具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料和试剂

细胞：人结肠癌HCT-116细胞(中国科学院细胞库)。

药品：伊立替康(Irinotecan，CPT-11，CAS No.:97682-44-5)、盐酸伐地那非(Vardenafil，Vard，CAS No.:330808-88-3)、利拉利汀(Linagliptin，Linag，CAS No.:668270-12-0)，均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

试剂：DMEM高糖培养基(Gibco，美国)；FBS(Gibco，美国)；青霉素-链霉素(Hyclone，美国)；0.25％胰酶-EDTA溶液(博士德，中国)；PBS(博士德，中国)；DMSO(Sigma-Aldrich，美国)；MTT(碧云天，中国)。

耗材：10cm细胞培养皿(SORFA，中国)；15、50mL离心管(JET BIOFIL，中国)；细胞冻存管(Corning，美国)；96孔细胞培养板(SORFA，中国)。

仪器设备：2.5、10、100和1000μL移液枪(Eppendorf，德国)；生物安全柜(Thermo，美国)；CO₂细胞培养箱(Thermo，美国)；XD202倒置生物显微镜(南京江南永新光学有限公司，中国)；HW-12型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司，中国)；IC1000自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司，中国)；TDL-50B型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂，中国)；涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，中国)；微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器有限公司，中国)；多功能酶标仪(Tecan Infinite M200Pro，瑞士)；YCD-EL260型医用冷藏冷冻箱(中科美菱低温科技股份有限公司，中国)。

二、实验方法

1、Vard联合CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用

取对数生长期的HCT-116细胞，以0.25％胰酶消化后收集细胞，调节细胞悬液浓度为6×10⁷cells/L，按每孔100μL接种于96孔板中，即每孔接种细胞数约6×10³个。实验设空白组、对照组、15μM Vard组、四个浓度CPT-11(2.5、5、10和20μM)组以及15μM Vard分别与四个浓度CPT-11(2.5、5、10和20μM)联合给药组，每组设3个复孔，考察Vard联合CPT-11给药对HCT-116细胞增殖的抑制作用。细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜后，空白组和对照组更换新鲜完全培养基、给药组更换含不同浓度各药物的新鲜完全培养基，继续培养48h。孵育结束后按照MTT法测定各组的细胞生长抑制率，具体方法为每孔加入20μLMTT(5mg/mL)溶液，继续培养。4h后吸弃孔内液体，每孔加入100μL DMSO，然后置于微孔板振荡器上低速震荡10min。于490nm波长下测定各孔的吸光度(optical density,OD)值。按以下公式计算各组细胞的生长抑制率：细胞生长抑制率＝[1–(OD_给药组–OD_空白组)/(OD_对照组–OD_空白组)]×100％。实验重复三次。

2、Linag联合CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用

取对数生长期的HCT-116细胞，以0.25％胰酶消化后收集细胞，调节细胞悬液浓度为6×10⁷cells/L，按每孔100μL接种于96孔板中，即每孔接种细胞数约6×10³个。设置空白组、对照组、15μM Linag组、四个浓度CPT-11(2.5、5、10和20μM)组以及15μM Linag分别与四个浓度CPT-11(2.5、5、10和20μM)联合给药组，每组设3个复孔，考察Linag联合CPT-11给药对HCT-116细胞增殖的抑制作用。细胞于37℃、5％CO₂培养箱培养过夜后，空白组和对照组更换新鲜完全培养基，给药组更换含各浓度不同药物的新鲜完全培养基，继续培养48h。孵育结束后按照MTT法测定各组的细胞生长抑制率，具体方法为每孔加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，继续培养。4h后吸弃孔内液体，每孔加入100μLDMSO，然后置于微孔板振荡器上低速震荡10min。于490nm波长下测定各孔的OD值。按以下公式计算各组细胞的生长抑制率：细胞生长抑制率＝[1–(OD_给药组–OD_空白组)/(OD_对照组–OD_空白组)]×100％。实验重复三次。

3、Vard+Linag组合联合CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用

取对数生长期的HCT-116细胞，以0.25％胰酶消化后收集细胞，调节细胞悬液浓度为6×10⁷cells/L，按每孔100μL接种于96孔板中，即每孔接种细胞数约6×10³个。设置空白组、对照组、(15μM Vard+15μM Linag)组、四个浓度CPT-11(2.5、5、10和20μM)组和(15μMVard+15μM Linag)分别与四个浓度CPT-11(2.5、5、10和20μM)联合给药组，每组设3个复孔，考察(Vard+Linag)联合CPT-11给药对HCT-116细胞增殖的抑制作用。细胞于37℃、5％CO₂培养箱培养过夜后，空白组和对照组更换新鲜完全培养基，给药组更换含各浓度不同药物的新鲜完全培养基，继续培养48h。孵育结束后按照MTT法测定各组的细胞生长抑制率，具体方法为每孔加入20μLMTT(5mg/mL)溶液，继续培养。4h后吸弃孔内液体，每孔加入100μL DMSO，然后置于微孔板振荡器上低速震荡10min。于490nm波长下测定各孔的OD值。按以下公式计算各组细胞的生长抑制率：细胞生长抑制率＝[1–(OD_给药组–OD_空白组)/(OD_对照组–OD_空白组)]×100％。实验重复三次。

采用Graphpad Prism 7.0软件对实验数据进行处理，实验结果表示为mean±SD。两独立样本之间比较采用双侧非配对t检验统计显著性差异，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

根据抑制率金正均q值来判断各药物与CPT-11联合使用的效果；q＝E_a+b/(E_a+E_b-E_a×E_b)，E_a和E_b分别为两种药物单用的抑制率，E_a+b为联合用药的抑制率；公式中分子代表“实测合并效应”，分母为“期望合并效应”；q＜0.85为拮抗效应，0.85≤q＜1.15为相加效应，q≥1.15为协同效应。

三、实验结果

1、Vard联合CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用

结果显示(表1)，15μM Vard与CPT-11联用没有增强各浓度CPT-11抑制HCT-116的细胞增殖。同时15μM Vard与各浓度CPT-11联用后的q值在0.85～1.15之间，表现为相加效应，说明Vard与CPT-11联用对HCT-116细胞增殖的抑制是相加作用。

表1 15μM Vard联合CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用(n＝3)

2、Linag联合CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用

结果显示(表2)，15μM Linag与CPT-11联用，仅显著增强了20μM CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用。15μM Linag与2.5μM CPT-11联用，q值为0.76，表现为拮抗作用；15μMLinag与5、10和20μM的CPT-11联用，q值均在0.85～1.15之间，表现为相加效应。说明Linag与CPT-11联用对HCT-116细胞增殖的抑制是拮抗或加和作用。

表2 15μM Linag联合CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用(n＝3)

注：与相应CPT-11组相比，^*P≤0.05。

3、Vard+Linag组合联合CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用

结果显示(表3)，(15μM Vard+15μM Linag)与CPT-11联用显著增强了各浓度CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用。同时(15μM Vard+15μM Linag)与2.5、5、10和20μM CPT-11联用，q值分别为1.39、1.40、1.30和1.25，表现为协同效应。说明(Vard+Linag)与CPT-11联用对HCT-116细胞增殖的抑制是协同作用。

表3(15μM Vard+15μM Linag)联合CPT-11对HCT-116细胞增殖的抑制作用(n＝3)

注：与相应CPT-11组相比，^**P≤0.01，^***P≤0.001。

综上，Vard、Linag分别于与CPT-11联用没有协同作用，而(Vard+Linag)组合物与CPT-11联用具有协同效果，能够协同增强CPT-11抑制HCT-116细胞增殖的作用。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。