具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外发现以四氢异喹啉为母核的化 合物在抗结膜黑色素瘤方面的作用机制和应用。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明提供了防己诺林碱及其结构类似物在抗结膜黑色素瘤方面的 作用机制和应用。防己诺林碱通过直接靶向FUBP2，下调同源重组通路关键蛋 白RAD51和BRAC1的表达，从而抑制结膜黑色素瘤细胞的复制，治疗和/或缓 解由结膜黑色素瘤引起的疾病。本发明还提供了防己诺林碱阳性探针以及阴性 探针，帮助诊断结膜黑色素瘤疾病。并且本发明实验表明，防己诺林碱及其结 构类似物还可以与顺铂、奥拉帕尼联用，增加抑制结膜黑色素瘤细胞复制的效 果，同时降低细胞毒性，因此具有良好的市场应用前景。

术语

如本文所用，“活性成分”、“本发明的活性化合物”、“本发明的活性成分” 可互换使用，均指的是防己诺林碱及其结构类似物。

四氢异喹啉

分子式是C₉H₁₁N。

中文名称:1,2,3,4-四氢异喹啉,结构式如下所示：

以四氢异喹啉为母核的四氢异喹啉生物碱是最大的一类生物碱，广泛分布 于罂粟科(papaveraceae)、巴比特科(berbidaceae)、毛茛科(ranunculaceae) 和防己科(menispermaceae)中。罂粟生物碱源自属生物碱一类的罂粟 (P.Somniferlzm)植物。

四氢异喹啉生物碱是一类重要的医药化工中间体，已经被用来合成一系列 的重要药物。例如，四氢异喹啉类生物碱类药物有多方面的生物活性，包括抗 肿瘤、抗菌、镇痛、调节免疫功能、抗血小板凝聚、抗心律失常、降压等。

本发明的活性化合物为防己诺林碱及其结构类似物，均是以四氢异喹啉为 母核的化合物。防己诺林碱来源于防己科植物粉防己的干燥根，具有利水消肿、 祛风止痛的功效。文献报道，防己诺林碱针对肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、 骨肉瘤及皮肤黑色素瘤有细胞毒作用，未见其针对结膜黑色素瘤的抗肿瘤机制 和活性报道。结构式如下表1所示：

表1防己诺林碱及其结构类似物

探针

本发明的探针为碘乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶修饰的选自下组的化合 物：防己诺林碱、盐酸小檗胺、或其组合。

在另一优选例中，所述化合物选自下组：碘乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶 修饰的防己诺林碱、碘乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶修饰的盐酸小檗胺。

在另一优选例中，所述化合物选自下组：

本发明探针的制备方法为，包括步骤：

(a)提供防己诺林碱和碘乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶在DMF中的混合溶 液；

(b)将步骤(a)中的混合溶液在碳酸钾作用下反应时间t0，制得所述混 合产物。

(c)将步骤(b)中的混合产物冷却后萃取分离，干燥，再用柱层分离得 到所述探针。

在另一优选例中，所述混合溶液中含有防己诺林碱0.1-0.3mmol,较佳地0.2mmol；

含碘乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶0.1-0.3mmol，较佳地0.22mmol；

含DMF溶液1-3ml，较佳地2ml。

在另一优选例中，所述反应在30-50℃下进行，较佳地在25-45℃下进行， 更佳地在40℃下进行。

在另一优选例中，t0为40-60小时，较佳地45-50小时，更佳地48小时。

在另一优选例中，所述步骤(b)之后还包含步骤：

在另一优选例中，所述步骤(c)中的干燥用固体Na₂SO₄进行。

在另一优选例中，所述步骤(c)中，用DCM萃取。

在另一优选例中，所述步骤(c)中，萃取2-5次，较佳地3次。

本发明优点包括：

(1)有效抑制结膜黑色素瘤的增殖，以防己诺林碱、千金藤素、粉防己 碱和盐酸小檗胺为代表的本发明的化合物能在极低的浓度下有效抑制结膜黑 色素瘤，其抑制结膜黑色素瘤的IC₅₀值分别为5.67μM、1.63μM、3.20μM 和8.46μM。

(2)用本发明首次研发了碘乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶修饰的防己诺 林碱，这种化合物能有效抑制结膜黑色素瘤增殖。

(3)本发明实验表明防己诺林碱通过直接靶向远端上游结合蛋白2(FUBP2)， 从而减少c-Myc蛋白的基因表达，并下调c-Myc下游同源重组(HR)通路关键蛋白 RAD51和BRCA1的表达，达到抑制肿瘤复制的目的。

(4)本发明化合物可以与顺铂或奥拉帕尼联合给药来增加其抗结膜黑色素瘤 的药效，降低药物毒性，因此具有良好的临床应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：防己诺林碱对汉人结膜黑色素瘤CM-AS16细胞的增殖抑制作用

实验所用汉人结膜黑色素瘤CM-AS16细胞来自上海交通大学第九人民医院， 培养基1640H含10％FBS(美国Invitrogen公司)，100U/mL青霉素和100U/mL 链霉素，培养于37℃，含5％CO₂以及饱和湿度的培养箱中培养，传代消化使用 0.25％胰蛋白酶消化，取对数生长期细胞用于CCK-8实验。将CM-AS16细胞以1× 10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后加药。药物加入96孔板的终浓 度分别为100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.12μM，1.56μM，0.78 μM和0.39μM。设置阳性对照药物MEK162组和空白对照组。培养72h后，吸除含药物的培养基，并加入含10％CCK-8(Apexbio公司)的1640H完全培养基， 避光孵育1-4h，使用酶标仪在450nm下检测吸光度，计算出不同浓度的生长 抑制率，生长抑制率(％)＝(Control组的平均值-给药组的平均值)/Control 组平均值*100％。细胞生长抑制率为50％的化合物浓度即为IC₅₀值。实验数据用 平均值±SD值表示，并使用Graphpad 7.0进行数据分析。

结果如图1所示，防己诺林碱、千金藤素、粉防己碱和盐酸小檗胺均具有 抗结膜黑色素瘤的活性，IC₅₀值分别为5.67μM、1.63μM、3.20μM和8.46μ M。

实施例2：转录组测序结果发现防己诺林碱可调控同源重组通路

将8μM防己诺林碱与CM-AS16细胞共孵育，同时设置不给药物刺激的对照 组。24h之后移除旧的细胞培养基，用1×PBS缓冲液洗涤细胞1-2次，加入Trizol 裂解液(按5×10⁶cells/ml trizol)反复吹打至裂解充分，形成清亮透明不 粘稠液体，转移至无酶离心管中，-80℃保存，交由付费生物公司进行溶液鉴 定。

结果如图2所示，防己诺林碱8μM给药显著影响了9条信号通路(adjusted P value<0.01)，其中影响最大的通路是同源重组通路(adjusted P value <1×10^-5)。

实施例3：qRT-PCR实验验证防己诺林碱作用于同源重组通路

收集有/无抑制剂刺激处理的CM-AS16细胞，用TRIzol试剂提取总RNA并溶 于DEPC水中，用260nm的吸光值测定RNA的浓度及纯度。采用HifairⅡ1st Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR试剂盒(上海翊圣生物科技有限 公司)合成cDNA第一条链，参照文献设计引物，加入Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)荧光染料，Bio-Rad IQ5荧光定量 PCR仪进行扩增。用比较阈值法进行基因定量分析，计算C_t(cycle threshold) 值，结果以目标基因与GAPDH基因表达的比值表示。

根据实施例2的结果挑选了同源重组通路关键基因进行进一步验证，图3的 qRT-QPCR结果表明防己诺林碱8μM给药显著下调了同源重组关键基因RAD50、 RAD51、BRCA1和BRCA2的表达。

实施例4：防己诺林碱阳性探针和阴性探针的化学合成

4.1防己诺林碱阳性探针的合成路线一

以防己诺林碱为起始原料，氮气保护下将其与商业易得的碘乙基-3-(丁 -3-炔基)双吖丙啶在碳酸钾作用下反应48h，可得防己诺林碱阳性探针(防己 诺林碱阳性探针结构如下属1-3所示)；

具体步骤如下：

路线一

防己诺林碱阳性探针的合成

在氮气保护下，将防己诺林碱(1-1,120mg，0.2mmol)与碘乙基-3-(丁 -3-炔基)双吖丙啶(1-2,55mg,0.22mmol)溶于2mL DMF中，在碳酸钾(33 mg,0.24mmol)作用下在25℃反应48h。随后将反应液冷却至室温，加入20mL 水，分别用25mL的DCM萃取三次，固体Na₂SO₄干燥。粗产物浓缩后柱层析分离 得到36mg的1-3，产率为25％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.38(dd, J＝8.1,2.2Hz,1H),7.19–7.08(m,1H),6.87(d,J＝7.2Hz,1H),6.82 (dd,J＝8.3,2.5Hz,1H),6.54(s,1H),6.49(s,1H),6.31(m,2H),5.94 (s,1H),3.93(s,3H),3.87(m,1H),3.77(s,3H),3.55(m,2H),3.41 (m,5H),3.23(m,1H),3.01–2.75(m,7H),2.67(s,3H),2.35(s,3H), 2.02–1.86(m,3H),1.54(m,3H),1.04(t,J＝7.0Hz,2H)；HRMS(ESI) m/zcalcd.for C₄₄H₄₉N₄O₆[M+H]⁺729.3652,found 729.3654.

4.2阴性探针的合成路线二

以1-5为原料，依次与氢化钠、碘甲烷作用得中间体1-6。1-6在酸催化下 脱乙缩酮保护基得中间体1-7，再依次与氨、羟胺-O-磺酸、碘/三乙胺反应， 得到含有光交联基团的阴性探针(1-4)。

路线二

具体步骤如下：

(1)合成化合物1-6

在氮气保护下，将化合物1-5(0.85g,5mmol)溶于25mL干燥的DMF中， 在0℃加入钠氢(0.3g,7.5mmol,60％dispersion in mineral oil)。混合液 室温搅拌30min后加入碘甲烷(0.6ml,10mmol)，室温避光搅拌24h。随后 加入10％的NaOH溶液，之后再加入150mL水，用石油醚：乙酸乙酯＝1:1的溶液萃 取三次，有机相用食盐水洗涤，固体Na₂SO₄干燥。粗产物浓缩后柱层析分离得到 700mg的1-6，产率为76％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ3.94(s,4H), 3.46(t,J＝6.9Hz,2H),3.32(s,3H),2.27(ddd,J＝8.6,6.8,2.7Hz,1H), 1.97–1.86(m,5H).

(2)合成化合物1-7

将化合物1-6(0.7g,3.8mmol)溶于11mL丙酮后加入对甲苯磺酸(0.18 g0.95mmol)，室温反应2h后，加入20mL饱和的NaHCO₃，乙酸乙酯萃取三次， 有机相用食盐水洗涤，固体Na₂SO₄干燥。粗产物浓缩后柱层析分离得到510mg 的1-6，产率为76％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ3.65(t,J＝6.2Hz, 2H),3.33(s,3H),2.74–2.69(m,2H),2.67(t,J＝6.2Hz,2H),2.45(td, J＝7.3,2.7Hz,2H),1.94(t,J＝2.7Hz,2H).¹H NMR(400MHz,Chloroform-d) δ3.30(s,3H),3.20(t,J＝6.3Hz,2H),2.02(td,J＝7.5,2.6Hz,2H), 1.97(t,J＝2.6Hz,1H),1.72–1.64(m,4H)；HRMS(ESI)m/z calcd.for C₈H₁₂N₂O[M+H]⁺152.0950,found 152.0952.

(3)的合成阴性探针(化合物1-4)

在氮气保护下，将化合物1-7(140mg,1mmol)溶于1mL 7M的氨水甲 醇溶液，混合液在0℃搅拌24h，随后加入羟胺-O-磺酸(130mg,1.2mmol) 和2mL干燥甲醇，混合液与室温搅拌12h后，用硅藻土过滤，甲醇洗涤，收集 滤液浓缩，后溶于2mL DCM，再加入三乙胺(175μL,1.26mmol)，随后在 0℃下缓慢加入碘(300mg,1.2mmol)，室温搅拌10min后，浓缩混合液，柱层析分离得到35mg的1-4，产率为23％。

实施例5：防己诺林碱探针对汉人结膜黑色素瘤CM-AS16细胞的增殖抑制作 用

按照实施例1的方法，将按照实施例4的方法制备得到的防己诺林碱阳性探 针、阴性探针和CM-AS16细胞接触。按照实施例1方法测试计算得到防己诺林碱 阳性探针、阴性探针以及防己诺林碱直接给药对细胞的抑制率，并绘制成图5。

图5结果表明防己诺林碱阳性探针对于结膜黑色素瘤活性的抑制率与防己 诺林碱直接给药相当，并且防己诺林碱阳性探针对于结膜黑色素瘤细胞活性的 抑制率较高。相比而言，阴性探针不能抑制结膜黑色素瘤细胞活性，符合ABPP 实验对探针的要求，为下一步实施例中进行的的ABPP实验提供了基础。

实施例6：ABPP实验寻找防己诺林碱直接作用的靶标

将培养好的细胞(CM-AS16细胞)用预冷的PBS缓冲液洗涤两次，然后加入预 冷的RIPA裂解液，在冰上充分裂解后将细胞轻轻刮下，置于预冷的离心管内， 13000×g离心15min，取上清，蛋白定量至终浓度为5-10mg/mL，留取适量裂 解液用作SDS-PAGE分析组的Input。取等量裂解液(1-2mg)于1.5mL EP管 中，分别加入阳性与阴性探针，4℃条件下匀速垂直旋转孵育2h，转移至冰上 紫外光交联仪下交联1h。在蛋白溶液中加入click反应液，使得探针、 biotin-N3、TBTA、TCEP、CuSO₄比例为2:2.4:1:10:10，click反应1h收集反 应混合液备用。

随后将上述click反应后的混合液按照Takara公司的Capturem StreptavidinMiniprep Columns(Cat No.635733)试剂盒标准流程进行pul ldown实验。当反应混合液经过链霉亲和素柱子时，可与探针相互作用的蛋 白被吸附，而没有被吸附的杂蛋白则通过弱洗脱流出，被吸附的蛋白通过强洗 脱流出。将强洗脱得到的蛋白进行SDS-PAGE分析，割胶送生物公司进行LCMSMS 蛋白质谱分析，并经搜寻与数据库匹配的蛋白，进行数据统计和生物学信息学 分析。

结果如下，共有9个防己诺林碱特异性结合的蛋白，经文献调研，其中的 FUBP2蛋白可调控同源重组关键蛋白BRCA1和RAD51的表达，因此我们首先选择 FUBP2作为防己诺林碱的靶标进行进一步的研究。

表1：防己诺林碱特异性结合的蛋白

实施例7：MST测定FUBP2蛋白与防己诺林碱的结合力

首先将带eGFP的FUBP2蛋白样品溶于HEPES缓冲液(25mM HEPES，ph7.0/7.5)， 浓度为20μM。之后将防己诺林碱按比例稀释成几个浓度(DMSO浓度一致，且 低于10％)，体积为10μL，各加入10μL蛋白样品，混匀，常温避光孵育15min。 然后用100％LED荧光进行MST扫描，最后由MST内置软件NT Analysis Software 直接给出实验中平衡解离常数(Kd)值和防己诺林碱浓度的log值与荧光值的S 型曲线。

结果如图6所示，FUBP2蛋白与防己诺林碱之间有直接的结合，Kd值为245.5 μM。说明了防己诺林碱能够特异结合于FUBP2蛋白。

实施例8：Western blot实验验证防己诺林碱给药不影响靶标蛋白FUBP2 的表达

收集有/无抑制剂处理的CM-AS16细胞，用RIPA裂解液(含100mM的PMSF) 裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。蛋白分离采用SDS-PAGE电泳， 然后转至PVDF膜、BSA封闭、加入特异性抗体(一抗)进行免疫反应，4℃孵 育过夜。加入HRP标记的二抗室温孵育2h，最后用ECL化学发光检测， Tanon-4600SF仪器进行扫摸，用Image J软件对免疫印迹条带进行灰度分析并 计算蛋白质的相对含量。以β-Actin作为内参校正。

结果如图7所示，DMSO为对照组，施用了防己诺林碱8μM后，FUBP2表达活 性不变，由此可见施用防己诺林碱不影响靶标蛋白FUBP2的表达水平。

实施例9：防己诺林碱给药影响c-Myc的表达

按照实施例3的方法，对于CM-AS16细胞分为防己诺林碱8μM给药组和空白 对照组，并对两组肿瘤细胞中表达c-Myc基因进行测序，分别得出给药组以及 空白对照组中c-Myc基因相对基因表达的程度，如图8所示。

按照实施例7的方法，测试防己诺林碱不同浓度给药组、空白对照组的肿 瘤细胞中的c-Myc表达活性，得到的结果如图9所示。

由图8可知，空白对照组中c-Myc基因表达强度>1，施用防己诺林碱后， c-Myc基因表达强度接近于0。这表明，施用防己诺林碱可以有效抑制c-Myc基 因的表达。

由图9可知，随着防己诺林碱给药浓度的增加，c-Myc表达活性逐渐降低， 由此可见防己诺林碱浓度依赖性地下调c-Myc蛋白的表达。

实施例10：防己诺林碱给药下调c-Myc下游的同源重组关键蛋白BRCA1和 RAD51的表达

由于文献报道c-Myc可上调BRCA1和RAD51的表达，因此测试了防己诺林碱 给药对BRCA1和RAD51的影响，具体实验操作如实施例7，防己诺林碱给药浓度 依赖性地下调同源重组关键蛋白BRCA1和RAD51的表达。

按照实施例7的方法，测试防己诺林碱不同浓度给药组、空白对照组的肿 瘤细胞中的BRCA1和RAD51的表达活性，结果如图10所示。

由图10可知，随着防己诺林碱给药浓度增加，BRCA1和RAD51的表达活性逐 渐降低，因此施用防己诺林碱能有效下调同源重组关键蛋白BRCA1和RAD51的表 达活性，同时同源重组关键蛋白BRCA1和RAD51的下调正向依赖于防己诺林碱的 给药浓度。

实施例11：防己诺林碱给药减少CM-AS16细胞中顺铂诱导的RAD51灶点的生 成数目

将处于对数生长期的CM-AS16细胞加入共聚焦培养皿中，至融合度为70％左 右，加入50μM顺铂培养24h，后移除培养液，PBS洗涤3次，加入终浓度为1.2 μM的防己诺林碱培养基溶液，孵育24h。移除培养基，用预冷的1×PBS洗涤3 次，-20℃条件下PFA固定细胞15min；1×PBS洗净固定液，每次5min，洗 涤3次；37℃条件下用BSA封闭细胞1h；孵育FUBP2一抗(ab150393，Abcam)， 并在4℃条件下摇床过夜；1×PBS洗净固定液，每次5min，洗涤3次；孵育二 抗HRP-linked Anti-rabbit IgG(7074S,Cell Signal ing Technology)，室温孵育2h；1×PBS洗净固定液，每次5min，洗涤3次；加入Hoechst染液， 染色5min；共聚焦显微镜拍照，得到图11A。

按照实施例3的方法测试RAD51的相对基因表达，得到图11B。

图11A显示，RAD51的染色为图中红色荧光部分。在空白对照组中，红色染 色部分基本和紫色荧光(Hoechst标记的活细胞)部分重复。说明施用顺铂后， 诱导了高比例的RAD51表达。在防己诺林碱给药组，可以看到红色染色部分在 紫色荧光部分中几乎看不到，这说明施用防己诺林碱后，先前由顺铂诱导产生 的RAD51活性表达在整体细胞中的比例下降。因此防己诺林碱1.2μM给药可以 有效减少CM-AS16细胞中50μM顺铂诱导的RAD51灶点的生成数目。

图11B显示相比于空白对照组，施用防己诺林碱后，由顺铂诱导的RAD51的 基因表达显著降低。

实施例12：防己诺林碱显著增加DNA损伤药物的抗结膜黑色素瘤药效

在图12和13中，CM-AS16的培养和处理情况如实施例1，给药浓度如图。在 图12中，10μM顺铂和1.2μM的防己诺林碱单独给药时，对CM-AS16细胞的抑 制率均小于50％，0.625μM顺铂和1.2μM的防己诺林碱联合给药后，相比于 单药组，药效显著增加；10μM顺铂和0.6μM的防己诺林碱单独给药时，对CM-AS16细胞的抑制率均小于50％，2.5μM顺铂和0.6μM的防己诺林碱联合给 药后，相比于单药组，药效显著增加。在图13中，0.312μM阿霉素和1.2μM 的防己诺林碱单独给药时，对CM-AS16细胞的抑制率均小于20％，0.312μM阿 霉素和1.2μM的防己诺林碱联合给药后，相比于单药组，药效显著增加；0.625 μM阿霉素和0.8μM的防己诺林碱单独给药时，对CM-AS16细胞的抑制率均小 于50％，0.625μM阿霉素和0.8μM的防己诺林碱联合给药后，相比于单药组， 药效显著增加。结果表明防己诺林碱能显著增加DNA损伤药物(顺铂和阿霉素) 对CM-AS16细胞的敏感性。

实施例13：利用基因敲减与过表达技术揭示靶蛋白的生物学功能

取对数期生长的CM-AS16细胞接种至六孔板中，密度为1.0×10⁶个细胞/孔， 培养24h之后进行腺病毒转染。感染24h后移除腺病毒继续培养24h后提取细 胞中的蛋白进行后续的Western blot实验检测目标蛋白c-Myc、RAD51和BRCA1 的表达情况。

根据上述对c-Myc、RAD51和BRCA1的活性表达的检测，即图14的结果，可 以知道，FUBP2敲减减少了c-Myc、RAD51和BRCA1蛋白的表达，从而降低结膜黑 色素瘤的细胞生长速度。因此FUBP2敲减对结膜黑色素瘤细胞带来的影响与防 己诺林碱给药的效果一致。

实施例14：小鼠荷瘤实验

防己诺林碱单药组：

取对数生长的CM细胞制备成浓度为1×10⁷个/mL的细胞悬液，在6-7周龄 NCG雄性小鼠前肢腋皮下接种，将接种后的小鼠随机分成阴性对照组、阳性对 照组及治疗物高中低三个剂量组。待瘤块大小长到约80mm³时，开始给药，给 药时设置不同给药方式，以及不同剂量的对照组：

(1)MEK162(灌胃)给药：以50mg/kg/天的剂量给药；

(2)腹腔注射防己诺林碱：一组为给药量高的组每天注射防己诺林碱 50mg/kg，给药量低的组每天注射防己诺林碱25mg/kg。

每一组连续给药21天，每隔3-4天观察小鼠体重及肿瘤体积变化，绘制肿 瘤体积随时间变化的趋势图，如图15所示；绘制小鼠体重随时间变化的趋势图， 如图17所示

实验结束后处死小鼠称量体重，解剖剥离瘤块称重并计算体积，测量肿瘤 体积如图16所示。同时取血清测肝功(AST和ALT)和肾功能指标(尿素和肌酐)， 如图18所示。

图15显示，对比空白对照组，防己诺林碱50mg/kg/天的给药量腹腔注射 可以显著降低肿瘤体积。说明大剂量的防己诺林碱给药可以显著的降低肿瘤体 积。

图16显示，处死小鼠的肿瘤体积随着防己诺林碱的给药显著变小，MEK162 (灌胃)给药的形式使得肿瘤体积显著减小。

图17显示，防己诺林碱给药不影响NCG小鼠的体重。

图18显示，防己诺林碱给药也不影响NCG小鼠的肝功能和肾功能水平。

实施例15防己诺林碱联合给药组

取对数生长的A375细胞制备成浓度为3×10⁶个/mL的细胞悬液，在5-6周龄 nu/nu雄性小鼠前肢腋皮下接种，将接种后的小鼠随机分成阴性对照组、阳性 对照组及单药组，联合给药组。待瘤块大小长到约165mm³时，开始腹腔注射连 续给药14天，每隔2-3天观察小鼠体重及肿瘤体积变化。实验结束后处死小鼠 并称体重，解剖剥离瘤块称重并计算体积，分析抑瘤率并进行免疫组化。

图19显示防己诺林碱给药增加了DNA损伤药物(顺铂)对A375结膜黑色素 瘤癌细胞的敏感性，增加了顺铂对于癌细胞复制的抑制作用。

如图20和21所示，防己诺林碱给药降低了A375细胞中c-Myc蛋白和同源重 组关键蛋白RAD51的表达。

图22显示防己诺林碱、顺铂联合给药相比单药均增加了Tunel阳性细胞的 数目，表明联合给药通过促进癌细胞凋亡来达到抗癌效果。

图23显示，防己诺林碱给药增加了PARP抑制剂(奥拉帕尼)对A375结膜黑 色素瘤癌细胞的敏感性，增加了奥拉帕尼对于癌细胞复制的抑制作用。

图24显示，防己诺林碱、PARP抑制剂(奥拉帕尼)联合给药相比单药增加 了Tunel阳性细胞的数目，表明联合给药通过促进癌细胞凋亡来达到抗癌效果。

鉴于防己诺林碱与黑色素瘤的关系已公开，为证明本申请的创造性，请补 充提供如下数据：

现有公开的黑色素瘤均为皮肤黑色素瘤，防己诺林碱在皮肤黑色素瘤 A375[1]、A875[1]和WM9[2]上的增殖抑制IC₅₀分别为12.41μM、16.20μM和 13.13μM，低于其对汉人结膜黑色素瘤细胞CM-AS16和白人结膜黑色素瘤 CRMM2、CRMM1、CM2005.1的IC50值，IC₅₀值分别为5.67μM，3.60μM，2.68 μM和7.40μM。防己诺林碱对四株结膜黑色素瘤的增殖抑制IC₅₀均小于已报道 的常见黑色素瘤的活性(如皮肤黑色素瘤)，本申请的防己诺林碱对于本申请的 结膜黑色素瘤具有显著更优的抑制效果。

[1]Shi J.,et al.Fangchinol ine suppresses growth and metastasis ofmelanoma cells by inhibiting the phosphorylation of FAK.Oncol Rep.2017； 38(1):63–70.

[2]Liu Y.,et al.Design,Synthesis and Anticancer Evaluation ofFangchinoline Derivatives.Molecules.2017；22(11):1923.

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。