、去氧胆酸、氯霉素购于青岛中创生物科技有限公司提供；赫氏消化液为自制。
实施例1：显色培养基制备
蛋白胨80g，酵母菌8g，甘露醇48g，K2HPO48g，NaCl 4g，亚硫酸钠1g，中性红0.12g，结晶紫0.004g，琼脂60g，赫氏消化液800ml，去氧胆酸1.44g。
将以上的组分混合均匀，再加入蒸馏水1000ml，调节pH值至7.4，进行高压灭菌(121℃，30min)，冷却至55℃；
将上述的产物平均分成4等份，再分别加入1g胆盐、2g胆盐、2.5g氯霉素和0.5g氯霉素，分别制成1％胆盐显色培养基、2％胆盐显色培养基、2.5％氯霉素显色培养基和0.5％氯霉素显色培养基。
实施例2：显色培养基的特异性检测
采用平板计数法计算鼠疫菌菌落，将鼠疫耶尔森菌(EV)、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和变形杆菌、分别制备成1麦氏单位/ml菌悬液，各取0.1ml分别接种于1％胆盐显色培养基、2％胆盐显色培养基、2.5％氯霉素显色培养基、0.5％氯霉素显色培养基以及1％溶血赫氏培养基(对照培养基)，用L棒涂匀，置28℃温箱24h培养观察菌落生长情况和菌落特征。
观察被试菌株在4种显色培养基和1％溶血赫氏培养基上的生长情况，鼠疫菌、假结核菌及小肠结肠炎菌在0.5％氯霉素显色培养基和1％胆盐显色培养基均有较好的显色效果，菌落呈玫红色，结果见表1。其中，“—”表示不生长，1组、3组、4组同5组分别比较P＜0.05，有显著性差异；2组同5组比较P＞0.05，没有显著性差异。
表1鼠疫菌在各显色培养基生长观察
由表1可以看出，被试菌株除变形杆菌外在2％胆盐显色培养基和2.5％氯霉素显色培养基上均不生长；在0.5％氯霉素显色培养基上鼠疫菌生长呈玫红色小菌落，培养48h菌落直径小于≤1mm，生长缓慢，发育不良菌落形态不典型，其它耶尔森菌属的小肠结肠炎杆菌和假结核菌菌落呈红色，生长不良，菌小且数量少，金黄色葡萄球菌不生长，大肠杆菌生长良好，菌落颜色为黄色，变形杆菌呈单个菌落，无弥漫性生长，菌落颜色为淡黄色；2.1鼠疫菌在1％胆盐指示性培养基生长良好，培养16h即可见典型成熟菌落，与赫氏培养基相比鼠疫菌菌落计数没有统计学差异，菌落呈玫红色，镜下观察可见典型鼠疫菌菌落形态，表面粗糙，中心红色，周边有透明的花边，假结核菌及小肠结肠炎菌生长发育良好，菌落颜色为红色，大肠杆菌生长不受抑制，菌落颜色为黄色，金黄色葡萄球菌和变形杆菌生长受抑制，变形杆菌呈单个黄色菌落，无弥漫性生长。
实施例3：显色培养基的敏感度检测
将实施例2中已制备好的鼠疫菌悬液原液依次进行10倍稀释，分别取10-4、10-5、10-6、和10-7稀释度菌液各1ml，用移液器吸取0.1ml菌液，分别涂布于各显色培养基，于28℃培养24-48h计数并观察鼠疫菌在不同培养基上生长情况，确定检测结果。赫氏培养基作为对照，试验重复3次。
不同浓度的菌液涂布各显色培养基结果如表2，菌落计数结果显示，10-6菌落计数结果显示，1％胆盐显色培养基鼠疫菌有少量细菌生长，其他3种显色培养基无细菌生长，而与赫氏培养基无统计学差异(t＝1.569,P>0.05)，证明1％胆盐显色培养基敏感度较高。
表2 5种培养基检测的敏感度试验结果
实施例4：鼠疫菌分离试验
将EV菌与常见致病菌大肠艾希氏菌、变形杆菌及金黄色葡萄球菌等量混合取0.1ml加入5种培养基，置于28℃温箱培养24h观察菌落生长，分离鼠疫菌并作鼠疫噬菌体裂解试验验证，同时以赫氏培养基作为对照，重复检测3次。
将所有试验菌株混合后取0.1ml加入4种培养基，培养24、48h观察被试菌株的生长情况及鼠疫菌分离效果。2.5％氯霉素显色培养基和2％胆盐显色培养基抑制鼠疫菌的生长，不能作为适合鼠疫菌分离的显色选择培养基，0.5％氯霉素显色培养基可以抑制变形杆菌的弥漫性生长，对金黄色葡萄球菌也有抑制作用，对大肠杆菌无抑制作用，鼠疫菌生长缓慢，48h仍是初级菌落形态，72h后极小的鼠疫菌被生长良好的大肠杆菌覆盖，无法挑选分离；1％胆盐显色培养基变形杆菌弥漫性生长被抑制，呈单个菌落，金黄色葡萄球菌在该培养基不生长，大肠杆菌菌落为黄色，而耶尔森菌属中的鼠疫菌、假结核菌及小肠结肠炎菌菌落呈玫红色，在1％胆盐显色培养基生长发育良好，极易被分离，挑选可疑菌落行鼠疫噬菌体裂解验证试验，测试菌株在对照培养基上生长均良好，鼠疫菌不易挑选。
本申请实施例1中所制备的4种鼠疫菌显色培养基，基本营养成分参考CIN琼脂配方中的基础成分，加入赫氏营养液刺激鼠疫菌生长，同时选取不同抑菌剂，通过观察鼠疫菌和杂菌在不同抑菌剂和不同抑菌浓度的菌落数，筛选出鼠疫菌生长良好，杂菌被尽可能抑制的理想培养基。
在氯霉素显色培养基上观察到试验菌株均被抑制，氯霉素是广谱抗生素，可以抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，通过实验观察到，鼠疫菌在氯霉素显色培养基不生长，这是由于氯霉素与结晶紫联合应用抑制鼠疫菌生长，因此氯霉素显色培养基不适合鼠疫菌分离培养。
由于一定浓度胆盐具有高度选择性，即对于肠杆菌科的细菌没有抑制作用而对其它常见致病菌有抑制作用，因此将不同浓度胆盐作为抑菌成分，分成2种不同浓度制备成显色培养基，实验结果表明，金黄色葡萄球菌在2％胆盐显色培养基上不生长，鼠疫菌生长缓慢，这是由于胆盐浓度过高对鼠疫菌有一定抑制作用，菌落48h依然呈初级生长形态，1％胆盐显色培养基鼠疫菌生长良好，统计学分析与赫氏培养基无显著性差异(p>0.05)，16-24h菌落直径1.4mm-2.5mm呈玫红色，镜下可见菌落表面粗糙，周边有玫红色透明花边，呈典型鼠疫菌菌落特征，虽然大肠杆菌在该培养基上生长良好，但菌落颜色为淡黄色，与鼠疫菌极易区分，变形杆菌生长为单个菌落，无弥漫性生长，不影响鼠疫菌的分离培养，因此1％胆盐显色培养基具有较强的特异性及选择性。而且，实施例3的培养基敏感性试验结果也表明1％胆盐显色培养基敏感度高，在菌液稀释度10-6有菌生长。
综上，实验结果证明1％胆盐显色培养基鼠疫菌具有显色效果良好，比赫氏培养基具有较高的检测效率，结果易于观察，特异性强，敏感度高，较为经济等特点，分离时间较短，可提高鼠疫菌的检出率，非常适合鼠疫疫源地现场检验和监测时大批使用。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本申请所属领域技术人员所理解的通常意义。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
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