血浆中尼古丁和可替宁的前处理方法、前处理试剂盒及检测方法
阅读说明：本技术 血浆中尼古丁和可替宁的前处理方法、前处理试剂盒及检测方法 (Pretreatment method, pretreatment kit and detection method for nicotine and cotinine in blood plasma ) 是由 林广沅 张丹 程朝柱 陈高明 胡玉梅 于 2021-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供了血浆中尼古丁和可替宁的前处理方法、前处理试剂盒及检测方法,其中,血浆中尼古丁和可替宁的前处理方法,使用混合型阳离子交换柱对血浆进行前处理,并通过各步骤中溶液的组合,使得最终获得的洗脱液中含有更少量杂质的同时又能保持尼古丁和可替宁的高回收率,从而可以满足后续检测,特别是LC-MS/MS的需要,通过LC-MS/MS检测发现该方法获得的尼古丁和可替宁具有更好的精密度及更低的检出限,同时回收率＞88%,可以满足高精度的LC-MS/MS检测的需要。(The invention provides a pretreatment method, a pretreatment kit and a detection method for nicotine and cotinine in blood plasma, wherein the pretreatment method for nicotine and cotinine in blood plasma uses a mixed type cation exchange column to pretreat blood plasma, and the combination of solutions in each step enables the finally obtained eluent to contain a smaller amount of impurities and keep the high recovery rate of nicotine and cotinine, so that the requirements of subsequent detection, particularly LC-MS/MS, can be met, and the detection of LC-MS/MS finds that the nicotine and cotinine obtained by the method have better precision and lower detection limit, and the recovery rate is more than 88%, so that the requirement of high-precision LC-MS/MS detection can be met.)
技术领域
本发明涉及医学检验领域，尤其涉及血浆中尼古丁和可替宁的前处理方法、前处理试剂盒及检测方法。
背景技术
长期吸食烟草，会增加患许多疾病的风险，包括肺癌、慢性阻塞性肺病、中风、心脏病和呼吸系统感染等。目前吸烟与健康已成为世界最受关注的公共卫生问题之一，科学准确测量烟草暴露是研究烟草暴露与健康相关性的基础。尼古丁及其代谢物可替宁是评价烟草暴露的关键生物标记物，通过对尿液、血液、唾液和头发等生物材料中的尼古丁和可替宁的测定，能够评估人体吸烟行为、戒烟情况以及环境烟气的暴露程度和剂量。
尼古丁和可替宁的检测方法包括液相色谱(LC)法、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)、超临界流体色谱(SFC)法、气相色谱-质谱联用法(GC-MS/MS)法、毛细管电泳(CE)法等，而液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)具有快速、灵敏、重现性好、通量高等优点，被广泛应用于尼古丁和可替宁的检测。现有技术检测尼古丁和可替宁大都采用LC-MS/MS针对尿液及唾液样本，很少涉及血浆样本。这是因为血浆样本组成复杂，对前处理要求更高。血浆中除含有大量水分以外，还有无机盐、纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、酶、激素、各种营养物质、代谢产物和激素等组分，如1L血浆中含有900～910g水（90%～91%），65～85g蛋白质（6.5%～8.5%）和20g低分子物质（2%）。这些组分往往会对尼古丁和可替宁的检测产生干扰，因此必须对其进行处理，除去其中大部分的干扰物。专利文件CN111983110A在血浆中加入内标萃取溶液以沉淀血浆中的蛋白，但是其只是简单的除去了血浆中的蛋白质，处理后的溶液中仍然含有大量的无机盐和低分子物质等，因此其对烟碱（尼古丁）及可替宁的平均精度密度（RSD）均大于8%，即其精密度较差，难以满足检验检测的需求，同时因为其需要对样品进行4~10倍的稀释，因此不适用于一些浓度较低的样本，所以，有必要发明一种高精密度的血浆中尼古丁和可替宁的检测方法。
混合型阳离子交换柱，包含双重保留模式：即离子交换和反相保留，常用语提取瘦肉精和三聚氰胺等，市售产品包括Waters Oasis MCX和Copure® MS MCX等。混合型阳离子交换柱的使用步骤包括，样本液、内标工作液和酸性调节剂的混合，混合液过柱，淋洗净化、洗脱和吹干复溶，各步骤使用的试剂种类组合对于最后的预处理效果带来了明显的影响。目前尚未有一种基于混合型阳离子交换柱的高回收率、高精度的对血浆中尼古丁和可替宁同时进行回收的前处理方法。
发明内容
本发明第一方面提供了一种血浆中尼古丁和可替宁的前处理方法，包含依次的下述步骤：
步骤A：将血浆与内标工作液混合，加入磷酸水溶液混匀成第一混合液；
步骤B：将第一混合液加入活化的混合型阳离子交换柱，通过正压或负压使得第一混合液通过混合型阳离子交换柱；
步骤C：依次加入甲酸水溶液和乙腈到混合型阳离子交换柱中，于正压或负压条件下将混合型阳离子交换柱的柱床中的溶剂除尽；
步骤D：使用氨水与乙腈混合得到的第二混合液对混合型阳离子交换柱进行洗脱得到洗脱液；
步骤E：将洗脱液进行吹干复溶。
相对于现有技术，本发明使用混合型阳离子交换柱对血浆进行前处理，并通过各步骤中溶液的组合，使得最终获得的洗脱液中含有更少量杂质的同时又能保持尼古丁和可替宁的高回收率，从而可以满足后续检测，特别是LC-MS/MS的需要，通过LC-MS/MS检测发现该方法获得的尼古丁和可替宁具有更高精度密度，同时加标回收率＞88%，可以满足高精度的LC-MS/MS检测的需要。
进一步的，步骤A中，血浆与所述磷酸水溶液的体积比为1:0.8~1.2，所述磷酸水溶液包含体积分数为1~5%的磷酸。
进一步的，所述步骤B中，将所述第一混合液加入活化的混合型阳离子交换柱，通过正压或负压使得所述第一混合液以1~5s/d的流速通过所述混合型阳离子交换柱。
进一步的，所述步骤C中，所述甲酸水溶液含有体积分数为1~5%的甲酸。
进一步的，所述步骤D中，所述氨水与乙腈的体积比为0.8~1.2:9，所述氨水包含质量分数大于等于15%的氨。乙腈用于溶解尼古丁和可替宁，氨水用于解除混合型阳离子交换柱对尼古丁和可替宁的吸附，控制乙腈和氨水的体积比，可以保证回收量和减少吹干时间。
进一步的，所述步骤E中，包含于15~30℃氮气条件下对所述洗脱液进行吹干，然后复溶。
本发明第二方面提供了一种血浆中尼古丁和可替宁的前处理试剂盒，包含磷酸或磷酸水溶液、甲酸或甲酸水溶液、质量分数≥15%的氨水、乙腈及混合型阳离子交换柱。
上述前处理试剂盒中各溶液与混合型阳离子交换柱配合使用可以实现对血浆中尼古丁和可替宁的高回收率、高精度的前处理。
本发明第三方面提供了一种血浆中尼古丁和可替宁的检测方法，血浆经过前处理，前处理选用上述血浆中尼古丁和可替宁的前处理方法或通过上述血浆中尼古丁和可替宁的前处理试剂盒进行前处理。
经过上述前处理的血浆，其中的尼古丁和可替宁不会损失过多，同时去除了血浆中的大量杂质，不限于蛋白质，还包括无机盐和低分子物质，将经过上述预处理的血浆用于检验检测，可以得到高精度的结果，同时降低对检测仪器及色谱柱的损耗。
进一步的，所述血浆经过前处理后，通过LC-MS/MS系统进行检测。
进一步的，所述LC-MS/MS系统的检测条件为：
色谱条件：选用色谱柱规格为HILIC，100*2.1mm，2.7μm；柱温40℃；流动相A：含5mM甲酸铵、体积分数为0.1%甲酸的水；流动相B：体积分数0.1%的甲酸甲醇溶液；进样量：5μL；梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为9:1，流速为0.3mL/min；
1.5min，流动相A与流动相B的体积比为9:1，流速为0.3mL/min；
3min，流动相A与流动相B的体积比为1:9，流速为0.3mL/min；
4.5min，流动相A与流动相B的体积比为1:9，流速为0.3mL/min；
4.6min，流动相A与流动相B的体积比为9:1，流速为0.3mL/min；
6min，流动相A与流动相B的体积比为9:1，流速为0.3mL/min；
质谱条件：电喷雾电压3300V；鞘气压力：30 arb；辅气压力：5arb；离子传输管温度：365 ℃；辅气温度：290 ℃；采集方式：多反应监测；尼古丁、可替宁、尼古丁-D4、可替宁-D3定量离子对M/Z分别为163.1/130.1、177.2/80.1、167.2/134.1、180.2/80.1，定性离子对M/Z分别为163.1/117.1、177.2/98.1、167.2/121.1、180.2/101.1。在血浆经过上述前处理后，使用LC-MS/MS系统对尼古丁和可替宁进行分离和检测，通过对LC-MS/MS系统的检测条件的调整，可以保证对尼古丁和可替宁高效分离和检测。
附图说明
图1 血浆样品中NT、CN定量限及其内标物代表图谱。
图2 人血液样本检测结果。
具体实施方式
为了详细说明本发明的技术内容，以下结合实施方式作进一步说明。下述仪器及试剂，若无特殊说明，均可由市售获得。
实施例1
一种血浆中尼古丁和可替宁的前处理试剂盒，包含：设有混合型阳离子交换柱的96孔板、96孔板收集板、4%的磷酸水溶液、含有尼古丁-D4的内标工作液、含有可替宁-D3的内标工作液、甲醇、超纯水、2%的甲酸水溶液、乙腈、质量分数为25%的浓氨水。
实施例2
血浆中尼古丁和可替宁的检测
1. 血浆样本的预处理
1.1 加内标工作液
移取200 μL血浆样本于1.5 mL的离心管中，加入20 μL的内标工作液混匀，再加入200 μL的4%磷酸水溶液混合均匀后待用。
1.2 MS MCX板的活化
MS MCX 96孔板（购自逗点生物）依次加入1 mL的甲醇与1 mL的纯水进行活化。
1.3 样本处理
将混合均匀的待处理样本加入到经过活化的MCX 96孔板中，置于96孔正压提取装置中使之以2s/d的速度向下流。
1.4 淋洗净化
依次使用1 mL 2%甲酸水溶液及1 mL乙腈加入到4.3中过滤完样本的MCX 96孔板中，置于96孔正压提取装置中，正压氮气条件下干燥30 s，尽可能除去柱床中溶剂。
1.5 洗脱
使用2份100 μL的25%浓氨水/乙腈（10:90）将目标物由MS MCX 96孔板洗脱到96孔样本收集板中。
1.6 吹干复溶
将收集板于常温氮气条件下进行吹干处理，吹干后用150 μL的初始流动相复溶。
2. 上机检测
2.1上样
将复溶后的样本取上清进样检测。
2.2 仪器及参数
仪器：Thermo Scientific TSQ Endura；
色谱参数：
色谱柱：HILIC（100*2.1 mm，2.7 μm）；
柱温：40 ℃；
进样量：5 μL；
流动相：A：水（含5mM甲酸铵及0.1%甲酸） B：乙腈（含0.1%甲酸）；
洗脱方式：梯度洗脱；
流动相梯度：如表1所示。
表1 流动相梯度洗脱条件
质谱参数：
电喷雾电压：3300 V；
鞘气压力：30 arb；
辅助气压力：5 arb；
离子传输管温度：365 ℃；
辅助气温度：290 ℃；
采集方式：多反应监测；
各组分离子对参数：如表2所示：
表2 各组分检测的离子对参数
。
3. 结果
3.1定量限
血浆样品中NT、CN定量限及其内标物代表图谱见图1，由图1可知，在尼古丁（NT）和可替宁（CN）的浓度为0.5μg/L时，仍然可以保证尼古丁和可替宁的分离和检测效果。
3.2标准曲线和线性
如表3所示，对不同日期处理的多批次样品的线性进行考察，发现批次间的线性良好，R值均大于0.997，可确保检测结果的准确性。
表3 NT、CN标准曲线和线性
。
3.3 稳定性实验
3.3.1日内稳定性
一天内重复进行3次试验，每次试验进行6个空白样品的加标测定，获得日内稳定性。结果若表4所示，NT日内RSD＜6%，CN日内RSD＜2%，说明方法稳定可靠，重现性好。
表4 NT、CN日内稳定性
。
3.3.2 日间稳定性
在不同日期内（至少间隔5天），设计5天实验，每天进行6个空白样品的加标测定，以获得日间稳定性。结果如表5所示，NT日间RSD＜6%，CN日间RSD＜5%，说明方法稳定可靠，重现性好。
表5 NT、CN日间稳定性。
3.4 加标回收率
样品低、中、高浓度加标结果如表6所示。通过验证可知，三个浓度的加标回收率均大于88%，且回收率平行测定RSD较小，说明方法测定结果准确及重现性好，可以确保样品测定的准确性。
表6 NT、CN加标回收率结果
。
3.5 实际样品测定
对大量实际样品的测定验证方法的可靠性，其中图2为其中一个人类血液的尼古丁和可替宁的检测结果。从图2可以看出，实际样品测定可以获得理想的检测结果，且不存在基质干扰和其他异常干扰峰，说明方法专属性高、特异性强，适合样品的检测。
本发明使用混合型阳离子交换柱对血浆进行前处理，并通过各步骤中溶液的组合，使得最终获得的洗脱液中含有更少量的杂质的同时又能保持尼古丁和可替宁的高回收率，从而可以满足后续检测，特别是LC-MS/MS的需要，通过LC-MS/MS检测发现该方法获得的尼古丁和可替宁具有更好的精密度及更低的检出限，同时平均回收率＞88%，可以满足高精度的LC-MS/MS检测的需要。进一步使用本发明的LC-MS/MS系统的检测条件，可以保证方法的特异性及灵敏度。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改及变换对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理相一致的最宽的范围。