一种非深加工食品的快速dna提取方法
阅读说明：本技术 一种非深加工食品的快速dna提取方法 (Rapid DNA extraction method for non-deep processed food ) 是由 顾越星 于 2021-01-13 设计创作，主要内容包括：一种非深加工食品的快速DNA提取方法,采用金属浴、涡旋振荡器、离心机、移液器、真空抽吸器和1.5ml离心管作为提取的工具；采用两个步骤提取DNA。本发明同样采用二步完成快速DNA提取,但省去了酸碱中和的步骤和增加了PCR抑制剂的去除的步骤,能从非深加工的食品样本通过清洗和裂解简单两步获得可用于DNA检测。本发明配合便携式离心机、预分装的基因检测试剂(如转基因、动物源性和致病菌检测试剂)和检测仪器,可实现60分钟内的现场检测方案(其中,DNA提取和快速基因检测反应各占20分钟和40分钟)。基于上述,本发明具有好的应用前景。(A rapid DNA extraction method for non-deep processed food adopts metal bath, vortex oscillator, centrifuge, pipettor, vacuum aspirator and 1.5ml centrifuge tube as extraction tools; two steps were used to extract DNA. The invention also adopts two steps to complete the rapid DNA extraction, but omits the step of acid-base neutralization and the step of adding the removal of PCR inhibitors, and can obtain the DNA from non-deep-processed food samples by two simple steps of washing and cracking. The invention can realize the field detection scheme within 60 minutes by matching with a portable centrifuge, a pre-packaged gene detection reagent (such as a transgene, animal-derived and pathogenic bacteria detection reagent) and a detection instrument (wherein, the DNA extraction and the rapid gene detection reaction respectively take 20 minutes and 40 minutes). Based on the above, the invention has good application prospect.)
技术领域
本发明涉及食品样本的DNA(脱氧核糖核酸)快速提取工艺领域，特别是一种非深加工食品的快速DNA提取方法。
背景技术
随着人民生活水平的不断提高，民众对潜在的食品安全问题(如转基因未标注，掺假，过敏源和致病菌等)越发重视。DNA(脱氧核糖核酸)检测技术，如荧光定量PCR(聚合酶链反应)技术和等温扩增(LAMP)技术，正在成为一种新的检测方法，可以实现快速的检测(甚至现场检测)，实现对常见食品安全隐患进行有效监控。整个检测方案需要先提取好DNA，再加入检测试剂后在检测仪器(如荧光定量聚合酶链反应仪或等温扩增仪)上完成检测。实际情况下，快速检测方案最好在1小时内完成，其中DNA提取控制在25分钟内，快速荧光定量PCR(聚合酶链反应)技术或等温扩增(LAMP)反应控制在35分钟内。
目前，市场上的DNA快速提取法是采用碱性化学裂解的方法，一般分为两步：第一步是在粉末样品或匀浆的食品样品中加入pH12以上的碱性裂解液，在80-100℃时加热3-10分钟，此时样品的细胞壁破裂并释放DNA进入裂解液上清中；第二步，对碱性裂解液加入稳定剂进行酸性中和或10倍以上中性缓冲液稀释来降低pH值。其中，碱性裂解法的第一步虽然非常快捷，但是具有pH值偏高和PCR抑制剂含量过高的问题，其结果体现在样品qPCR反应的Ct值偏大或者qPCR反应完全被抑制。为了克服这两个问题，所以裂解液需要采用第二步的酸性中和或稀释，让样品达到pH6-10范围内在再进入后续的荧光定量PCR反应。然而，酸性中和的效果很难达到批次一致，这是因为不同的样品成分本身的pH值就不同，同时第二步的微升级加样误差也不可避免。另外，第二步的中和反应或稀释会提高实际样品中的检测下限，对于含量很低掺假样品(如真假肉的0.1％掺假和转基因0.01％掺假)可能造成漏检。同时，PCR抑制剂(如油脂、多酚和多糖等)的问题依然存在，PCR反应抑制的现象是客观存在的，因此现有的检测方式还存在局限性。
发明内容
为了克服现有技术中，采用碱性裂解技术作为食品样本中快速提取DNA，存在中和效果不稳定及存在PCR(聚合酶链反应)抑制的弊端，本发明提供了直接将裂解液用于检测，检测中同样采用二步完成快速DNA提取，但省去了酸碱中和的步骤和增加了PCR抑制剂的去除的步骤，能从非深加工的食品样本通过清洗和裂解简单两步获得可用于DNA检测的一种非深加工食品的快速DNA提取方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种非深加工食品的快速DNA提取方法，采用金属浴、涡旋振荡器、离心机、移液器、真空抽吸器和1.5ml离心管作为提取的工具；其特征在于采用两个步骤提取DNA；第一步：将25-100mg检测食品粉末样本或匀浆样本加入1.5ml离心管内，然后把1ml洗涤液加入1.5ml离心管内，涡旋混匀后于37℃孵育10分钟，经6000g离心5分钟弃上清后保留沉淀；第二步：在含有离心沉淀的1.5ml离心管内加入含NaOH的600ul碱性裂解液，涡旋混匀后在95℃孵育5分钟，碱性裂解液在加热后破碎细胞壁释放DNA，5000g离心5分钟取上清备用并丢弃细胞残渣沉淀，取5ul上清加入20ul基因检测试剂进行检测或－20℃上清长期保存；第一步中，在洗涤液中添加了Triton X-100来去除油脂。
进一步地，所述步骤一中，Triton X-100在低温时能溶解蛋白质和脂质，通常在37℃孵育10分钟后，样品会变得相对澄清，油脂会呈现浮在液体表面的白色浮层，可用移液器或真空抽吸器吸除；食品样本中多具有大量蛋白质和油脂，Triton X-100洗涤液在37℃低温孵育时，Triton X-100洗涤液可溶解一部分盐离子、蛋白质和油脂，洗涤液经离心后丢弃，从而去除了一部分盐离子、蛋白质和油脂的PCR抑制成分。
进一步地，所述步骤二中，本发明采用动物样本时，动物样本碱性裂解液中降低NaOH浓度至10-50mM,PEG-200浓度减至5-20％，裂解液取5ul进行qPCR检测，采用植物样本时，在裂解液中添加聚乙烯吡咯烷酮(简称PVP)改善由多酚引起的PCR抑制，添加PVP可吸附一部分多酚来改善qPCR反应，植物样本明显被改善了PCR扩增效率。
本发明有益效果是：本发明能从非深加工(深加工食品为油炸或酸碱处理或纯化后产品)的食品样本(如转基因大豆、转基因大米、转基因玉米、各类水果、各类豆制品、各类肉制品、各类乳制品等)通过清洗和裂解简单两步获得可用于DNA检测的DNA样本。本发明同样采用二步完成快速DNA提取，但省去了酸碱中和的步骤和增加了PCR抑制剂的去除的步骤。本发明的第一步采用了含Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)去污剂清洗的步骤来去除油脂和盐离子的PCR抑制成分；第二步采用了碱性裂解液加热样品来裂解细胞壁来释放DNA，同时裂解液中添加聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)来改善多酚的PCR抑制，离心取5ul上清加入对应的20ul检测试剂中即可用于实现对目标基因的检测。本发明配合便携式离心机、预分装的基因检测试剂(如转基因、动物源性和致病菌检测试剂)和检测仪器(如荧光定量聚合酶链反应仪或等温扩增仪)，可实现60分钟内的现场检测方案(其中，DNA提取和快速基因检测反应各占20分钟和40分钟)。基于上述，本发明具有好的应用前景。
具体实施方式
一种非深加工食品的快速DNA提取方法，采用金属浴、涡旋振荡器、迷你离心机、移液器、真空抽吸器和1.5ml离心管作为提取的工具；采用两个步骤提取DNA。第一步，将25-100mg食品粉末样本或匀浆样本加入1.5ml离心管内，然后把1ml洗涤液加入1.5ml离心管内，涡旋混匀后于37℃孵育10分钟，经6000g离心5分钟弃上清后保留沉淀。步骤一中，通过在洗涤液中添加了Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)来去除油脂，Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂)，它在低温时能溶解蛋白质和脂质，通常在37℃孵育10分钟后，样品会变得相对澄清，油脂会呈现浮在液体表面的白色浮层，可用移液器或真空抽吸器吸除。食品样本中多具有大量蛋白质和油脂，Triton X-100洗涤液在37℃低温孵育时，Triton X-100洗涤液可溶解一部分盐离子、蛋白质和油脂，洗涤液经离心后丢弃，从而去除了一部分盐离子、蛋白质和油脂的PCR抑制成分。
经过第一步洗涤后的离心沉淀进入第二步，在含有离心沉淀的1.5ml离心管内加入含NaOH的600ul碱性裂解液，涡旋混匀后在95℃孵育5分钟，碱性裂解液在加热后破碎细胞壁释放DNA，5000g离心5分钟取上清备用并丢弃细胞残渣沉淀，取5ul上清加入20ul基因检测试剂进行检测或－20℃上清长期保存。目前现有技术，碱性裂解试剂主要由NaOH(氢氧化钠)溶液来实现，如Thermofisher的ExtractAll试剂。在加热的条件下，碱性溶液可以裂解细胞壁，同时裂解RNA(核糖核酸)，而DNA(脱氧核糖核酸)片段可以保留下来；但是，由于NaOH(氢氧化钠)裂解液碱性过强会过度碎片化DNA片段，同时会抑制DNA(脱氧核糖核酸)检测试剂中DNA(脱氧核糖核酸)聚合酶扩增DNA(脱氧核糖核酸)序列的工作效率，因此需要在检测前对裂解液进行中和至pH 7-10的范围内再进行检测应用。反之，碱性太弱，细胞裂解不充分，细胞释放的DNA(脱氧核糖核酸)太少，导致检测到的DNA(脱氧核糖核酸)偏少。现有技术NaOH裂解液浓度多在10-300mM范围内，然而50-300mM的裂解液取5ul进行qPCR检测，出现明显的PCR抑制现象。Thermofisher的ExtractAll裂解液采用等体积的稳定剂来中和裂解液后确保PCR扩增的效率。另一种方法是通过Tris缓冲液稀释裂解液10倍以上来降低裂解液的pH值来确保PCR的扩增效率Chomczynski(2006)的发明发明省去了碱性裂解液中和的步骤，主要在25mM KOH碱性裂解液中添加60％PEG-200可提高pH值到达pH12以上，但按此配方进行qPCR反应还是具有PCR抑制的现象。本实施例通过在动物样本碱性裂解液中降低NaOH浓度至10-50mM,PEG-200浓度减至5-20％，裂解液取5ul进行qPCR检测，未出现明显的PCR抑制现象。然而，对于植物样本的裂解液取5ul进行qPCR检测，出现明显的PCR抑制现象。植物组织中的多酚含量较多，是常见的PCR抑制剂之一。本实施例通过在裂解液中添加了聚乙烯吡咯烷酮(简称PVP)改善由多酚引起的PCR(聚合酶链反应)抑制。聚乙烯吡咯烷酮可与多酚基团反应以保护DNA(脱氧核糖核酸)免受相互作用。在碱性裂解液中添加PVP可吸附一部分多酚来改善qPCR反应，部分样品如苹果明显被改善了PCR扩增效率。本实施例通过添加NaOH、PEG200和PVP三种主要成分优化了裂解液配方，其样品裂解液可直接用于qPCR反应或－20℃长期保存。
本发明能从非深加工(深加工食品为油炸或酸碱处理或纯化后产品)的食品样本(如转基因大豆、转基因大米、转基因玉米、各类水果、各类豆制品、各类肉制品、各类乳制品等)通过清洗和裂解简单两步获得可用于DNA检测的DNA样本。本发明同样采用二步完成快速DNA提取，但省去了酸碱中和的步骤和增加了PCR抑制剂的去除的步骤。本发明的第一步采用了含Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)去污剂清洗的步骤来去除油脂和盐离子的PCR抑制成分；第二步采用了碱性裂解液加热样品来裂解细胞壁来释放DNA，同时裂解液中添加聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)来改善多酚的PCR抑制，离心取5ul上清加入对应的20ul检测试剂中即可用于实现对目标基因的检测。本发明配合便携式离心机、预分装的基因检测试剂(如转基因、动物源性和致病菌检测试剂)和检测仪器(如荧光定量聚合酶链反应仪或等温扩增仪)，可实现60分钟内的现场检测方案(其中，DNA提取和快速基因检测反应各占20分钟和40分钟)。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种生物制品的痕量DNA提取方法