具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明的第一方面涉及一种引物组，所述引物组包含175对引物对中的至少50对；

175对引物对具有核苷酸序列如SEQ ID NO：1～175所示的上游引物，以及与上游引物依次对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：175～350所示的下游引物。

在一些实施方式中，所述引物组包含175对引物对中的至少50对，或至少60对、或至少70对、或至少80对、或至少90对、或至少100对、或至少110对、或至少120对、或至少130对、或至少140对、或至少150对、或至少160对、或至少170对。

在一些实施方式中，所述引物组中包含用于检测表1中所定义微生物种类中的任意一种。

在一些实施方式中，所述引物组能够检测表1中所定义98种病原微生物种类中的至少30种、或至少40种、或至少50种，或至少60种、或至少70种、或至少80种、或至少90种。

本发明的第二方面涉及一种试剂盒，包含如上所述的引物组。

术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)，试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。

在一些实施方式中，所述试剂盒包含如下试剂中的至少一种：

DNA聚合酶、dNTPs、裂解和/或洗涤缓冲剂、用于富集核酸的固相载体、核酸洗脱试剂、稀释缓冲剂、水、分子量marker、蛋白酶K和中和试剂。

如本文使用的术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH7–pH 9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。

在一些实施方式中，所述水为无核酸酶的水，例如双蒸水或去离子水。

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

本文使用的“固相载体”，优选是“富集颗粒”，可以由任何数量的已知材料制造。这种材料的实例包括：无机物、天然聚合物和合成聚合物。这些材料的具体实例包括：纤维素、纤维素衍生物、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、胶乳凝胶、葡聚糖、橡胶、硅胶、塑料、硝化纤维素、天然海绵、硅胶、对照孔玻璃(control pore glass)、金属、交联葡聚糖(例如Sephadex TM)、琼脂糖凝胶(Sepharose TM)和本领域技术人员已知的其它固相支持物。

如本文所使用的，“颗粒”是指可以是各种形状的离散的小物体、例如球体(例如珠)、胶囊、多面体等。颗粒可以是宏观的或微观的，例如微粒或纳米颗粒。颗粒可以是非磁性或磁性的。磁性颗粒可以包含铁磁性物质，并且铁磁性物质可以是Fe，Ni，Co，氧化铁等。

试剂盒中还可以含有核酸提取试剂，其可以用于执行酚氯仿法、NaOH法、树脂提取法、盐析法、十六烷基三甲基溴化胺法、硅胶膜吸附法、FTA卡法、硅珠法或磁珠提取法提取核酸。

在一些实施方式中，所述试剂盒包括已知序列和浓度的待检测核酸阳性对照。

在一些实施方式中，所述试剂盒包含末端修复酶、连接缓冲液、DNA连接酶以及接头片段中的至少一种。

本发明的第三方面涉及一种多种靶核酸的测序建库方法，所述方法包括以下步骤：

以待检测物的基因组DNA为模板，使用如上所述的引物组，或如上所述的试剂盒进行多重PCR扩增。

本发明的第四方面涉及一种检测多种病原微生物的方法，其特征在于，包括：

使用如上所述的方法进行建库，测序以判断病原微生物的存在。

在本申请中使用术语“检测”和类似术语来概括地指过程或发现或确定某事物的存在或不存在，以及程度、数量或水平，或发生的概率。例如，术语“检测”当关于靶核酸序列使用时，可以表示发现或确定所述序列的存在、不存在、水平或数量，以及存在或不存的概率或似然性。要理解的是，表述“检测存在或不存在”、“存在或不存在的检测”和相关表述包括定性和定量检测。例如，定量检测包括确定样品中副流感病毒3型有关的核酸序列的水平、数量或量。

术语“待检测物”是指含有或推测含有来自病原微生物核酸的任何组合物。该术语包括全血、血浆、血清、细胞、咽拭子、唾液、尿液、粪便、脑脊液、胸积水、羊水、阴道分泌物。

在本发明的一些实施方式中，所述测序法是高通量测序，也称作二代测序(“NGS”)。二代测序在并行的测序过程中同时产生数千至数百万条序列。NGS区别于“Sanger测序”(一代测序)，后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。可用于本发明的NGS的测序平台可以是商用可得的，包括但不限于Illumina MiniSeq、NextSeq 550等。

在一些实施方式中，所述方法为非诊断目的方法。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1

本发明提供一种病原微生物超多重PCR引物设计装置系统输出引物组合方式，并用于高通量测序检测病原物的方法。本发明是根据待检测样本的特异性序列设计特异性引物组合方案，经验证后用于超多重PCR扩增，扩增产物经文库制备并测序，对样本中微生物种类及致病/耐药基因进行检测。以98种病原微生物检测为例。

通过文献检索选择常见的病原微生物98种共98个基因组序列，在Genebank上下载各病原微生物序列。针对上述病原微生物已有文献支持的功能区域、保守区域及串联重复片段的序列，使用mega软件进行多序列比对分析，比对获得的属间通用序列、种间特异性序列及种下分类亚种保守序列，以及各病原微生物相关致病基因及耐药基因序列共175个目标扩增区域。

针对上述序列，设计引物经引物特异性比对确认无非特异性扩增风险，并存放于引物池中，引物设计规则应达到以下标准：

(1)选择种特异性区间及科属保守性区间，耐药基因，毒力基因，每种病原设计5对引物，以确保敏感性及特异性。

(2)引物片段长度在18-24bp之间，扩增产物长度在110-120bp之间；

(3)引物退火温度在55-65℃之间；

(4)引物GC含量在40-60％之间；

(5)引物3’端应为C或者G；6.每条引物不出现连续4个及以上A或者T或者C或者G；

针对上述获得的引物池，按以下条件进行筛选配对，计算最佳引物组合方案：

(1)每条引物自身头尾存在连续2个以下碱基互补配对的情况，得2分，引物自身头尾存在连续2-3个碱基互补配对的情况，得1分，引物自身头尾存在连续3个以上碱基互补配对的情况，得0分；

(2)引物Tm值与Tm平均值的偏移程度在2℃以内的，每条引物+1分，引物Tm值与Tm平均值的偏移程度在2℃以上的，每条引物+0分；

(3)引物GC含量在平均GC含量平均值5％以内的，每条引物+1分，引物GC含量在平均GC含量平均值5％以上的，每条引物+0分；

(4)以偏移Tm平均值最小的引物对作为标准，并以标准引物对构建二元矩阵与其他引物分别作互补分析，每2条引物初始得分为5分，每条引物与之间存在连续2个以上碱基互补配对的情况，每超过1个碱基减2分；将分值低于3分或与其他引物互补分析分值低于3分所出现频次超50％以上的引物退回引物池，替换为另一条引物并重新计算。

经以上步骤筛选后，输出得分最高的引物组合方案，获得引物如表1所示。

SEQ ID NO：1～175所示的上游引物依次与表1序号中的1～175相对应。

表1引物信息

以上病原微生物超多重PCR特异性引物完整覆盖目标的175个区域，将该引物组合用于超多重PCR，其扩增产物用于建库及高通量测序。

选择引物设计覆盖范围内的98种微生物共846例已知阳性样本和引物设计覆盖范围外的3种微生物共48例已知样本，总计894例样本，经过DNA提取、PCR扩增、文库制备及上机测序。

所有引物设计覆盖内的样本均能正确检出，对应的病原微生物，阳性符合率为100％，如表2所示。所有引物设计覆盖范围外的样本均不检出病原微生物，阴性符合率为100％，如表3所示。以上引物设计覆盖范围内或范围外样本之间均不产生交叉污染现象，特异性较好。

表2引物设计覆盖范围内的样本检测结果

注：部分阳性标本较难收集，测试采用合成假病毒或购买商用质控品。

表3引物设计覆盖范围外的样本检测结果

同时，选择8例呼吸道合胞病毒B型阳性样本，分别使用Sanger测序方法与基于本实施例所述超多种PCR引物组合的tNGS方法，并以Sanger测序作为标准，验证不同方法学的一致性。结果显示，Sanger测序与tNGS均能正确检出8例样本中的呼吸道合报病毒B型，一致性较好。

综合以上结果，证明本专利所述超多重PCR引物设计装置设计的引物组合对于检测范围内阳性或检测范围内阴性样本均能准确检出。

实施例2

选择实施例1中所述超多重PCR引物组合，选择不在上述引物设计中的肠道病毒近缘种柯萨奇病毒A6型进行检测，结果显示2例柯萨奇病毒A6型虽不在引物设计范围内，但根据通用引物序列，提示为肠道病毒属其他型别。该2例结果与已知的阳性结果一致，证明本引物组合拥有对未知样本的检出或预测能力，结果如表4所示。

表4近缘种检测

实施例3

选择实施例1中所述目标序列不基于罚分机制进行引物设计获得引物组合，并与实施例1中所述超多重PCR引物组合对6个相同样本进行扩增，以扩增后产物浓度及扩增片段分布比较扩增效果。

通过对相同模板量的不同引物体系的反应体系进行扩增，测定浓度后并使用Qsep100分析扩增产物的片段长度，结果显示，对6个样本PCR扩增后的浓度进行分析，基于罚分机制设计的引物组合扩增后的浓度高于不基于罚分机制设计的引物组合，如表5所示；基于罚分机制的引物组合在40-60bp范围内不出现峰，而不基于罚分机制的引物组合在40-60bp范围内出现峰，即给予罚分机制的引物组合扩增后引物二聚体显著少于不基于罚分机制设计的引物组合，如图1、图2所示。

表5不同引物组合扩增后浓度比较

综上，本专利所述的罚分机制尤其是自建二元矩阵，可有效消除引物对之间的可能产生的引物二聚体，从而有效提高了超多重PCR的引物扩增特异性及扩增效率。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市金圻睿生物科技有限责任公司

<120> 用于检测病原微生物的引物组

<160> 350

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

cagttatgct ccttgcccac t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

accagcccaa aagttccacc gt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

caaagtcttc gagtggtgta at 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

ctatgctatg gtgggagaca t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

aaaatcatta attcgggttg gc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

ctagcagaaa tgacctcaca ac 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

gaaccacaat atccgagtgg tgc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

ctgacattct gtcccagcag cca 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

cagtcgagcc agaagagaac tac 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

gtaattagga gggcaaacaa t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

agaaacacac cacacaacag c 21

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

tcatggagtg gataaagaca agac 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

acactagtag aaccgggaga caa 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 14

ccttgatgga gaaaactgca cac 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 15

ctgctgcaga ttacaaaagc act 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 16

gaagacgaag ggctaaaaca aa 22

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 17

ccatgtaaga tgtggcgaat gcag 24

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 18

cctgcttctg cttgcaatct aaa 23

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 19

acggagggga tcaattcctt t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 20

ggtgatgtac ttcgcaaaca g 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 21

aaatgtttgg tgtcgcaagt ttg 23

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 22

tggtacatag gacagatttt ag 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 23

gttttgtcaa ttttaatgtg ga 22

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 24

taattttttc tacgctgttg ttt 23

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 25

cattgcacca tagctcaact cacg 24

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 26

gtcatgcttg gtgccgtaat caa 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 27

accgtctgcg gtatgtggaa agg 23

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 28

ggaacttctc ctgctagaat gg 22

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 29

acttatgtta tgcacaacta tgg 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 30

tagctagaga tttttcaccc att 23

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 31

tggctttgtt ggaagtgcaa a 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 32

gtactactaa aagaaccttg c 21

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 33

ctttgggtgt ccgtgtttcr tt 22

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 34

ctttagcctt gattggttgc tct 23

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 35

ttacagtgac tgccacttta gcat 24

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 36

ttctcgctac aatggctttg ttg 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 37

acagctacac tagcattgtt agg 23

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 38

gtggtgcaac cccatatgct cac 23

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 39

tcagattgtt tctgttctgc ta 22

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 40

aagggaaagg gagctgctac aa 22

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 41

cttcatgctt tcctcatttc ct 22

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 42

tggcctcatt tggaacggag atc 23

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 43

cagctccggg ccggtcaggg taa 23

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 44

gggcccggca gggtaaagtc gtcc 24

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 45

actactgggt gtggggccgg a 21

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 46

atagaagttg accggaaatt tc 22

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 47

ggttggatgc ctacatatgc cg 22

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 48

cccagtcccg tccagggggg ac 22

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 49

ttccccctac tcctctccaa cct 23

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 50

gactgctggt gcatgtgggg acgc 24

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 51

accaacgaga cagatcgaag aa 22

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 52

aggcattgca actgttgttg ac 22

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 53

agcttgccga tcttgatgga ac 22

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 54

gaagatgtca tgccagaact tcca 24

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 55

cttatgctta acttactaga taaa 24

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 56

cacatccatg ggacgaagat g 21

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 57

gctcagaatc tacgaagaac a 21

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 58

actgtattca gtcaacacag ggct 24

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 59

tggtgcaaag agtctrttga 20

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 60

atatggtcac cctcacagcc acac 24

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 61

cgatatggtc actctcacag caa 23

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 62

atggtcactc tcacagcaac tct 23

<210> 63

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 63

gcatagaaag caaggctatt cag 23

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 64

ttaagcccag tgtggagaag ag 22

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 65

gttcttagtg tgttcaagcc a 21

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 66

aggcgcgtcg tcgagttkca a 21

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 67

acaacaccta ctcgtacaaa g 21

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 68

gatagaggtc ctagcttcaa 20

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 69

cctactttta agccctactc c 21

<210> 70

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 70

caccaacacc tacgagtaca tg 22

<210> 71

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 71

accaggaaaa ttctgccaca ga 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 72

aacttgtgga agagtggcct tttc 24

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 73

atgtaaactc catgcattta a 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 74

ttacaccaaa tgaaccaggg aaa 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 75

cagacaaaaa ggactcatca tca 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 76

tgcaaaataa gggaataagg tg 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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taccatccag cttgtgactg c 21

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<211> 21

<212> DNA

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tggccgacaa ggagacatca t 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 79

aggtccatca cgaccagggg gta 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 80

agaactgaag ataaggccca ag 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 81

cggccggcgg cacccccggg t 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 82

cggtcagcgg gatgtcgtac ag 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ggtttccacc cgggtaattg c 21

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<212> DNA

<213> artificial sequence

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ggccgcaaaa tttctgacgc caca 24

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 85

aatgtgtcat tctttggcat t 21

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<211> 24

<212> DNA

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<400> 86

tgctcaaatt tgatagcagt ctga 24

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<211> 24

<212> DNA

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<400> 87

agatcaacaa atcaatgcaa agct 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 88

ctaatgttgg agaaaatcac aaac 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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atccggaaag ttggctgatg acg 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tttccagaag tcctgttgcg tc 22

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<211> 21

<212> DNA

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ccgataatat gtccacctca c 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 92

ctcgtgaaac actgaggcaa ta 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tgggatactg gctacgctaa ggtt 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 94

ttacgacatg ccttgcgatg tttt 24

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<211> 23

<212> DNA

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gatgaacgcg aacaaacact taa 23

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<211> 24

<212> DNA

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taaaattccg acggcagctg tatt 24

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<211> 22

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ggtatgattt cttgacccac aa 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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cgcttctcgc caatcttttc ggg 23

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<211> 22

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gaagctgctc gatcagttta ac 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 100

tcagcggaat gctgtttgtg gt 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aaatacaaaa tgttaacgac gc 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 102

ctccggttat cataaaacgg gaca 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 103

agtttcttcg gatactatga tatt 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tgttgtggcg tttatcaatt ag 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tttgagacgc agcgtttatt gt 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tactttaaaa tcggctcgac t 21

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<211> 23

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tatctcttat ggtttgcgtg gtg 23

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<211> 22

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taagtgaata ccagcgaata tt 22

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<211> 23

<212> DNA

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cccccgggtt cgacctcaac gtc 23

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<211> 21

<212> DNA

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gcagatgact cacctgttgg a 21

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<211> 21

<212> DNA

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cgactgcacc tggagcagct a 21

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<211> 22

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ttttaaaaag gccaagcaaa ag 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tctttatcga tgaaattgat gctg 24

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<211> 23

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tccttcgctt ttatggcaca agc 23

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<211> 21

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gaacaggatg tcaaagatct a 21

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<211> 21

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gtgtcaaggt gtctttcgga t 21

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<211> 24

<212> DNA

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gtgtagatag agagactgag gatg 24

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<211> 22

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<213> artificial sequence

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tgttagtgga gatccttcta ta 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gaggaacacc cggtgaatac cta 23

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<211> 23

<212> DNA

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tgggccgtga acaagactgg gct 23

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<211> 21

<212> DNA

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tttatatggt tgggtagtgg a 21

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<211> 23

<212> DNA

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aatcgtgcaa gtaaaccaaa taa 23

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<211> 24

<212> DNA

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caatgaatca agcgatgcag ctag 24

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<211> 24

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attctcacag gcttgcttgc tgga 24

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<211> 24

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agcgtaggcg tcggtgacaa aggc 24

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<211> 21

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<213> artificial sequence

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ccctcacggt tcagggttag c 21

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gatgtcaaga acttcgacgg ccgt 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gttcctttct tgggcagagc acgc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 130

ttgcttattt ggtttccacc cggg 24

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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atcttcatct ggtccaggcc c 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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attggtgaag agtttggacc ct 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tcgtgggctg cctgttgttt tac 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ttgtcgttgc agtgattacg at 22

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<211> 21

<212> DNA

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tggaaatgag ctggttcgtt t 21

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<211> 24

<212> DNA

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gcatgaagac ggattcaaac gtgc 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gaagtcttgg aggtatgcaa gc 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gggaccagcg gatatgaacg aaca 24

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ttcagctact tgcaagattg g 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 140

ttcgggcaga caagctgctt tt 22

<210> 141

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aggcaaaatc gtgtttacgg ga 22

<210> 142

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gcctggtcaa aatgggcgcg aaaa 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aggctgcctg gaaggtgtcg ggt 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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cctcggtgcg accccaactc ga 22

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<211> 23

<212> DNA

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gatatgccgt cgaaagtcct gag 23

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<211> 24

<212> DNA

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cgaaccggcg gattataaaa gtgt 24

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<211> 22

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<213> artificial sequence

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tgttgttcag gttttcataa gt 22

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<211> 21

<212> DNA

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tcgttttcgg cgcggcattc c 21

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tacaagaaag tcgtcctatt ttaa 24

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<211> 23

<212> DNA

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gaggcggtaa cgatgaacga gaa 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gatcattcgt tggcactgac atc 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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cactgtatac cgatgaaact tt 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tatcaagggt cgatttttcc agc 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tgaatgtcac tagtaatgat gc 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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cgctgctgat gctgctggac t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aaaggtatcc atgccgcggc g 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ccatcatcca cagcgagaac tgg 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tgcggctgct gatagaacgc cg 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 159

tcgtttggaa ggcttgactc ttgt 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 160

tttaacattt cttgtgcaaa ctc 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 161

gttatccctt tctcttctca agc 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 162

agcgttttgt atttgcaatg cca 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 163

gactcaggtc cctataggct tt 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aaccataatc cgaacgaagt cca 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tgataatgca ctgggggcat atct 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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atctgctgct caatcgctcg ggt 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 167

gacgcttaac atcttatcgt catg 24

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 168

ttacaatgtc gagcctctag g 21

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tggttacggc taaaaatgtc agca 24

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<211> 23

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<213> artificial sequence

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attatcgtcc tactgatttg gcg 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ttgggccttt ttgagaatct gcac 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 172

gcaactaaag attccagctc gg 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gaaagccgtc caatcttaac ag 22

<210> 174

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aggtgggaca tgtaaagttt tccc 24

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<211> 22

<212> DNA

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gttttagtaa tgttttagta gg 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aggatggtca aaagttatat cttc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gcgtcgtgtt cgggagttgg tgga 24

<210> 178

<211> 23

<212> DNA

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aagtcccttt aagagctcaa tga 23

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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agcatgagag cttttaattt c 21

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 180

atatcttcat atctgatttt atca 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aattccatat ctgattgtat tga 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ttttgggaca tcttccacat gt 22

<210> 183

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tcaagatcat ctgttatcaa tg 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 184

cgattgcaga tccaacacct aac 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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atctataaga tgagggtgtt ttt 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ttcaaaatgg taatcacctt ttg 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ccatttaggg cgttttggac aaa 23

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<211> 23

<212> DNA

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gggtgtctga caagttgtat tgc 23

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<211> 21

<212> DNA

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ggtaacagtt gctgtaggct t 21

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<211> 23

<212> DNA

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accgatttgc ttctctacct cat 23

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tattaccttg ctcctgccac t 21

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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atcctagtgt cttgagaaaa tacc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tccctaatcc caaagaggct aatg 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 194

aagtatacac attcaccgtt at 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ttggagcttg ttgaatgggt tga 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 196

aaacagtatt accataagta gtaa 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aaataataaa gaaattacaa aaa 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tgcattagtt tcaggattaa aa 22

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<211> 23

<212> DNA

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<400> 199

aaaacgattt tcataaaatg att 23

<210> 200

<211> 22

<212> DNA

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<400> 200

taactatttc aagtctagcc gg 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 201

aacagctaag aaaaccagtt tgt 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 202

cgacatcagt actagtgcct gtg 23

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tttcttagtg acagtttggc c 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tcctaggtaa gctctaactt ctt 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aaatctatgt atgttagcac ag 22

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<211> 21

<212> DNA

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tgtgacactg ttatatggta t 21

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<211> 23

<212> DNA

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ataggtatgt cgagtaccgt cag 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ccatcccgca attactcrtt ac 22

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<211> 21

<212> DNA

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gcacatttca gtaaactttt t 21

<210> 210

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gcattgcatg catcattgaa ttt 23

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<211> 23

<212> DNA

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tcagtgaact tcttgagcca act 23

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<211> 24

<212> DNA

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ctgtgaactt cttaagccat gatt 24

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<211> 21

<212> DNA

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ttcaagatgt tgcaggcgag c 21

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<211> 24

<212> DNA

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tatggactcc tgattattaa taaa 24

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<211> 21

<212> DNA

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ttgggcaggc ttgaagcatc a 21

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<211> 21

<212> DNA

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tatgtttgga catgagttgc t 21

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<211> 24

<212> DNA

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ggcattgctc acacactcgg ggac 24

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<211> 21

<212> DNA

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gtctcgtacg tcgtgaccta c 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gtctcgtaca tcgtgaccta cc 22

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<211> 24

<212> DNA

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tggcggccgt gcacgtcgcc ttaa 24

<210> 221

<211> 24

<212> DNA

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cgtctgtaca gctcgacgat atcg 24

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<211> 24

<212> DNA

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gttttccatc agaaaactat atac 24

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<211> 22

<212> DNA

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gggggtcggg ctgggccgcc ag 22

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<211> 24

<212> DNA

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ggggagaggg aaggcgactc gccc 24

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<211> 21

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cgtgtgcgcg aaagcctgtt c 21

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<211> 22

<212> DNA

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ggtataggta atgctactgt ga 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aaaagcaaac agtattttgt ttgc 24

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<211> 23

<212> DNA

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atcactgttt tccagcatga aaa 23

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<211> 22

<212> DNA

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aaagggtatt tgtagtgcta ta 22

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<211> 21

<212> DNA

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acttgttcta ttaagcgtgc c 21

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<211> 23

<212> DNA

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tttcaagcat gaagaatggt atc 23

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<212> DNA

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ccaagttttt ctccccatgc cgtc 24

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<211> 21

<212> DNA

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tctatttgta gttcttgaaa t 21

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<211> 21

<212> DNA

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ataaaaggaa acacggmcac c 21

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<211> 21

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aacttcttta gccatgaggc a 21

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<211> 21

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gatgcgctct gtttctgagc a 21

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<211> 24

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ttgaattttt ttagccatga tgcg 24

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acaatctgaa tacctttggt aga 23

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<211> 21

<212> DNA

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tttcattttt gtctggtcct t 21

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<211> 22

<212> DNA

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taatatcaga agcatagtct ag 22

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<211> 24

<212> DNA

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gaagtaggtg tctgtggcgc gsgc 24

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<211> 21

<212> DNA

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cgccgcggat gtcaaagtag g 21

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<211> 22

<212> DNA

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caatgccaaa tgtgtttgtg gt 22

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<212> DNA

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gcgttttgct cttcttcttc 20

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<211> 21

<212> DNA

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ggtggttgaa gggatttacg t 21

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<211> 24

<212> DNA

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tctcaaagct tctgccattt ctgc 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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cctcgaatac cttcaacata tc 22

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<211> 24

<212> DNA

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acaataacca ccaggcatgt catt 24

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<211> 21

<212> DNA

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ttcttcaaag gttaagattg a 21

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<211> 24

<212> DNA

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ttgcagagtt tgtatacctt tgaa 24

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<211> 23

<212> DNA

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aagatcatcg tggttttcat ttt 23

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<211> 23

<212> DNA

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aagatctaga gatgtacaaa caa 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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atggccgccc ttgaccaggt tgc 23

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<211> 24

<212> DNA

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tggcccccct gctggtggcc gcca 24

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<211> 21

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ctttcaggtg agacgctttt g 21

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gatgtcctcg acctcgtcct tcag 24

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agtcgctgtt cgcggccgcg c 21

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<211> 24

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agacgcccgt cggttgcccg taca 24

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<211> 21

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agagtagttc cgtgttgccg a 21

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aatgccatct tgttctaatt cccg 24

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<211> 24

<212> DNA

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ttctttttta ttggataatc tcct 24

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<211> 22

<212> DNA

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aatttcattt tgcaacttct tt 22

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<211> 23

<212> DNA

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gtttgggtat tgggttgaca tat 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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caacacactc tcctgcaaca cgc 23

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<211> 22

<212> DNA

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tgaaatgccg gctgtgtgat ca 22

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<211> 23

<212> DNA

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gacccatacc tcaattgaga cgc 23

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tcaactcgct tatcaactgt aaaa 24

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acccgctggg aacaaccaga t 21

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<211> 21

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aattcttcgt caacagagat a 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gacctggacg aagaagggct gg 22

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<211> 21

<212> DNA

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ctttcctcaa gaatctgtct a 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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atgaaatatt aactaataaa ca 22

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<211> 22

<212> DNA

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accggccgaa cgcggcggct tc 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ctcctgctcg cgcagaaacc ggga 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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agaccgttat caccacaaac ggca 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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cgatgtatca acctgcttag tat 23

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<212> DNA

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gatgaatgta tgtttacaat gtt 23

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<211> 22

<212> DNA

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gggttaaagc cataaagaaa at 22

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aattttaccc ctcaatttta aaa 23

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<211> 23

<212> DNA

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ccgaccatgg cgatttacag tta 23

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<211> 23

<212> DNA

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ttccctgtat agaacgggtg cga 23

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<211> 21

<212> DNA

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taatccgcgg cgaaaaaaga c 21

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<211> 22

<212> DNA

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tcgtcaaatt aatggcgaca tc 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gaaacgactg cgactacaag gg 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gacgtcctcg atctcgtcct tca 23

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<211> 21

<212> DNA

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tctcctcgcg cggcccgagg g 21

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<211> 21

<212> DNA

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aacgtaattt tatcggccac c 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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atcttgatca tcatcatcag c 21

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<212> DNA

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gtcgcagcga tgacgataat ccct 24

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<211> 22

<212> DNA

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cgggatccca gcggtaggta gc 22

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<211> 21

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ttcaatatgc catttagccc t 21

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<212> DNA

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ccttcaaaat ggctctcccc act 23

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<211> 21

<212> DNA

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acttctcctc gcaatccagg a 21

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<212> DNA

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ctgaatcgca atttttttcc ctct 24

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<211> 22

<212> DNA

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ccttactgtc cacttggaac gg 22

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<211> 23

<212> DNA

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tgcaacactt cataaaagta gtt 23

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<211> 21

<212> DNA

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gccaaccatt ctgatagagc t 21

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<211> 23

<212> DNA

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ttagttaaat agttccattc tac 23

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<212> DNA

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aaggcgcatc caccagatga taac 24

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<211> 23

<212> DNA

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tcctgaggag gtgatcccgc caa 23

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<211> 21

<212> DNA

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<400> 301

ggccacagcc cgtcccgccg a 21

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<211> 21

<212> DNA

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ccagccgccg cgagctgcgc g 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ccaacgtctc tatacaattg g 21

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<211> 22

<212> DNA

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<400> 304

tccggtgcac cagcgtctcg ac 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 305

ggtcgtagac gcccgtcggt t 21

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<211> 22

<212> DNA

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acggtggagt actgcaacca gc 22

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<211> 24

<212> DNA

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gtattcaaag ggttttgagg tgaa 24

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<211> 22

<212> DNA

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gcctcgtgct tttaatgtct ca 22

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<211> 23

<212> DNA

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<400> 309

aggttggttt acgtaatttt att 23

<210> 310

<211> 21

<212> DNA

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aacaagcttt ttattatcta a 21

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<211> 21

<212> DNA

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ttgatagata taattgctgt c 21

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<211> 24

<212> DNA

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ccttgcaatt tcattgaaag ctct 24

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<211> 24

<212> DNA

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cagaggcaga acgttgtccg aagc 24

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<211> 24

<212> DNA

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gcaattattg tcgggatctt agtt 24

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<211> 23

<212> DNA

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ggggtctatc aaatgatcat cta 23

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<211> 24

<212> DNA

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cgaagtgttt tcaaacagga tgtt 24

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<211> 23

<212> DNA

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ccaccgcaca caggaacgtc ccc 23

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<211> 24

<212> DNA

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gtgaggacgg cgctgcgtgc ggcg 24

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<211> 23

<212> DNA

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gacgaattgc gcgccgcgct ggc 23

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<211> 23

<212> DNA

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ggccgatgtg tgacttttcg gcc 23

<210> 321

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 321

acccgggaag acggagaaac g 21

<210> 322

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 322

cgtgtttacg ggaggccgga ccaa 24

<210> 323

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 323

gtacgtccac aatgattgtg g 21

<210> 324

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 324

tgaagtattg tccaaagtga ttaa 24

<210> 325

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 325

aaagctggat ctaaaacatc ac 22

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<211> 0

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 326

<210> 327

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 327

gatgttggat cattcgttct gc 22

<210> 328

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 328

cctaaagtaa tgacaatcgt t 21

<210> 329

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 329

cggcgctctc tagcggaacc aaa 23

<210> 330

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 330

cagcaggccg atgtgcacca g 21

<210> 331

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 331

cggcagcttg tcgtccggta cgt 23

<210> 332

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 332

agccgcagcg ggcacggcaa tc 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ggcagccggg ctggaagtgg gag 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tctgccaatt tcacgatatc ttc 23

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tttcgtgaca agatgatcca g 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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cctatccctt taaaagagcc tgt 23

<210> 337

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

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taaccctgcc ttcctggcat cat 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

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aaaataaata ttgggattta ac 22

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<211> 24

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<213> artificial sequence

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acacagacaa aaacacgcca gaaa 24

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<211> 21

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<213> artificial sequence

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gatccacacc cggcaaattc c 21

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<213> artificial sequence

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tgaggagccg ccattgaaga tct 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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acgtgcctca atataatgcc aata 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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tattaattca attttataag cata 24

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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gctcgtttga cgacttcacg a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ttttagttca gctaccgtgg c 21

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 346

aggaccggat gtattccctt gcgg 24

<210> 347

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 347

gcggggctgt tggccacgac gga 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

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agggatttac ttggaacaac caaa 24

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<211> 23

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<400> 349

taaccggtaa cgcaactgtg gca 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 350

aactatagta gttagaacaa gt 22