用于肾病症的草酸钙结晶抑制剂
阅读说明：本技术 用于肾病症的草酸钙结晶抑制剂 (Calcium oxalate crystallization inhibitors for renal disorders ) 是由 马蒂亚斯·伊曼纽尔·伊瓦松 让-克里斯托夫·勒鲁 安娜·克莱茨迈尔 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及包含由共同的中央接头连接的两个或更多个环己醇五酯部分的肌醇衍生物及其在与病理性结晶相关的病情的治疗或预防中的用途。本发明进一步涉及本发明化合物的合成中有用的中间体。(The present invention relates to inositol derivatives comprising two or more cyclohexanol pentaester moieties connected by a common central linker and their use in the treatment or prevention of conditions associated with pathological crystallization. The invention further relates to intermediates useful in the synthesis of the compounds of the invention.)
背景技术
肾结石是肾脏组织中的矿物质沉积物，是由于尿液中某些矿物质过饱和而形成的。肾结石的患病率很高，高达14.8％，并且具有巨大的复发风险。此外，由于生活方式、饮食的改变以及诸如肥胖、糖尿病和高血压等相关风险因素的发生率增加，其发病率正在上升。
导致肾结石形成的根本原因多种多样。然而，大多数肾结石的一种常见成分是草酸钙(CaOx)。肾脏中的CaOx结晶和结石形成可物理上阻塞小管，引起组织炎症和纤维化，并且损害器官功能，从而产生发展慢性肾脏疾病和终末期肾脏疾病的风险。
在肾脏中具有临床重要性的另一钙沉淀物是磷酸钙。主要由(50％或更多)磷酸钙组成的肾结石占所有结石的高达10％并且占钙结石的15％-20％，钙结石的80％由草酸钙组成。磷酸钙也是高达30％草酸钙结石中的次要成分。
诸如高草酸尿症、Dent病或Bartter综合征等不同疾病可以导致CaOx肾结石形成。例如，在原发性高草酸尿症的情况下，由于草酸盐代谢中涉及的肝蛋白的缺乏或功能异常而产生过量的草酸盐。尿液中的高草酸盐负载会导致肾小管中CaOx结晶、肾结石形成并因此损害组织。患者在年轻时患有肾衰竭和终末期肾脏疾病。由于治疗选择有限，80％的患者需要在30岁时进行肝肾联合移植。
迄今为止，肾结石患者的治疗选择仅仅是姑息性的，并且远不能改变疾病，因此使患者处于结石复发和严重并发症(例如慢性肾脏疾病和终末期肾脏疾病)的风险中。现有的结石可通过外科手术去除，并伴随与肾结石相关的疼痛的医疗管理。但是，复发率高且预防性措施有限。对于尿钙水平高的患者的建议措施包括高液体摄入、适应性营养和噻嗪类药物。
尽管已建议使用CaOx结晶抑制剂(例如柠檬酸盐或磷酸盐等)来预防肾结石形成，但功效有限和不良副作用限制了它们在临床中的应用。柠檬酸盐作为预防性措施在复发性CaOx结石患者中已显示出一些功效，但其作用方式仍不清楚。
综上所述，一种能够降低CaOx晶体成核、生长和对肾上皮细胞粘附的倾向并最终独立于根本原因减少肾脏损害的药剂将具有重要的治疗价值。尿中CaOx结晶的有效抑制剂可适用于与肾结石形成有关的多种病症，并可以降低进一步严重并发症的风险。
基于上述现有技术，本发明的目的是提供用于在与病理性草酸钙结晶有关的病情下治疗或预防草酸钙和/或磷酸钙结晶的药物化合物。该目的是通过本说明书的独立权利要求的主题来实现的。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种化合物，其包含通过共同的中央接头L连接的两个或更多个由通式(I)描述的环己醇五酯部分，
其中X选自OPO3 2-、OPSO2 2-或OSO3 -，L是共同的中央接头，其连接了n个由方括号中通式表征的个体部分并且n为整数2至10。
在某些实施方式中，所述化合物由通式(II)、(III)或(IV)描述，
应当理解的是，本发明的任何化合物，在本文中定义为带负电荷的化合物时，将与药学上可接受的抗衡离子缔合。
本发明的第二方面涉及本文所述化合物用于治疗与钙和/或镁沉淀物的结晶或形成有关的病理学的用途。
同样，本发明涉及本文所述化合物用于治疗与草酸盐沉淀物的结晶或形成相关的病理学的用途。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的至少一血吸虫本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
术语和定义
在本说明书的上下文中，术语C1-C4烷基表示具有1、2、3或4个碳原子的饱和直链或支链烃，其中在某些实施方式中，一个碳-碳键可以是不饱和的并且一个CH2部分可以交换成氧(醚桥)或氮(NH或NR，R为甲基、乙基或正丙基或异丙基；氨基桥)。C1-C4烷基的非限制性例子是甲基、乙基、丙基、丙-2-烯基、正丁基、2-甲基丙基、叔丁基、丁-3-烯基、丙-2-炔基和丁-3-炔基。在某些实施方式中，C1-C4烷基是甲基、乙基、丙基或丁基部分。
在本说明书的上下文中，C1-C6烷基表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的饱和直链或支链烃，其中一个碳-碳键可以是不饱和的并且一个CH2部分可以交换为氧(醚桥)或氮(NH或NR，R为甲基、乙基或正丙基或异丙基；氨基桥)。C1-C6烷基的非限制性例子包括以上为C1-C4烷基给出的例子并且附加地包括3-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-3-烯基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、戊-4-炔基、3-甲基-2-丙基和4-甲基-2-戊基。在某些实施方式中，C5烷基是戊基或环戊基部分，并且C6烷基是己基或环己基部分。
当本文中在狭义上使用时，如果用作分子各部分之间的桥，术语未取代的Cn烷基是指部分-CnH2n-，或如果在末端部分的背景下使用，则是指-CnH2n+1。如果存在环状结构或者一个或多个(非芳香族)双键，则它仍可含有更少的H原子。
术语未取代的Cn烷基和取代的Cn烷基包括包含或连接至环状结构的直链烷基，例如环戊烷、环丁烷、环戊烷或环己烷部分，根据所提及的注解或上下文是未取代的或取代的，具有直链烷基取代基。直链或环状结构中的碳与(在适合情况下的)N、O或其它杂原子的总数之和为n。
当在化学式中使用的情况下，可以使用下列缩写：Me是甲基CH3，Et是乙基-CH2CH3，Prop是丙基-(CH2)2CH3(正丙基，n-pr)或-CH(CH3)2(异丙基，i-pr)，but为丁基-C4H9、-(CH2)3CH3、-CHCH3CH2CH3、-CH2CH(CH3)2或-C(CH3)3。
在本说明书的上下文中，术语C4-C7环烷基涉及具有4、5、6或7个碳原子的饱和烃环，其中在某些实施方式中，一个碳-碳键可以是不饱和的并且一个CH2部分可以交换为氧(醚桥)或氮(NH或NR，R为甲基、乙基或丙基；氨基桥)。C4-C7环烷基部分的非限制性例子包括环丙烷基(-C4H7)、环戊烯基(C5H9)和环己烯基(C6H11)部分。在某些实施方式中，环烷基被一个C1至C4未取代的烷基部分取代。在某些实施方式中，环烷基被多于一个C1至C4未取代的烷基部分取代。
术语取代的烷基在其最广义上是指最广义上如上定义的烷基，该烷基共价地连接到不同碳或氢的原子，特别是连接至从N、O、F、B、Si、P、S、Cl、Br和I中选择的原子，在适用的情况下，该原子本身可以连接至该基团的一个或多个其它原子、或连接至氢、或连接至不饱和或饱和烃(最广义上的烷基或芳基)。从狭义上讲，取代的烷基是指最广义上的如上定义的烷基，其在一个或多个碳原子上被选自下述的基团取代：胺NH2、烷基胺NHR、酰亚胺NH、烷基酰亚胺NR、氨基(羧烷基)NHCOR或NRCOR、羟基OH、氧烷基OR、氧(羧烷基)OCOR、羰基O及其缩酮或缩醛(OR)2、腈CN、异腈NC、氰酸酯CNO、异氰酸酯NCO、硫氰酸酯CNS、异硫氰酸酯NCS、氟F、氯Cl、溴Br、碘I、膦酸酯PO3H2、PO3R2、磷酸酯OPO3H2和OPO3R2、巯基SH、磺烷基SR、亚砜SOR、磺酰基SO2R、磺酰胺SO2NHR、硫酸SO3H和硫酸酯SO3R，其中在本段中使用的R取代基与说明书正文中指定给R的其它用途不同，从最广泛的意义上讲，其本身是未取代或取代的C1至C12烷基，并且在更狭义上，R是甲基、乙基或丙基，除非另有说明。
术语氨基取代的烷基或羟基取代的烷基是指被一个或多个胺或羟基NH2、NHR、NR2或OH修饰的根据上述定义的烷基，其中在本段中使用的R取代基与说明书正文中指定给R的其它用途不同，从最广义上讲，其本身是未取代或取代的C1至C12烷基，并且在更狭义上，R是甲基、乙基或丙基，除非另有说明。具有多于一个碳的烷基可以包含多于一个胺或羟基。除非另有说明，否则术语“取代的烷基”是指除与烷基链、末端甲基或氢键合之外，每个C仅被至多一个胺或羟基取代的烷基。
术语羧基取代的烷基是指被一个或多个羧基COOH或其衍生物(特别是羧酰胺CONH2、CONHR和CONR2，或羧酸酯COOR，其中R具有前段所述的含义，并且与本说明书正文中指定给R的其它含义不同)修饰的根据上述定义的烷基。
氨基取代的烷基的非限制性实例包括-CH2NH2、-CH2NHMe、-CH2NHEt、-CH2CH2NH2、-CH2CH2NHMe、-CH2CH2NHEt、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHMe、-(CH2)3NHEt、-CH2CH(NH2)CH3、-CH2CH(NHMe)CH3、-CH2CH(NHEt)CH3、-(CH2)3CH2NH2、-(CH2)3CH2NHMe、-(CH2)3CH2NHEt、-CH(CH2NH2)CH2CH3、-CH(CH2NHMe)CH2CH3、-CH(CH2NHEt)CH2CH3、-CH2CH(CH2NH2)CH3、-CH2CH(CH2NHMe)CH3、-CH2CH(CH2NHEt)CH3、-CH(NH2)(CH2)2NH2、-CH(NHMe)(CH2)2NHMe、-CH(NHEt)(CH2)2NHEt、-CH2CH(NH2)CH2NH2、-CH2CH(NHMe)CH2NHMe、-CH2CH(NHEt)CH2NHEt、-CH2CH(NH2)(CH2)2NH2、-CH2CH(NHMe)(CH2)2NHMe、-CH2CH(NHEt)(CH2)2NHEt、-CH2CH(CH2NH2)2、-CH2CH(CH2NHMe)2和-CH2CH(CH2NHEt)2(对于末端基团)以及-CH2CHNH2-、-CH2CHNHMe-、-CH2CHNHEt-(对于桥接两个其它部分的氨基取代的烷基部分)。
羟基取代的烷基的非限制性实例包括-CH2OH、-(CH2)2OH、-(CH2)3OH、-CH2CH(OH)CH3、-(CH2)4OH、-CH(CH2OH)CH2CH3、-CH2CH(CH2OH)CH3、-CH(OH)(CH2)2OH、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH2CH(OH)(CH2)2OH和-CH2CH(CH2OH)2(对于本端部分)以及-CHOH-、-CH2CHOH-、-CH2CH(OH)CH2-、-(CH2)2CHOHCH2-、-CH(CH2OH)CH2CH2-、-CH2CH(CH2OH)CH2-、-CH(OH)(CH2CHOH-、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH2CH(OH)(CH2)2OH和-CH2CHCH2OHCHOH-(对于桥接两个其它部分的羟基取代的烷基部分)。
术语卤素取代的烷基是指被一个或多个选自(独立地)F、Cl、Br、I的卤素原子修饰的根据以上定义的烷基。
术语氟取代的烷基是指被一个或多个氟化物基团F修饰的根据以上定义的烷基。氟取代的烷基的非限制性实例包括-CH2F、-CHF2、-CF3、-(CH2)2F、-(CHF)2H、-(CHF)2F、-C2F5、-(CH2)3F、-(CHF)3H、-(CHF)3F、-C3F7、-(CH2)4F、-(CHF)4H、-(CHF)4F和-C4F9。
羟基和氟取代的烷基的非限制性实例包括-CHFCH2OH、-CF2CH2OH、-(CHF)2CH2OH、-(CF2)2CH2OH、-(CHF)3CH2OH、-(CF2)3CH2OH、-(CH2)3OH、-CF2CH(OH)CH3、-CF2CH(OH)CF3、-CF(CH2OH)CHFCH3和-CF(CH2OH)CHFCF3。
在本说明书的上下文中，术语芳基表示可以包含杂原子(例如N、O、S)的环状芳族C5-C10烃。芳基的实例包括但不限于苯基和萘基，以及任何杂芳基。杂芳基是包含一个或多个氮、氧和/或硫原子的芳基。杂芳基的实例包括但不限于吡咯、噻吩、呋喃、咪唑、吡唑、噻唑、恶唑、吡啶、嘧啶、噻嗪、喹啉、苯并呋喃和吲哚。在本说明书的上下文中，芳基或杂芳基可以附加地被一个或多个烷基取代。
如本文所用，术语药物组合物是指本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体。在某些实施方式中，根据本发明的药物组合物提供为适合局部、肠胃外或注射给药的形式。
如本文所用，术语药学上可接受的载体包括任何溶剂、分散介质、包衣料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，如本领域技术人员所知(参见例如Remington:the Science and Practice of Pharmacy,ISBN 0857110624)。
本发明的第一方面涉及一种化合物，其包含通过共同的中央接头L连接的两个或更多个由通式(I)描述的环己醇五酯部分，
其中X选自OPO3 2-、OPSO2 2-或OSO3 -，L是共同的中央接头，其连接了n个由方括号中通式表征的个体部分并且n为整数2至10。
式I和本文其它地方中的直线旨在指示单个环碳原子的立体化学是不确定的。该式旨在包含任何非对映异构体。
在某些实施方式中，n的值为2至8。在某些实施方式中，n的值为2。在某些实施方式中，n的值为3。在某些实施方式中，n的值为4。在某些实施方式中，n的值为6。在某些实施方式中，n的值为8。
在某些特定的实施方式中，n选自2、3和4。
在某些实施方式中，所述中央接头部分L包含直链或支链聚(乙二醇)或聚甘油，或者由其组成。在某些实施方式中，所述中央接头部分L包含直链或支链烷基或者由其组成。
在某些实施方式中，连接部分L的分子量<1000g/mol，特别是<700g/mol，更特别是<500g/mol，或甚至<400g/mol。
在某些实施方式中，本发明的化合物由如上定义的中央接头L与两个或更多个通式(I)描述的部分组成。
在某些实施方式中，包含在根据本发明化合物中的任何部分(I)的X的任一个独立于任何其它X选自OPO3 2-、OPSO2 2-或OSO3 -。
在某些实施方式中，包含在根据本发明化合物中的任何特定部分(I)的所有X均是相同的，并且选自OPO3 2-、OPSO2 2-或OSO3 -。
在某些实施方式中，包含在根据本发明化合物中的所有部分(I)的所有X为OPO3 2-。
在某些实施方式中，包含在根据本发明化合物中的所有部分(I)的所有X为OPSO2 2-。
在某些实施方式中，包含在根据本发明化合物中的所有部分(I)的所有X为OSO3 -。
在某些实施方式中，连接部分包含直链或支链聚(乙二醇)或聚甘油或由其组成，该直链或支链聚(乙二醇)或聚甘油的摩尔质量<1000g/mol，特别是<700g/mol，更特别是<500g/mol，或甚至<400g/mol。
在某些实施方式中，所述连接部分包含中央核A，在其上连接有分离式(I)的环己醇酯部分的聚甘油或聚(乙二醇)链。
在某些实施方式中，中央核A(如果存在)可以选自取代或未取代的C1至C4烷基、取代或未取代的C4至C7环烷基、或取代或未取代的五元或六元芳基。
该连接部分通常是简单的在代谢上相容的接头，其设计用于以相对较低的成本和易于合成的方式促进化合物中两个或多个环己醇五酯部分的组装。在某些实施方式中，所述接头部分可以是被氢以外的取代基取代的烃，例如被从氧、氮、氟或药物化学领域已知的其它取代基中选择的一个或多个取代基取代，以调节化合物的吸收、分布、代谢过程、排泄或毒性质量。
对于其中连接部分L为或包含取代的C1至C4烷基、取代的C4至C7环烷基或取代的五元或六元芳基的实施方式，所述取代叵以是一个或多个包含氧的官能团(非限制性例子：-OH或＝O)、一个或多个包含氮的官能团(非限制性例子：NH2、NHRN、NRN 2，RN选自未取代的C1至C4烷基)、一个或多个氟取代基、或者氧、氮或氟取代基的任何组合。
在由通式(I)描述的化合物的某些实施方式中，连接部分L是肽接头。式(I)描述的部分可以共价连接至蛋白原氨基酸的侧链，特别是具有促进环己醇酯部分化学连接的侧链的蛋白原氨基酸。这种具有有利的连接功能的氨基酸的实例是但不限于丝氨酸和苏氨酸。
在某些实施方式中，通式(I)描述的环己醇五酯部分的任何一个独立地选自(Ia)和(Ib)，
其中每个X(独立地)具有上述含义，并且其中L是连接部分。在某些实施方式中，所述化合物由通式(II)描述，
其中，每个X独立于任何其它X，可以是OPO3 2-、OPSO2 2-、OSO3 -或CO2 -，并且其中L是如上详述的共同的中央接头(在本文中也称为“连接部分”)。
在某些实施方式中，所述化合物由通式(IIi)、(IIii)或(IIiii)描述：
其中，每个X独立于任何其它X，可以是OPO3 2-、OPSO2 2-、OSO3 -或CO2 -，并且其中L是如上详述的共同的中央接头(在本文中也称为“连接部分”)。
在某些实施方式中，所述化合物由通式(II)、(IIi)、(IIii)或(IIiii)描述，其中连接部分L选自于由式-(O-CH2-CH2)m-O-描述的聚(乙二醇)，并且m具有1至12之间的值。在特定的实施方式中，n选自2、3或4。
在某些实施方式中，连接部分L选自于由式-(O-CH2-CH(OH)-CH2)m-O-描述的聚甘油，并且m具有1至12之间的值。在特定的实施方式中，m选自2、3或4。
在某些实施方式中，通式(I)描述的所有部分为(Ia)或(Ib)。
在某些实施方式中，所述化合物由式(II)、(IIi)、(IIii)或(IIiii)描述，每个X为OPO3 2-并且连接部分L为直链聚(乙二醇)或聚甘油。
在某些实施方式中，式(II)、(IIi)、(IIii)或(Iiiii)描述的化合物的分子量为1000g/mol至1500g/mol。
在某些实施方式中，所述化合物由式(II)、(IIi)、(IIii)或(IIiii)描述，每个X为OPO3 2-，连接部分L为直链聚(乙二醇)或聚甘油并且所述化合物的分子量为1000g/mol至1500g/mol。
在某些实施方式中，所述化合物由通式(IIiv)、(IIv)或(IIvi)描述：
其中L为如上详述的共同的中央接头(在本文中也称为“连接部分”)。在某些实施方式中，所述化合物由通式(IIvii)、(IIviii)或(IIix)描述：
在某些实施方式中，所述化合物由式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(lId)描述：
在某些实施方式中，所述化合物由式(IIe)或(IIf)描述：
在某些实施方式中，化合物(IIa)(OEG2-(IP5*)2)和(IIb)(OEG2-(IP5)2)的分子质量为1204.04g/mol。在一个实施方式中，化合物(lIe)(PO1-1)和(IIe)的分子质量为1298.15g/mol。在一个实施方式中，化合物(IId)(OEG8-(IP5)2)和(IIf)的分子质量为1474.36g/mol。
在某些实施方式中，所述化合物由式(IIk)、(IIm)或(IIn)描述：
在某些实施方式中，本发明的化合物通过式(IIg)、(IIh)或(IIj)来描述：
其中，k为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。
在某些实施方式中，通过通式(III)来描述本发明的化合物，
其中，每个X独立于任何其它X，可以是OPO3 2-、OPSO2 2-或OSO3 -，并且其中L是如上详述的共同的中央接头(在本文中也称为“连接部分”)。
在(III)描述的化合物的某些实施方式中，连接部分L由通式(IIIa)描述：
其中o、p和q彼此独立地具有1至12之间的值，并且o、p和q的总和<30。
在某些实施方式中，A选自碳原子(C)，羟基-、氨基-、卤素-或羧基-取代或未取代的C4至C7环烷基部分，或羟基-、氨基-、卤素-或羧基-取代或未取代的芳基。在某些实施方式中，A为碳原子。
在某些实施方式中，R选自H和C1-C3未取代的或N-、O和/或卤素取代的烷基。在某些实施方式中，为H或未取代的烷基。
在(III)的某些特定实施方式中，L由(IIIa)描述并且o、p和q彼此独立地具有值2至4。
在(III)的某些特定实施方式中，L由(IIIa)描述并且o、p和q的总和≤15。
在(III)的某些特定实施方式中，L由(IIIa)描述，o、p和q彼此独立地具有值2至4并且o、p和q的总和≤15。
在某些实施方式中，R选自H和C1-C3未取代的或N-、O和/或卤素取代的烷基。在某些特定实施方式中，R为H或未取代的烷基。
在化合物(III)的某些实施方式中，通过通式(IIIb)来描述连接部分L，
其中，o、p和q彼此独立地具有1至12之间的值，并且o、p和q的总和≤30。
在某些实施方式中，A选自碳原子(C)，羟基-、氨基-、卤素-或羧基-取代或未取代的C4至C7环烷基部分，或羟基-、氨基-、卤素-或羧基-取代或未取代的芳基。在某些实施方式中，A为碳原子。
在某些实施方式中，R选自H和C1-C3未取代的或N-、O和/或卤素取代的烷基。在某些实施方式中，为H或未取代的烷基。
在(III)的某些特定实施方式中，L由(IIIb)描述并且o、p和q彼此独立地具有值2至4。
在(III)的某些特定实施方式中，L由(IIIb)描述并且o、p和q的总和≤15。
在(III)的某些特定实施方式中，L由(IIIb)描述，o、p和q彼此独立地具有值2至4并且o、p和q的总和≤15。
在(III)的某些实施方式中，L由(IIIa)或(IIIb)描述并且A为碳原子。在(III)的某些实施方式中，L由(IIIa)或(IIIb)描述并且A选自取代的或未取代的C1至C4烷基。在(III)的某些实施方式中，L由(IIIa)或(IIIb)描述并且A选自取代的或未取代的C4至C7环烷基。在(III)的某些实施方式中，L由(IIIa)或(IIIb)描述并且A选自取代的或未取代的五元或六元芳基。
在化合物(III)的某些实施方式中，连接部分L由通式(IIIc)描述，
其中，式(IIIb)中的A为碳原子(C)并且u、v和w彼此独立地具有值1至12，特别地u、v和w彼此独立地具有值2至4；u、v和w的总和≤30，特别地u、v和w的总和≤12。
在某些实施方式中，R选自H和C1-C3未取代的或N-、O和/或卤素取代的烷基，特别地，其中R为H或未取代的烷基。
在某些实施方式中，通式(III)描述的化合物的分子量为1500至2500g/mol。
在某些实施方式中，通过式(IIId)或(IIIe)来描述所述化合物：
在一个实施方式中，化合物(IIId)((OEG)3-(IP5)3)的分子量为1922.21g/mol。在一个实施方式中，化合物(IIIe)((OEG4)3-(IP5)3)的分子量为2318.69g/mol。
在某些实施方式中，通过通式(IV)来描述所述化合物，
其中每个X独立于任何其它X，可以是OPO3 2-、OPSO2 2-或OSO3 -，并且其中L是如上详述的共同的中央接头(在本文中也称为“连接部分”)。
在通式(IV)描述的化合物的某些实施方式中，连接部分L由下式描述，
其中o、p、q和s彼此独立地具有值1至12并且o、p、q和s的总和≤40。
在某些实施方式中，A选自碳原子(C)、羟基-、氨基-、卤素-或羧基-取代或未取代的C4至C7环烷基部分，或羟基-、氨基-、卤素-或羧基-取代或未取代的芳基。在某些实施方式中，A为碳原子。
在某些实施方式中，o、p、q和s彼此独立地具有值2至4。在某些特定实施方式中，o、p、q和s的总和≤20。
在某些特定实施方式中，o、p、q和s彼此独立地具有值2至4并且o、p、q和s的总和≤20。
在由(IV)描述的化合物的某些实施方式中，L为(IVa)且A选自取代的或未取代的C1至C4烷基。在某些实施方式中，L为(IVa)且A选自取代的或未取代的C4至C7环烷基。在某些实施方式中，L为(IVa)并且A选自取代的或未取代的五元或六元芳基。
在通式(IV)描述的化合物的某些实施方式中，连接部分L由下式描述，
其中o、p、q和s彼此独立地具有值1至12，特别地o、p、q和s彼此独立地具有值2至4并且o、p、q和s的总和≤40，特别地，其中o、p、q和s的总和≤20。
在通式(IV)描述的化合物的某些实施方式中，连接部分L由下式描述，
其中，式(IVb)的A是碳原子(C)并且u、v、w和y彼此独立地具有值1至12，特别地u、v、w和y彼此独立地具有值2至4，并且u、v、w和y的总和≤40，特别地其中u、v、w和y的总和≤12。
在某些实施方式中，通式(IV)描述的化合物的分子量为2500至3000g/mol。
在某些实施方式中，通过式(IVd)或(IVe)来描述所述所述化合物，
在某些实施方式中，本发明的化合物提供为钠盐。在某些实施方式中，本发明的化合物提供为钾盐。在某些实施方式中，本发明的化合物提供为镁盐。
本发明进一步涵盖在本发明化合物的合成中有用的中间产物，特别是通式Va、Vb或Vc描述的化合物，
其中OPMB表示O-(双-对甲氧基苄基)磷酸酯部分，并且其中k为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。
在本发明的合成中有用的另一化合物由式VIa、VIb或VIc描述：
其中k为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。
在一个实施方式中，化合物(IVd)((OEG)4-(IP5)4)的分子量为2520.20g/mol。在一个实施方式中，化合物(IVe)((OEG4)4-(IP5)4)的分子量为3048.84g/mol。
本发明的另一方面涉及本发明的化合物作为药物的用途。
本发明的第二方面涉及本发明的化合物用于与病理性结晶(特别是钙盐的病理性结晶且更特别是草酸钙和/或磷酸钙盐的病理性结晶)相关的病情的治疗或预防。
在最广义上，根据本发明的化合物的此种用途涵盖根据本发明第一方面的本文上述任何化合物的用途，而且涵盖化合物在结构上稍宽的化学空间，该化合物包含由共同的中央接头L连接的两个或更多个通式(I)描述的环己醇五酯部分，特别地由其组成，
其中X选自OPO3 2-、OPSO2 2-、OSO3 -或CO2 -，n为整数2至10，其中L为包含或由直链或支链烷基组成的连接部分，该烷基任选地被氧、氮、(氟)取代，特别地其中，该连接部分的分子量<1000g/mol，特别地<700g/mol，更特别地<500g/mol，或甚至<400g/mol。
在某些实施方式中，用于治疗或预防与病理性结晶相关的病情的此类化合物包含2、3、4、6或8个根据通式(I)的部分。在某些特定实施方式中，在分子中包含2、3或4个此种部分。
在某些实施方式中，本发明的用于治疗或预防与病理性结晶相关的病情的化合物由式(VII)描述，
其中k为1至20的整数，特别是1至10，更特别是选自1、2、3、4、5或6的整数。
本发明的化合物对其特别有用的、患者中与由病理性草酸钙或磷酸钙结晶引起的病理性钙结晶相关的病症包括肾钙质沉着症、肾石病、皮肤钙质沉着症、肾结石、心血管病死亡(特别是在慢性肾脏疾病患者中)、慢性肾脏疾病的进展和肾移植失败。已经证明，病理性结晶与慢性肾脏病患者的发病率有关，特别是其中，所述病情为原发性和继发性高草酸尿症、登特病、巴特综合征、远端肾小管酸中毒、神经源性膀胱、常染色体显性遗传多囊肾、草酸钙肾结石形成、鸟粪石和肾钙化。因此，本发明的化合物通常用于慢性肾脏疾病患者。
显示出特别高活性的本发明的一个实施方式是使用对于上列适应症具有相烦CaOx抑制功效(图2)的新型二价IP5化合物(OEG4-(IP5)2、OEG8-(IP5)2、OEG2-(IP5)2)。发明人先前开发出了基于六磷酸肌醇(IP6)类似物的一系列小分子(PCT/EP2012/004088，PCT/EP2016/080657)，其可以减少人类尿液中CaOx晶体的成核和生长，并且具有改善的药代动力学(PK)特性。另外，这些化合物已显示可防止CaOx晶体粘附至肾上皮细胞，并在体外CaOx处理时显示出细胞保护作用。尽管这些最初的IP6类似物未能在体内可达到的浓度范围内完全抑制CaOx结晶，但发明人惊奇地发现，抑制CaOx结晶的能力高度依赖于IP5部分的组合。因此，发明人通过使用寡(乙二醇)接头(OEG)连接两个肌醇五磷酸酯(IP5)分子，开发了新型多价IP5化合物，从而增加了分子的总负电荷。与先前开发的最有效的化合物IP5-单-PEG2(OEG2-IP5)相比，由三(乙二醇)连接的双-IP5的化合物OEG4-(IP5)2显示，在将CaOx结晶抑制至低于对照50％的效力上提高了2500倍(图1)。该结论来自于测量人尿中CaOx结晶倾向的体外测定的结果。
所述化合物可配制成静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、局部、膀胱内或尤其是皮下给药。任选地，可以存在药学上可接受的载体和/或赋形剂。
根据本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防任一上列与病理性钙结晶相关的病情的方法，包含向有此需求的受试者给药任一上式详述的化合物。
本领域技术人员了解，本文明确提及的任何化合物都将以该化合物的药学上可接受的盐的形式存在。药学上可接受的盐包含离子化的化合物和带相反电荷的抗衡离子。药学上可接受的阳离子盐形式的非限制性实例包括铝、苄星、乙二胺、赖氨酸、镁、葡甲胺、钾、普鲁卡因、钠、氨丁三醇和锌。
药物组合物和给药
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。在进一步的实施方式中，所述组合物包含至少两种药学上可接受的载体，诸如本文描述的那些。
在本发明的某些实施方式中，通常将本发明的化合物配制成药物剂型，以提供易于控制的药物剂量并且为患者提供优雅且易于操作的产品。
所述药物组合物可以被配制成用于口服给药、胃肠外给药或直肠给药。此外，本发明的药物组合物可以制成固体形式(包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂或栓剂)或液体形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)。本发明化合物的剂量方案将取决于已知因素而变化，诸如特定药剂的药效学特性及其给药方式和途径；接收者的种类、年龄、性别、健康状况、医疗状况和体重；症状的性质和程度；并发治疗的种类；治疗频率；给药途径，患者的肾和肝功能以及所需的效果。在某些实施方式中，本发明的化合物可以每日单剂量，或者每日总剂量可以分每日两次、三或四次给药。
在某些实施方式中，对于约50-70kg的受试者，本发明的药物组合物或组合可以以约1-1000mg活性成分的单位剂量存在。化合物、药物组合物或其组合的治疗有效量取决于受试者的种类、体重、年龄和个人情况、所治疗的病症或疾病或其严重程度。具有普通技能的医师、临床医生或兽医可以容易地确定为预防、治疗或抑制病症或疾病进展所必需的每种活性成分的有效量。
本发明的药物组合物可以进行常规的制药操作(例如灭菌)和/或可以含有常规惰性稀释剂、润滑剂或缓冲剂以及佐剂，诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂和缓冲剂等。它们可以通过标准工艺生产，例如通过常规的混合、制粒、溶解或冻干工艺。用于制备药物组合物的许多这样的程序和方法在本领域中是已知的，参见例如L.Lachman et al.TheTheory and Practice of Industrial Pharmacy,第4版,2013(ISBN 8123922892)。
本文无论何处将单个可分离的特征的替代方案布置为“实施方式”，应当理解的是，此类替代方案可以自由地组合以形成本文公开的本发明的离散实施方式。
通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从中可以得出进一步的实施方式和优点。这些实施例是为了说明本发明，而不是限制其范围。
附图说明
图1示出了在pH 6.2和pH 5.5下IIc(OEG4-(IP5)2)和对比IP5-单-PEG2(OEG2-IP5)对CaOx结晶的抑制。通过向人尿中添加1mM草酸钠来诱导CaOx结晶并通过光学显微镜进行表征，然后进行自动图像分析以确定晶体数、水合物形式(COM-CaOx一水合物，COD-CaOx二水合物，n.d.-未定义)和晶体面积。绘制归一化为对照的总表面积的不同水合物形式的表面积。IIc/OEG4-(IP5)2仅在300nM下导致完成抑制COM晶体，随后是在4μM下完全的CaOx(COM和COD)抑制。相比之下，对于先前的优势化合物IP5-单-PEG2，仅在11μM下观察到了COM抑制，而在高达100μM的测试范围内未观察到完全的CaOx(COM和COD)抑制。
图2示出了在pH 6.2下本发明化合物对CaOx结晶的抑制：IIb(OEG2-(IP5)2)、IIc(OEG4-(IP5)2)和IId(OEG8-(IP5)2)。
图3示出了在pH 6.2下先前在PCT/EP2016/080657中描述的IP6类似物对CaOx结晶的抑制。通过向人尿中添加1mM草酸钠来诱导CaOx结晶并通过光学显微镜进行表征，然后进行自动图像分析以确定晶体数、水合物形式(COM-CaOx一水合物，COD-CaOx二水合物，n.d.-未定义)和晶体面积。绘制归一化为对照的总表面积的不同水合物形式的表面积。
图4示出了实施例1中描述的本发明化合物的合成。
图5示出了本发明化合物OEG4-(IP5)2抑制CaOx晶体形成的图像(比例尺：50μm)。
图6示出了先前在PCT/EP2016/080657中描述的IP6类似化合物OEG2-IP5抑制CaOx晶体形成的图像(比例尺：50μm)。
图7示出了化合物(OEG4)3-(IP5)3的合成。
图8示出了IP6类似物诱导的CaOx结晶模式的变化。通过光学显微镜在t＝7h评估了(OEG4)3-(IP5)3对掺有1mM NaOx的人尿中CaOx本体结晶的影响。COM-CaOx一水合物，COD-CaOx二水合物，n.d.-未定义；N＝3，归一化为对照(无抑制剂)的各个晶体类型的平均总面积/视野+SD。
图9显示OEG4-(IP5)2稳定了早期的前体颗粒并导致延迟了COD生长。(A)通过SEM在t＝7h表征了Bis-Tris缓冲液(pH 6.2)中OEG4-(IP5)2对CaOx结晶的剂量依赖性抑制。示出了代表性SEM图像(比例尺：1μm)。(B)在t＝10min采样了具有500nM OEG4-(IP5)2和无抑制剂的CaOx的结晶并且通过SEM成像(比例尺：1μm)。通过带SAED的TEM表征结晶度(进样口)。
图10示出了IP6类似物对CaOx粘附于肾上皮细胞的抑制。通过微分干涉对比显微镜评估了体外(A)OEG4-(IP5)2、(B)OEG2-IP5和(C)(OEG2)2-IP4对CaOx与RPTEC/TERT1细胞附着的抗粘附效果，然后量化了晶体占据面积。使用150μg/cm2与化合物预混合的CaOx将汇合的细胞处理30分钟，然后洗涤、固定并成像。(D)粘附至汇合细胞层的预混合有/无OEG4-(IP5)2的CaOx的示例图像(Leica CTR6000，63x油物镜)。(E)为了评估OEG4-(IP5)2去除已经结合的细胞层CaOx的能力，进行了上述测定的改进版本。使用CaOx将RPTEC/TERT1细胞温育30分钟，用PBS洗涤去除未结合的CaOx，并且使用OEG4-(IP5)2或培养基对照将细胞进一步温育2h。(N＝3，归一化为CaOx对照的平均值+SD，单因素ANOVA与Dunnett氏多重比较，与CaOx对照相比，****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05)。
图11示出体外通过OEG4-(IP5)2防止了CaOx诱导的肾上皮细胞的细胞损伤。(A)通过RNA测序确定的相对基因表达水平的热图和层次聚类(CaOx与CaOx-OEG4-(IP5)2之间的差异表达基因，p<0.01,log2比率＝0.5，显著特征数2000)。(B)相对于培养基组，CaOx中基因表达水平的基因集富集分析以及CaOx-OEG4-(IP5)2组中的对应值。绘制了相对于培养基对照组，CaOx组中差异上调或下调的基因的顶级基因本体术语(Top gene ontology term)和相应的归一化富集得分(示出了前10个上调的基因本体术语，所述FDR≤0.05，以及FDR≤0.05的下调的基因本体术语)。给出了CaOx-OEG4-(IP5)2组中差异表达基因的对应值(FDR≤0.05用深蓝色指示，FDR>0.05用浅蓝色指示)。(C)不同处理组中涉及炎症和免疫反应、细胞信号传导和ECM产生的基因的基因表达水平。(D)通过生存力染色评估了与仅用CaOx处理的细胞相比，在处理RPTEC细胞之前，通过用OEG4-(IP5)2预温育CaOx，死细胞数量的剂量依赖性减少(归一化为CaOx对照的平均值+SD，单因素ANOVA与Dunnett氏多重比较，****p<0.0001，**p<0.01)。(E)显示CaOx沉积(黑点)的示例明场图像，和指示未接收处理、仅接受CaOx处理或接受CaOx+10μM OEG4-(IP5)2处理的细胞的细胞死亡的红色荧光图像(LeicaCTR6000，10x物镜，比例尺：100μm)。(对于所有实验，N＝3)。
表1示出了针对抑制CaOx晶体生长的活性对钙化抑制剂进行筛选的数据。列出了先前描述于PCT/EP2016/080657中的IP6类似物以及本发明的化合物OEG2-(IP5)2、OEG4-(IP5)2、OEG8-(IP5)2和(OEG4)3-(IP5)3。
具体实施方式
实施例1：合成IIc(OEG4-(IP5)2)
步骤1：
试剂：DMF，氢化钠，对甲氧基苄基氯。
在氮气气氛下，将肌醇-1,3,5-原甲酸酯溶解在干燥的DMF中，冷却至0-5℃并且分批加入氢化钠(2.2当量)。在室温下搅拌1小时后，逐滴加入对甲氧基苄基氯(2.3当量)。将混合物在室温搅拌12小时，然后加入水并用乙酸乙酯萃取。真空除去溶剂，残余物用乙醚结晶。收率为70％。
步骤2：
试剂：MeOH；HCI 2N。
将步骤1的产物(1)溶于10体积的甲醇中，加入1体积的HCI 2N并且在50℃下加热3小时。冷却后，将混合物用30％氢氧化铵中和，并在室温下放置过夜。过滤形成的固体，用水洗涤并干燥。用二乙醚结晶后，获得呈白色固体的化合物2。收率为80％。
步骤3：
试剂：DMF，氢化钠，对甲氧基苄基氯。
在氮气气氛下，将步骤2的产物(2)溶于无水DMF中，冷却至0-5℃并且分批加入氢化钠(2当量)。在室温下1小时后，在0-5℃冷却混合物，并加入对甲氧基苄基氯(2当量)。在室温下12小时后，向混合物中加入水并用乙酸乙酯萃取。通过柱色谱用己烷/乙酸乙酯6/4洗脱以纯化残余物，然后用乙醚结晶。收率为35％。
步骤4：
试剂：二氯甲烷，甲苯磺酰氯，三乙胺。
将四乙二醇溶解在无水二氯甲烷中，加入三乙胺(3当量)，然后再加入对甲苯磺酰氯(2.5当量)。在室温下搅拌12小时后，真空除去溶剂，并通过柱色谱用乙酸乙酯/己烷7/3洗脱以纯化残余物。收率80％。
步骤5：
试剂：DMF，氢化钠，四乙二醇二甲苯磺酸酯(步骤4)。
在氮气气氛下，将步骤3的产物(3)溶解在干燥的DMF中，冷却至0-5℃，并分批加入氢化钠(1.1当量)。在室温下搅拌1小时后，将混合物再次冷却至0-5℃，并加入化合物4(0.5当量)的DMF(3体积)溶液。在室温下搅拌12小时后，向混合物中加入水，并用乙酸乙酯萃取。去除混合物的溶剂之后，通过柱色谱使用己烷/乙酸乙酯洗脱进行纯化。收率40％。
步骤6：
试剂：二氯甲烷，三氟乙酸。未纯化。
将步骤5的产物(5)溶于二氯甲烷(10体积)，并加入三氟乙酸(2体积)。在室温下搅拌3小时后，真空除去溶剂，残余物无需进一步纯化即可用于下一步。收率定量。
步骤7：
试剂：DMF，5-甲基-四唑，二苄氧基-二异丙基磷酰胺，然后是H2O2。
在氮气气氛下，将步骤6的产物(6)溶于无水DMF(10体积)中，添加5-甲基四唑(9当量)并且冷却至-10℃，然后逐滴加入二苄氧基-二异丙基磷酰胺(6当量)。在室温下搅拌12小时后，将混合物冷却至0-5℃，并逐滴加入30％的H2O2(9当量)。在室温下搅拌1小时后，加入水，并用乙酸乙酯萃取混合物。除去溶剂后，残余物通过柱色谱用氯仿/甲醇96/4洗脱进行纯化。收率40％。
步骤8：
试剂：H2，Pd/C。与乙醇镁形成镁盐。
将步骤7的产物(7)溶于甲醇(15体积)，加入Pd/C 10％，并且在室温和室压下氢化24小时。过滤催化剂后，减压除去溶剂，得到化合物8，为酸。收率定量。通过向化合物8的水溶液中加入乙醇镁水溶液，然后在真空下蒸馏溶剂，形成镁盐。
实施例2：合成(OEG4)4-(IP5)4
如合成OEG4-(IP5)2(实施例1；图4)中所述的，从肌醇-1,3,5-原甲酸酯开始以三步制备化合物5(PMB＝对甲氧基苄基；图7)。
步骤A的试剂(图7)：对甲苯磺酰氯；二氯甲烷，三乙胺。柱色谱。收率为80％。
步骤B的试剂(图7)：三羟甲基丙烷，DMF，氢化钠。柱色谱。收率为45％。
步骤C的试剂(图7)：甲醇，H2，Pd/C。收率为80％。
步骤D的试剂(图7)：对甲苯磺酰氯；二氯甲烷，三乙胺。柱色谱。收率为70％。
步骤E的试剂(图7)：图7所示的化合物5，DMF，氢化钠。柱色谱。收率为20％。
步骤F的试剂(图7)：二氯甲烷，三氟乙酸。收率定量。
步骤G的试剂(图7)：DMF，二苄基-N,N-二异丙基亚磷酰胺，5-甲基四唑。柱色谱。收率为30％。
步骤H的试剂(图7)：甲醇，H2，Pd/C。收率为90％。然后形成钠盐，定量。
实施例3：抑制CaOx结晶
为了比较化合物抑制草酸钙(CaOx)结晶的功效，使用了简单的体外尿液分析。简而言之，将人尿液(pH 6.2)与化合物混合，然后加入1mM草酸钠，诱导CaOx结晶。在室温下温育7小时后，通过光学显微镜测量结晶，采用自动图像分析来检测、分类和量化形成的CaOx晶体类型，即CaOx一水合物(COM)和CaOx二水合物(COD)。
发明人发现，所有三个新型二价IP5结构均显示出相似的体外CaOx抑制功率，在4μmol/L下完成抑制CaOx结晶(图1)。接头的长度对抑制效果没有重要影响。与先前开发的最有效的IP5-单-PEG2(OEG2-IP5)(PCT/EP2012/004088&PCT/EP2016/080657)相比，OEG4-(IP5)2在将CaOx结晶抑制至低于对照的50％的效力上增加了2500倍(图1)。
发明人观察到，首先，亚抑制浓度的化合物导致结晶从COM转变为COD，进一步增加化合物的浓度即可以以出乎意料的效率完全抑制CaOx的生长。所有测试的二价IP5结构在低微摩尔浓度下的体外测定中均显示出完全的CaOx抑制，这有望在体内实现(图2，表1)。
发明人证明，抑制CaOx结晶的功效取决于分子上磷酸根基团的数目，并且在4μmol/L下的所有OEGX-(IP5)2化合物均观察到了结晶的完全抑制(表1)。另外，在分别高达30μM或100μM下测试的IP6和其它化合物未导致完全CaOx抑制(图3，表1)。观察到OEG链长度或接头长度对总CaOx结晶的影响最小，主要影响COM-COD形成动力学。另外，将pH降低至5.5会比OEG4-(IP5)2更大幅地降低OEG2-IP5的活性。100μM的化合物OEG2-IP5未导致<50％的完全抑制或COM抑制。此外，化合物OEG4-(IP5)2在0.3μM下保留COM抑制并且在2.4μM下保留50％的完全抑制(图1，表1)。化合物(OEG4)3-(IP5)3在0.04μM下展示出Com抑制并且在2.4μM下展示出完全抑制(图8，表1)。
表1
实施例4：OEG4-(IP5)2通过早期前体稳定化来抑制CaOx结晶
在t＝10分钟时进行的早期结晶的扫描电子显微镜(SEM)实验显示同时存在COM形颗粒和圆形纳米极颗粒，而使用500nM OEG4-(IP5)2时，仅检测到纳米颗粒(图9B)。在t＝1h时，使用0.5-10μM抑制剂时仍存在纳米级颗粒，相比之下，在对照样品中微米级COM晶体占主导地位，表明通过OEG4-(IP5)2可以稳定早期的纳米级CaOx颗粒。
SEM实验进一步证实了从主要的COM向COD结晶的剂量依赖性转变，以及使用OEG4-(IP5)2对COD面-特异性生长的抑制(图9A)。这些结果加在一起表明，OEG4-(IP5)2在多个阶段改变了结晶过程，即晶体成核和生长动力学、以及晶体多态性和形状。
实施例5：与OEG2-IP5相比，OEG4-(IP5)2在体外更高效地阻断了CaOx与肾上皮细胞 的粘附
通过差动干涉对比显微镜在体外研究了选定的IP6类似物对CaOx晶体对肾近端肾小管上皮细胞(RPTEC)的抗粘附作用。OEG4-(IP5)2、OEG2-IP5和(OEG2)2-IP4的比较显示，与对照相比，200nM、4μM和高于100μM的浓度分别导致<25％的CaOx粘附(图10A-D)。高达100μM的柠檬酸盐处理对CaOx粘附没有任何可检测的保护作用。此外，OEG4-(IP5)2不仅抑制了CaOx粘附，而且在低微摩尔浓度下逆转了预结合的CaOx晶体的结合(图10E)。
实施例6：OEG4-(IP5)2对CaOx诱导的细胞损伤的细胞保护作用
RPTEC的RNA测序在培养基对照、OEG4-(IP5)2对照和用预混有OEG4-(IP5)2的CaOx处理的细胞之间显示出相似的基因表达谱，而单独的CaOx处理引起了剧烈变化(图11A)。相对于培养基样品，CaOx中不同表达基因的基因集富集分析显示改变了主要涉及免疫和炎症反应的基因(这与文献相吻合)，以及结构变化(例如微管组织)和蛋白质修饰和信号传导作用(例如肽基谷氨酸修饰、ER核信号通路)(图11B)。将相对于培养基样品，CaOx中差异表达基因的前10个富集基因集与相对于CaOx-OEG4-(IP5)2样品，CaOx中差异表达基因的前10个富集基因集进行比较，其显示出了类似的变化，表明将OEG4-(IP5)2与CaOx预混合可以防止CaOx诱导的转录组变化(图11B)。与所有其它处理组相比，在CaOx组中检测到TNFα和TGFβ信号通路基因、细胞表面糖蛋白、C-X-C基序趋化因子配体和补体级联基因的表达升高(图11C)。另外，如乙二胺均二聚体-1染色所证明的，CaOx晶体处理触发了质膜损伤，OEG4-(IP5)2以剂量依赖性方式防止了这种损伤(图11D、E)。
材料和方法
材料
化合物由Chimete Sri(Tortona，意大利)定制合成。植酸十二钠盐购自BiosynthAG(Thai，瑞士)。合并的人类尿液购自Lee Biosolutions(Maryland Heights，密苏里州)。草酸盐测定试剂盒(MAK315)、钙比色测定试剂盒(MAK022)、Bis-Tris、草酸钠、中性缓冲的10％福尔马林溶液和Mowiol 4-88购自Sigma-Aldrich(St.Louis，密苏里州)。氯化钠和二水合氯化钙获自Merck(Kenilworth，新泽西州)。一水合草酸钙购自abcr(Karlsruhe，德国)。8孔玻璃底玻片(80827)购自ibidi(Martinsried，德国)。分析级柠檬酸三钠二水合物、Nunc Lab-Tek II室载玻片、细胞培养板、哺乳动物细胞的活/死活力/细胞毒性试剂盒和磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自from Thermo Fisher Scientific(Rochester，NY)。RPTEC/TERT1细胞、ProxUp基础培养基和补充剂获自Evercyte(Vienna，奥地利)。RNeasy试剂盒购自Quiagen(Hilden，德国)且TrueSeq RNA试剂盒获自Illumina(San Diego，加利福尼亚)。
CaOx筛选测定和分析
将人尿液以50mL等分试样保存在-20℃。解冻后，将等分试样离心，使用0.45-μm注射器过滤器过滤，并将pH设置为6.2。按照试剂盒协议，使用草酸盐测定试剂盒测定人尿液样品中草酸根浓度，发现所用样品的草酸根浓度<100μM。在Bis Tris缓冲液(50mM,150mMNaCl,pH 6.2)中制备钠和化合物的稀释液。在Eppendorf管中将尿液与化合物混合，然后加入草酸钠。总体积为1mL的最终测定混合物含有90％尿液、5％草酸钠(1mM)和5％化合物稀释液。加入草酸钠后，立即将最终的测定混合物涡旋混合并添加至成像载玻片(8孔玻璃底室，ibidi)。每孔添加400μL并且每个样品制备两孔。在室温下温育7小时后，使用LeicaCTR6000显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar，德国)在明场模式下评估结晶。为了进行可视化，使用了40x物镜的图像。为了定量，使用2个孔/样品，每个使用5个20x物镜图像。在不添加草酸钠的情况下，未观察到结晶。
以相似的方式评价了对接种的晶体的抑制。如上所述，在尿液中用1mM草酸钠诱导结晶，随后在室温下温育1.5h后，将化合物直接添加到每个孔中。在添加化合物之前，在t＝1.5h时对样品成像，然后在t＝7h的总温育时间时成像。
在Matlab(版本R2016b或R2018b)中进行晶体的定量和分类。简而言之，使用边缘检测和分水岭算法对晶体进行分段，然后提取每个晶体的形状、强度和纹理特征。提取的特征用作半监督分类方法的输入，以区分COM(0类)、COD(1类)、未确定的结构(2类)和背景噪声(3类)。训练了立方支持向量机(SVM)分类器，随后将其用于测试图像分类。
使用批处理应用程序处理了所有测试图像。通过分析每种晶体类型每个视野的总面积，比较了化合物抑制CaOx结晶的功效。在每个实验中，将三种晶体类别(COM、COD和未分类)的总面积的总和归一化为对照(N＝3)。由于结晶过程本身的固有变异性，每个实验中的归一化降低了实验间变异性的影响。
扫描电子显微镜
在含有1mM NaOx、2mM CaCl2和指定浓度化合物的Bis Tris缓冲液(50mM,150mMNaCl,pH 6.2)中制备用于SEM的CaOx晶体。将12mm圆形玻璃盖玻片置于24孔板的底部。首先，在Bis Tris缓冲液中制备最终浓度为20x的CaCl2和抑制剂、和最终浓度为10x的NaOx的原液。通过首先添加800μL Bis Tris缓冲液、随后添加50μL CaCl2(20x浓度)和50μL抑制剂(20x浓度)并且涡旋混合，在Eppendorf管中制备测定混合物。然后添加100μL NaOx(10x最终浓度)，涡旋测定混合物并且立即添加到所准备的24孔板中。制备400μL每孔并且每个样品2个孔。将样品在室温下温育指定的时间。使用Leica CTR6000显微镜(LeicaMicrosystems)在明场模式下拍摄样品图像，然后使用双蒸馏水(ddH2O)洗涤样品一次，并且在室温下干燥。干燥后再次通过明场显微镜对样品成像，以确认干燥过程对晶体形态的影响很小。干燥后，将玻璃盖玻片安装在带有银漆并且使用CCU-010金属溅射镀膜机(Safematic,Bad Ragaz,瑞士)涂覆了6nm铂/钯层的SEM存根上。使用Magellan 400FEI SEM显微镜(ThermoFisher Scientific,Rochester,NY)以二次电子模式使用TLD检测器对样品进行成像。
细胞实验
根据制造商的建议，在37℃、5％CO2下，在混合有ProxUp补充剂(Evercyte)的ProxUp基础培养基(Evercyte，DMEM/Ham’s F12，Hepes缓冲液和GlutaMAXTM)中培养RPTEC/TERT1人类近端小管细胞(Evercyte)。定期测试细胞的支原体感染。
使用活/死活力/细胞毒性试剂盒(ThermoFisher Scientific)评估细胞活力。在24孔板中培养细胞，并且在接种48小时后(在到达汇合后)，在预混合有化合物的ProxUp基础培养基中使用150μg/cm2草酸钙一水合物(abcr)处理。处理48小时之后，通过用活/死细胞毒性试剂盒(ThermoFisher Scientific)根据试剂盒协议染色来确定细胞活力。使用Leica CTR6000显微镜(Leica Microsystems,3个孔/样品，3个图像/孔)通过落射荧光显微检查获得图像，并且量化红色荧光点的数量。
为了量化CaOx对RPTEC细胞的粘附，在8-孔Nunc Lab Tek室载玻片(ThermoFisherScientific)上培养细胞，并且在48小时汇合后，在37℃、5％CO2下在ProxUp基础培养基(pH设定为6.9)中使用预混合了化合物的COM(abcr)处理30分钟。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.4)将细胞洗涤两次，用10％中性缓冲福尔马林固定15分钟，用PBS冲洗，随后使用ddH2O进行最终冲洗。移出载玻片的腔室，并用Mowiol固定细胞。使用Leica CTR6000显微镜(LeicaMicrosystems)在DIC模式、63x油物镜下获得图像(3个孔/样品；8个图像/孔)，并且对晶体占据面积进行定量。
RNA测序
如细胞活力测定中所述培养细胞。四个处理组由培养基对照(ProxUp基础培养基)、仅150μg/cm2草酸钙一水合物(abcr)、150μg/cm2预混合了10μM OEG4-(IP5)2的草酸钙一水合物(abcr)和仅10μM OEG4-(IP5)2组成。使用Rneasy试剂盒(Quiagen)根据制造商的协议提取总RNA。纯化mRNA并使用TruSeq RNA试剂盒制备RNASeq文库。在Novaseq 6000(Illumina)上进行测序。使用STAR工具将读出物与人类参考基因组GRCh38.p10进行比对，并使用Kallisto程序对转录本进行定量。将Ensembl版本91用于基因模型定义。对于显著不同的基因的热图和层次聚类，计算了与所有样品均值相比的log2倍数变化，并将>4的log2倍数变化设置为4。在Webgestalt.org(v2019)41上进行基因集富集分析。GSEA的输入是基因列表，其带有整体基因id和排名得分(-log10*p-值*符号(log2比率))作为衡量两个处理组之间差异表达的度量。将差异表达的基因与基因本体(生物过程功能数据库)进行比较，并使用人类基因组-蛋白质编码作为参考集。为了比较所选基因的表达水平，使用了归一化的基因计数。
数据分析
除非另有说明，使用GraphPad Prism(La Jolla，加利福尼亚)来制备统计分析和图形。数据表达为平均值+SD。使用常规单因素ANOVA检测，之后使用事后Dunnett氏多重比较来比较处理组与对照组。除非另有说明，使用Matlab版本R2018b和R2016b(MathWorks,Natick，马萨诸塞州)进行图像分析。
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