一种Pyrophen化合物的制备方法
阅读说明：本技术 一种Pyrophen化合物的制备方法 (Preparation method of Pyrophen compound ) 是由 杨晓艳 梁应忠 娄灯吉 牛婉蓉 郭敏 邵林娇 李银飞 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种Pyrophen化合物的制备方法,取滑菇(Pholiota nameko)菌种,采用液体培养基制备种子液,通过固体发酵进行扩大发酵,发酵产物用乙酸乙酯萃取3次,所得萃取液浓缩得浸膏,浸膏经RP-18柱层析、硅胶柱层析和Sephedex LH-20柱层析采用不同的溶剂进行洗脱分离,得Pyrophen化合物；本发明从大型真菌滑菇发酵液中提取该化合物,该化合物及其药物组合物在制备治疗和预防肿瘤及致病菌感染药物方面的应用。(The invention discloses a preparation method of a Pyrophen compound, which comprises the steps of taking Pholiota nameko (Pholiota nameko) strains, preparing seed liquid by adopting a liquid culture medium, carrying out expanded fermentation through solid fermentation, extracting a fermentation product for 3 times by using ethyl acetate, concentrating an obtained extract liquid to obtain an extract, carrying out elution separation on the extract through RP-18 column chromatography, silica gel column chromatography and Sephedex LH-20 column chromatography by adopting different solvents to obtain the Pyrophen compound; the compound is extracted from the fermentation liquor of the large-scale fungus pholiota nameko, and the application of the compound and the pharmaceutical composition thereof in the preparation of the medicines for treating and preventing tumors and pathogenic bacteria infection.)
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体地，涉及一种Pyrophen化合物的制备方法。
背景技术
真菌存在于种类各异的生态环境中，其结构和功能在长期的进化过程中得以选择和优化，能够产生一系列结构独特的天然产物，这些产物不仅能起到机体防御和生理调节的作用，也对人类健康做出了重要贡献。滑菇(Pholiota nameko)是一种可食用的大型真菌，属于真菌门、担子菌纲、鳞伞属。它不仅味道鲜美，还含有丰富的营养物质，目前已经实现了人工栽培，是世界上五大宗人工栽培的优质食用菌之一。滑菇虽然来源广泛、获取方便，但是国内外学者对其研究仅局限于菌丝的生物学特性、深层培养、人工栽培、多糖及蛋白的提取纯化及活性研究等，尚未见其他学者对其次级代谢产物进行研究。所以从滑菇中寻找结构复杂、活性显著的天然产物对药物的发现具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种Pyrophen化合物的制备方法，取滑菇(Pholiota nameko)菌种，采用液体培养基制备种子液，通过固体发酵进行扩大发酵，发酵产物用乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液浓缩得浸膏，浸膏经RP-18柱层析、硅胶柱层析和Sephedex LH-20柱层析采用不同的溶剂及梯度进行洗脱分离，得Pyrophen化合物。
所述滑菇(Pholiota nameko)菌种购买自北纳生物，北纳生物隶属于北京北纳创联生物技术研究院。
所述培养基为PD培养基或GP培养基。
所述扩大发酵的发酵条件为：培养基为水和大米按照体积质量比mL:g为水:大米＝2.6:1的比例配置，在121℃高温灭菌30min，待冷却后接入滑菇种子液，室温静置培养60天。
所述RP-18柱层析所用洗脱剂为甲醇/水溶液，其中甲醇和水的体积比为1:1～9:1。
所述硅胶柱层析所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯溶液，其中石油醚和乙酸乙酯的体积比为15:1～1:1。
所述Sephedex LH-20柱层析所用洗脱剂为二氯甲烷/甲醇溶液，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1。
本发明还提供所述Pyrophen化合物在制备抗肿瘤及抗菌药物中的应用。
本发明化合物用制备药物时，可以直接使用或者以药物组合物的形式使用，该药物组合物含有0.1～99.0％，优选0.5～90.0％的本发明Pyrophen化合物，其余为药学上可以接受的盐，或对人和动物无毒的可药用载体和/或赋形剂，所述的赋形剂包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。
作为口服药物使用时，可用其固体或液体制剂，如粉剂、片剂、糖衣剂、胶囊、溶液、糖浆、滴丸等。
作为注射药物使用时，可用其固体或液体制剂，如粉针剂、溶液形注射剂等。
本发明滑菇是微生物中的一种大型真菌，目前已实现了菌种分离鉴定及大规模人工栽培，具有比较高的营养价值和药用价值，从中分离得到的化合物Pyrophen对抑制乳腺癌等肿瘤细胞及抗菌方面有比较好的疗效。
本发明化合物来自于高等真菌发酵产物，天然安全，毒副作用小，本发明化合物Pyrophen可以转化药学上可接受的盐或衍生物，如酯、醚和其他衍生物，具体方法可用药物常规制备方法所得。
附图说明
图1为Pyrophen化合物的EI-MS图；
图2为Pyrophen化合物的1H NMR图；
图3为Pyrophen化合物的13C NMR图；
图4为Pyrophen化合物的a轴方向的晶胞堆积投影图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的实质，下面将结合具体实施例来进一步说明本发明。实施例中所使用的药品均可以在市场购买得到，或者通过常规方法制备得到。
实施例1
一种Pyrophen化合物的制备方法，具体步骤如下：
滑菇(Pholiota nameko)菌种购自国家标准品网，生产商为：北纳生物，北纳生物隶属于北京北纳创联生物技术研究院，该菌种采用PB培养基制作种子液，恒温24℃，转速150rpm，摇床培养5天后，将种子液置于固体培养基中进行扩大培养(种子液是按照种子液的体积(mL)是培养基质量(mg)的10％左右接入)，固体培养基是将大米和水按照体积质量比mL:g为2.6:1混合，经121℃、30min高温灭菌得到，培养基接菌后室温静置培养60天，得发酵产物，发酵产物用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，经旋转蒸发仪浓缩得浸膏，浸膏依次经RP-18柱层析(洗脱剂为甲醇/水溶液，甲醇和水的体积比为5:5、6:4、7:3、8:2、9:1梯度洗脱)、硅胶柱层析(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯溶液，石油醚和乙酸乙酯的体积比为15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱)和Sephedex LH-20柱层析(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇溶液，二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1)进行洗脱分离，得到产物样品。
实施例2
实施例1方法中制备的产物化学结构式基于其红外、旋光、质谱、核磁共振、单晶等谱图数据进行分析，具体如下：
图1为Pyrophen化合物的EI-MS图，质谱数据：EI-MS(positive)m/z 288，分子式为C16H18NO4；
红外光谱数据：IR(KBr)νmax 2927，2854，1697，1651，1568，1455，1413，1249，1145，1032，942，827cm-1；
旋光数据：[α]24.7 D-7.1(c 0.11，MeOH)；
图2为Pyrophen化合物的1H NMR图和图3为Pyrophen化合物的13C NMR图，具体的核磁数据见表1：
表1：NMRspectraldatafor Pyrophen(1)in CDCl3
图4为Pyrophen化合物的a轴方向的晶胞堆积投影图；根据：Crystal data forcu_lpn3_0m:C16H17NO4，M＝287.30，α＝90°，β＝90°，γ＝90°，T＝100(2)K，space group P212121，Z＝4，μ(CuKα)＝0.793mm-1，8324reflections measured，2580independent reflections(Rint＝0.0348).The final R1 values were 0.0311(I＞2σ(I)).The final wR(F2)values were0.0853(I＞2σ(I)).The final R1 values were 0.0314(all data).The final wR(F2)values were 0.0857(all data).The goodness of fit on F2 was 1.071.Flackparameter＝-0.09(5)。
确定产物的单晶结构为下式Ⅰ：
最后确定产物化学结构式为下式Ⅱ所示，即为Pyrophen化合物：
实施例3
实施例1制备得到的Pyrophen化合物抗肿瘤活性测试：
采用MTT法检测Pyrophen化合物对四种肿瘤细胞活性的影响，四株细胞株分别为hepatocellular carcinoma SMMC-7721、lung cancer A-549 cells、breast cancer MCF-7和colon cancer SW480 cell lines。
实验方法：用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000-10000个细胞接种到96孔板，贴壁细胞提前12小时接种培养，加入Pyrophen化合物溶液(以40μM浓度进行初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50％附近的Pyrophen化合物设10、30、50、70、90μM 5个浓度进入梯度复筛)，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔，37℃培养48h后，每孔加MTT溶液20μL，继续孵育4h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加200μL的DMSO，37℃过夜孵育，酶联免疫检测仪于490nm波长下，读取各孔吸收值，计算Pyrophen的抑制率，结果显示化合物对乳腺癌细胞MCF-7有较好的抑制活性，其IC50为38μM。
实施例4
实施例1制备得到的Pyrophen化合物抗病原菌活性测试：
采用滤纸片法对Pyrophen化合物进行四种病原菌抑菌试验，四种测试菌株分别为：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC(B)26003)、铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CMCC(B)10104)、白色念珠菌(Monilia albican CMCC(F)98001)和大肠埃希菌(Escherichia coli CMCC(B)44102)。
实验步骤如下：
(1)活化菌种：先将四种病原菌从-80℃的冰箱中取出，在超净工作台中，烧红接种环，降温后用接种环在LB或YPD固体培养基上采用“三线法”划线，置于37℃生化培养箱中正置培养，培养1h；
(2)制备菌悬液：菌株活化后在超净工作台中无菌操作加入PBS缓冲液于斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入无菌试管中轻轻摇匀，再根据试验需求将菌悬液稀释制成不同浓度的菌悬液(本实验浓度为108、106、104CFU/mL)；
(3)活性测试：在灭完菌的培养皿中倒入菌悬液，制备成含菌平板，Pyrophen化合物用DMSO溶解，共设3个浓度，分别为0.5、1.0、2.0mg/mL，滤纸片分别放入不同Pyrophen溶液中浸泡2h，在无菌环境下晾干后贴到含菌平板中，每种处理均设3个重复试验，然后放于37℃生化培养箱中正置培养，培养16h～18h观察抑菌结果，测量抑菌圈时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌圈进行测量，测量其直径应以抑菌圈外沿为界，用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录，滤纸片法进行活性初筛后，对有抑菌活性的致病菌再采用96孔板微量稀释法测定其最小抑菌浓度。
结果发现Pyrophen化合物对致病真菌白色念珠菌和致病细菌大肠埃希菌有一定的抑制活性，其最小抑菌浓度(MIC)分别为85μg/mL和79μg/mL。
实施例1制得的化合物Pyrophen按常规胶囊制剂方法制成胶囊服用。
实施例1制得的化合物Pyrophen按化合物与赋形剂重量比1:2～1:4的比例加入赋形剂，制粒压片服用。