一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法
阅读说明：本技术 一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法 (Method for detecting inhibition of human amniotic epithelial cells on lymphocyte proliferation in vitro ) 是由 朱灏 于 2021-01-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及淋巴细胞增殖抑制领域,更具体地,本发明涉及一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法,其包括：人羊膜上皮细胞与染色后的PBMC细胞在含有游离氨基刺激剂存在的条件下在第一完全培养基中进行共培养后,记录淋巴细胞增殖能力。本申请检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法操作简单,数据稳定,相对标准偏差在5％以内,抑制率高达75％,可应用在免疫调节中。(The invention relates to the field of lymphocyte proliferation inhibition, in particular to a method for detecting human amniotic epithelial cell in vitro inhibition on lymphocyte proliferation, which comprises the following steps: human amniotic epithelial cells were co-cultured with stained PBMC cells in the presence of free amino stimulators in a first complete medium, and lymphocyte proliferation capacity was recorded. The method for detecting the inhibition of the human amniotic epithelial cell proliferation in vitro is simple to operate, stable in data, within 5% of relative standard deviation and high in inhibition rate of 75%, and can be applied to immune regulation.)
技术领域
本发明涉及淋巴细胞增殖抑制领域，更具体地，本发明涉及一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法。
背景技术
羊膜细胞通俗地说就是包裹羊水的那层透明薄膜上的细胞，一张成熟的羊膜面积可达2平方米，聚集了3亿个羊膜上皮细胞。作为胚胎的保护层，羊膜不仅为胎儿发育提供营养，也是一道阻隔母体与胎儿两个异体组织互不排斥的奇妙屏障。
人羊膜上皮细胞存在于分娩后胎盘上的羊膜组织中，是由受精卵发育至第8天的囊胚内细胞团分化而来，具有分化潜能，可向3个胚层组织分化。在合适的诱导条件下，人羊膜上皮细胞可分化为肝细胞、心肌细胞、神经细胞等。它是一类具有干细胞特性的上皮细胞，表达干细胞标志分子及相关基因，如CD133，CD271，TRA-1-60，Oct3/4，SOX-2，SSEA4和Klf4，但不表达干细胞中的端粒酶基因。端粒酶可以保护染色体的末端，保证DNA不在复制过程中缩短，从而使细胞永生化。因此，人羊膜上皮细胞不能无限增殖，不能看做严格意义上的干细胞。细胞表面不表达HLA-A、B、C和DR抗原，因抗原性极低，同种异体移植后不会引起免疫排斥反应。
然而人羊膜细胞培养三天后才会进入对数生长期，繁殖缓慢，其对于淋巴细胞增殖抑制效果缓慢，同时由于细胞培养增殖、去增殖等方法存在差异，人羊膜细胞的质量也存在很大差异，在体外检测淋巴细胞增殖抑制时数据波动大，不稳定。
发明内容
针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其包括：人羊膜上皮细胞与染色后的PBMC细胞在含有游离氨基刺激剂存在的条件下在第一完全培养基中进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法还包括：人羊膜上皮细胞接种：取人羊膜上皮细胞悬液，进行n次离心去上清后，使用完全培养基进行重悬，之后接种培养，n≥1。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法还包括：将接种培养的人羊膜上皮细胞去增殖后继续培养。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述刺激剂在第一完全培养基中的终浓度为2.2-2.6μg/mL。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述游离氨基刺激剂为anti-CD3和/或anti-CD28。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述游离氨基刺激剂为anti-CD3和anti-CD28，其浓度比为1：(0.8-1.2)。
作为本发明的一种优选的技术方案，当n＝1时，所述完全培养基含有8-12wt％胎牛血清。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述完全培养基为Gibco 1640培养基。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述人羊膜上皮细胞接种过程中，接种培养的条件为：4.8-5.2vol％CO2，温度为30-40℃，培养20-24h。
本发明第二个方面提供了一种所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法在免疫调节中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本申请严格控制刺激剂的浓度，使得在接种培养人羊膜上皮细胞20-24h时与染色后的PBMC细胞共培养时，人羊膜上皮细胞与PBMC细胞接触几率增大；
(2)本申请中在人羊膜上皮细胞接种过程中，调整细胞浓度至2×105/mL后进行培养，其增殖较好，保持较高的细胞活性；
(3)本申请人羊膜上皮细胞接种过程简单，一次离心去上清，使用本申请中Gibco1640培养基重悬后，无不溶性絮状物存在，同时得到的人羊膜上皮细胞对淋巴细胞增殖的抑制率提高；
(4)本申请检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法操作简单，数据稳定，相对标准偏差在5％以内，抑制率高达75％，可应用在免疫调节中。
具体实施方式
以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。
本发明第一个方面提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其包括：人羊膜上皮细胞与染色后的PBMC细胞在含有游离氨基刺激剂存在的条件下在第一完全培养基中进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
在一种实施方式中，所述刺激剂在第一完全培养基中的终浓度为2.2-2.6μg/mL。
优选的，所述刺激剂在第一完全培养基中的终浓度为2.4μg/mL。
在一种实施方式中，所述游离氨基刺激剂为anti-CD3和/或anti-CD28。
优选的，所述游离氨基刺激剂为anti-CD3和anti-CD28；进一步优选的，所述anti-CD3和anti-CD28的浓度比为1：(0.8-1.2)；更优选的，所述anti-CD3和anti-CD28的浓度比为1：1。
当人羊膜上皮细胞接种培养20-24h时，大多数的人羊膜上皮细胞贴壁生长，其还没有达到对数生长期，其此时细胞活性的人羊膜上皮细胞在与染色后的PBMC细胞在含有游离氨基刺激剂存在的条件下在第一完全培养基中进行共培养时，其对PBMC细胞的接触几率降低，本申请人意外的发现，当刺激剂在第一完全培养基中的终浓度为2.2-2.6μg/mL，且刺激剂为anti-CD3和anti-CD28，其浓度比为1：(0.8-1.2)时，可以显著提高人羊膜细胞和染色后的PBMC细胞的接触几率，本申请人认为可能的原因是在此条件下，可以刺激人羊膜上皮细胞分泌一种细胞因子，其可能在抑制淋巴细胞增殖的过程中会对其造成接触吸引。
在一种实施方式中，所述第一完全培养基含有8-12wt％胎牛血清。
优选的，所述第一完全培养基含有10wt％胎牛血清。
优选的，所述第一完全培养基为Gibco 1640培养基。
本发明对PBMC染色的操作不作特别限制，本领域技术人员可作常规选择。
在一种实施方式中，PBMC染色使用2μmol/L CFSE染色液染色5min。
本发明对PBMC染色之前还可以包括冻存PBMC细胞复苏过程，其具体操作不作特别限制，本领域技术人员可作常规选择。
在一种实施方式中，所述人羊膜上皮细胞和染色后的PBMC细胞的个数比为1：(1-10)。
优选的，所述人羊膜上皮细胞和染色后的PBMC细胞的个数比为1：5。
在一种实施方式中，所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法还包括：人羊膜上皮细胞接种：取人羊膜上皮细胞悬液，进行n次离心去上清后，使用完全培养基进行重悬，之后接种培养，n≥1。
在一种实施方式中，所述n＝1。
在一种实施方式中，所述完全培养基含有8-12wt％胎牛血清。
优选的，所述完全培养基含有10wt％胎牛血清。
优选的，所述完全培养基为Gibco 1640培养基。
在一种实施方式中，所述接种培养的条件为：4.8-5.2vol％CO2，温度为30-40℃，培养20-24h。
优选的，所述接种培养的条件为：5vol％CO2，温度为37℃，培养22h。
本申请人在实验中意外的发现，在人羊膜上皮细胞接种过程中，加入完全培养基重悬时，会出现不溶性絮状物产生，吹打后絮状物仍存在，此外，本申请人意外的发现，对细胞悬液进行多次离心去上清后，在加入完全培养基重悬时，不溶性絮状物减少，然而该方法一方面操作繁琐，增加时间成本，另一方面其少量的不溶性絮状物对于淋巴细胞增殖抑制存在很大的影响。本申请人经过一系列的研究和思考后发现，当完全培养基为Gibco 1640培养基时，对人羊膜上皮细胞悬液进行一次离心去上清后，不仅不会产生不溶性絮状物，同时对于淋巴细胞增殖的抑制率显著提高，本申请人认为可能的原因是Gibco 1640培养基含有10％的胎牛血清，可以有效防止人羊膜上皮细胞悬液中冻存液DMSO对人羊膜上皮细胞的影响，同时Gibco 1640培养基不含有蛋白质、脂类或生长因子，不会因为离心不完全导致的蛋白质对人羊膜上皮细胞重悬的影响，此外，其含有的合适的营养物质，使得人羊膜上皮细胞具有很好的生物活性，增殖效果好。
在一种实施方式中，所述人羊膜上皮细胞接种：取400g细胞悬液，离心5min，去上清，加入完全培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×105/mL；将调整后的细胞悬液接种于3块24孔培养板中，每块接种4个孔，每孔500μL，共接种12孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，培养22h。
本申请中调整细胞浓度至2×105/mL后进行培养，其增殖较好，保持较高的细胞活性。
在一种实施方式中，所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法还包括：将接种培养的人羊膜上皮细胞去增殖后继续培养。
在一种实施方式中，所述去增殖的处理方式包括辐射去增殖、反复冻融、加入去增殖处理剂中一种或多种。
优选的，所述去增殖处理剂为丝裂霉素C的完全培养基；进一步优选的，所述丝裂霉素C的浓度为8-12μg/mL；更优选的，所述丝裂霉素C的浓度为10μg/mL。
在一种实施方式中，所述去增殖处理的时间为1-3h。
优选的，所述去增殖处理的时间为2h。
本申请人意外的发现，当去增殖处理剂为8-12μg/ml丝裂霉素C的完全培养基时，培养1-3h后，再次进行培养后，此时得到的人羊膜上皮细胞的分泌因子较多，能够有限抑制淋巴细胞增殖。
在一种实施方式中，所述将接种培养的人羊膜上皮细胞去增殖后继续培养具体包括：吸弃接触培养的各孔培养基，每孔加入500μl含10μg/mL丝裂霉素C的完全培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育2h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1mLPBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1mL完全培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)中。
本发明所述完全培养基不作特别说明时，均为Gibco 1640培养基。
在一种实施方式中，所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，包括下面步骤：
(1)人羊膜上皮细胞接种：取人羊膜上皮细胞悬液，进行n次离心去上清后，使用完全培养基进行重悬，之后接种培养，n≥1；
(2)将接种培养的人羊膜上皮细胞去增殖后继续培养；
(3)步骤(2)得到的人羊膜上皮细胞与染色后的PBMC细胞在含有游离氨基刺激剂存在的条件下在第一完全培养基中进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
本发明第二个方面提供了一种所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法在免疫调节中的应用。
实施例
在下文中，通过实施例对本发明进行更详细地描述，但应理解，这些实施例仅仅是示例的而非限制性的。如果没有其它说明，下面实施例所用原料都是市售的。
实施例1
本发明的实施例1提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其具体如下：
(1)人羊膜上皮细胞接种：取400g细胞悬液，离心5min，去上清，加入含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×105/mL；将调整后的细胞悬液接种于3块24孔培养板中，每块接种4个孔，每孔500μL，共接种12孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，培养20h；
(2)吸弃步骤(1)中各孔培养基，每孔加入500μl含8μg/mL丝裂霉素C的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育3h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1mLPBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1mL含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)中；
(3)将步骤(2)最终得到的人羊膜上皮细胞与使用2μmol/L CFSE染色液染色5min的PBMC细胞以个数为1：5的比例在终浓度为1.2μg/mL anti-CD3与1μg/mL anti-CD28的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法应用于免疫调节中。
实施例2
本发明的实施例2提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其具体如下：
(1)人羊膜上皮细胞接种：取400g细胞悬液，离心5min，去上清，加入含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×105/mL；将调整后的细胞悬液接种于3块24孔培养板中，每块接种4个孔，每孔500μL，共接种12孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，培养20h；
(2)吸弃步骤(1)中各孔培养基，每孔加入500μl含12μg/mL丝裂霉素C的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育1h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1mLPBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1mL含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)中；
(3)将步骤(2)最终得到的人羊膜上皮细胞与使用2μmol/L CFSE染色液染色5min的PBMC细胞以个数为1：5的比例在终浓度为1.2μg/mL anti-CD3与1.4μg/mL anti-CD28的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法应用于免疫调节中。
实施例3
本发明的实施例3提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其具体如下：
(1)人羊膜上皮细胞接种：取400g细胞悬液，离心5min，去上清，加入含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×105/mL；将调整后的细胞悬液接种于3块24孔培养板中，每块接种4个孔，每孔500μL，共接种12孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，培养20h；
(2)吸弃步骤(1)中各孔培养基，每孔加入500μl含10μg/mL丝裂霉素C的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育2h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1mLPBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1mL含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)中；
(3)将步骤(2)最终得到的人羊膜上皮细胞与使用2μmol/L CFSE染色液染色5min的PBMC细胞以个数为1：5的比例在终浓度为1.2μg/mL anti-CD3与1.2μg/mL anti-CD28的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法应用于免疫调节中。
实施例4
本发明的实施例4提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(1)中含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基替换为DMEM/F12培养基。
所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法应用于免疫调节中。
实施例5
本发明的实施例5提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(1)中再次重复离心5min去上清操作2次，含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基替换为DMEM/F12培养基。
所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法应用于免疫调节中。
实施例6
本发明的实施例6提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(3)中1.2μg/mL anti-CD3与1.2μg/mL anti-CD28分别替换为1μg/mL anti-CD3与1μg/mL anti-CD28。
所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法应用于免疫调节中。
实施例7
本发明的实施例7提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(3)中1.2μg/mL anti-CD3与1.2μg/mL anti-CD28分别替换为1.5μg/mL anti-CD3与1.5μg/mL anti-CD28。
所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法应用于免疫调节中。
实施例8
本发明的实施例8提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(3)中1.2μg/mL anti-CD3与1.2μg/mL anti-CD28替换为2.4μg/mL anti-CD3。
所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法应用于免疫调节中。
实施例9
本发明的实施例9提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(3)中1.2μg/mL anti-CD3与1.2μg/mL anti-CD28替换为2.4μg/mL anti-CD28。
所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法应用于免疫调节中。
性能评估
1.重悬效果：分别记录实施例1-9步骤(1)中重悬后细胞液是否出现不溶性絮状物。
2.人羊膜上皮细胞和PBMC细胞接触几率测试：分别对实施例1-9步骤(3)中共培养半天后观察人羊膜细胞与PBMC细胞的接触情况，并对人羊膜细胞与PBMC细胞的接触情况进行排序编号，PBMC细胞与人羊膜细胞接触数量越多，排序越靠前，编号越小，得到编号1-9，其中若编号为1-2，记为优，若编号为3-6，记为良，若编号为7-9，记为差。
表1
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。
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