一种具有治疗神经元损伤及/或神经炎症相关的神经退行性疾病作用的药物组合物
阅读说明：本技术 一种具有治疗神经元损伤及/或神经炎症相关的神经退行性疾病作用的药物组合物 (A pharmaceutical composition for treating neuron injury and/or nerve inflammation related neurodegenerative diseases ) 是由 沈旭 王佳颖 卢健 黄玉洁 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种以石杉碱甲与地氯雷他定或其盐的药物组合物及其治疗与保护神经元及/或缓解神经炎症相关的神经退行性疾病,比如帕金森病等的用途。本发明通过实验筛选表明,石杉碱甲与地氯雷他定联合给药可协同保护神经工具细胞SH-SY5Y细胞免受STZ损伤,同时可协同抑制LPS引起的神经炎症,从而改善ICV-STZ AD动物大鼠的认知功能障碍,本发明的药物组合物可用于阿尔兹海默症和帕金森病的预防和治疗。(The invention discloses a pharmaceutical composition of huperzine A and desloratadine or a salt thereof and application thereof in treating neurodegenerative diseases related to neuron protection and/or neuroinflammation relief, such as Parkinson's disease and the like. Experimental screening shows that the huperzine A and the desloratadine are jointly administered to synergistically protect SH-SY5Y cells as nerve tool cells from being damaged by STZ and inhibit neuroinflammation caused by LPS, so that cognitive dysfunction of ICV-STZ AD animal rats is improved.)
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体涉及石杉碱甲与地氯雷他定的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用，更具体地，本发明涉及石杉碱甲具及其药学上可接受的盐与地氯雷他定及其药学上可接受的盐联合给药可协同保护神经元及/或缓解神经炎症，而用于制备治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物中的用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是一种进行性神经退行性疾病，以Aβ聚集导致的神经外淀粉样蛋白沉淀，tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结以及神经元细胞凋亡等为其主要标志。AD具有高度年龄依赖性，随着年龄增加，AD的发病率也会急剧提高，截止2011 年全球已经有超过3000万人口患有痴呆，并且随着全球人口老龄化，每年AD患者人数在高速增长。目前我国已进入老年社会，AD也成为一个导致老年人生活质量下降并导致死亡的重要原因。目前临床用于治疗AD的药物主要为乙酰胆碱酯酶抑制剂及以N-甲基-D-天冬氨酸受体为靶点的药物，但两类药物并不能达到很好的治疗效果，随着对AD发病机制研究的不断深入，靶向“多靶点”被认为是抗AD药物发现研究领域中的一个重要策略，而药物组方的研发无疑是实现多靶点抗AD的最好途径与方法，目前已有将胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐与NMDA受体拮抗剂美金刚联合用药用于治疗中重度AD患者，效果优于单药治疗，但尽管如此，AD这一“世纪难题”仍未得到解决，目前AD患者仍无法彻底治愈。
随着研究的进展，AD的发病机制已经初窥端倪，阿尔茨海默病患者尸检显示其脑组织出现明显的萎缩，脑细胞出现广泛死亡，在这些部位可见明显的老年斑、神经原纤维缠结等病变。因此目前AD的发病机制主要提出了三种假说：神经元不可逆凋亡、β淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)假说和Tau蛋白假说，目前的研究认为针对此三种假说的抗AD药物可能具有阻断AD病理进程的作用。
神经元广泛死亡是AD患者脑中最明显的病理特征，而神经元不可逆凋亡是造成神经元死亡的主要原因。AD患者脑中的Aβ过量表达及其毒性作用、神经纤维缠结、氧化物损伤、早老蛋白基因突变、钙离子稳态失衡等诸多因素最终都可导致神经元的不可逆凋亡，故认为可通过拮抗神经元凋亡以起抗AD的治疗效果(Robert M.Friedlander,M.D.Apoptosisand Caspases in Neurodegenerative Diseases.N Engl J Med,2003；348:1365-1375)。
Aβ聚集形成的淀粉样斑块与Tau蛋白高度磷酸化形成的神经纤维缠结作为AD患者脑中的两种特异性病理特征，其二者协同参与了AD疾病的发生与发展。Aβ假说认为，Aβ的聚集是导致淀粉状沉淀斑形成、神经纤维缠结、神经元炎症、神经元功能丧失及死亡以及最后痴呆的形成等一系列病理变化的起始因子(Yamin G,Ono K,Inayathullah M,Teplow D B.Amyloid beta-protein assembly as a therapeutic target of Alzheimer’sdisease.Current Pharmaceutical Design,2008,14:3231-3246；Kurz A,PerneczkyR.Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer’s disease.Journalof Alzheimer's disease,2011,24:61-73)。Tau 蛋白假说认为，异常过度磷酸化的Tau蛋白与微管的结合能力大大下降，最终导致突触缺失，神经胶质细胞活性丧失等病理症状(D.N.Drechsel,A.A.Hyman,M.H.Cobb,M.W.Kirschner. Modulation ofthe dynamicinstability of tubulin assembly by the microtubule-associatedprotein tau.Molecular biology of the cell,1992,3:1141)。但随着近年来对AD病因的不断探索，新的研究表明，Aβ过度积聚及Tau蛋白过度磷酸化所引起的小胶质细胞过度激活而介导的神经炎症是直接推动AD发展的关键因素之一。在AD病理情况下，小胶质细胞清除功能降低从而导致有害介质在脑中集聚，而过多的有害介质则会诱导小胶质细胞转变促炎型小胶质细胞，此类小胶质细胞会分泌一系列促炎因子如IL-6、TNF-α及INOS，进而引发神经炎症损伤周遭神经元，最终引发AD(L.Zhong,Y.Xu,R.Zhuo,T.Wang,K.Wang.Soluble TREM2ameliorates pathological phenotypes by modulating microglial functions in anAlzheimer's disease model. Nature Communication,2019,10:1365)。故缓解脑中小胶质细胞介导的神经炎症也被认为是抗AD药物发现研究领域中的一个重要策略。
石杉碱甲作为一种天然的，高效的，可逆的，第二代乙酰胆碱抑制剂，对AD有显著疗效，其治疗指数高，作用时间长，无毒副作用，但在天然植草中含量很低。地氯雷他定，属于三环长效型的第三代组织胺拮抗剂，选择性作用在H1受体,一般于缓解慢性特发性荨麻疹及常年过敏性鼻炎的全身及局部症状。目前对于其保护神经元及/或缓解小胶质细胞介导的神经炎症，从而起到抗AD的作用未见报道。本发明基于发现地氯雷他定具有保护神经元及/或缓解神经炎症的作用，并进一步将地氯雷他定与临床药物石杉碱甲进行组方，实现了预料不到的协同作用，从而增加疗效，减少剂量，降低毒副反应，以探求最佳的抗AD疗效。
发明内容
发明目的：本发明的一个目的是提供石杉碱甲及其药学上可接受的盐与地氯雷他定及其药学上可接受的盐所组成的药物组合物的新的医药用途，即其在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
技术方案：
一种具有治疗神经元损伤及/或神经炎症相关的神经退行性疾病作用的药物组合物，它包括石杉碱甲或其药学上可接受的盐和地氯雷他定或其药学上可接受的盐。
作为优选方按，以上所述的一种具有治疗神经元损伤及/或神经炎症相关的神经退行性疾病作用的药物组合物，石杉碱甲或其药学上可接受的盐和地氯雷他定或其药学上可接受的盐的摩尔比为1：100～200。特别优选1：150时产生的协同作用最佳，可取得预料不到的技术效果。
以上所述的一种具有治疗神经元损伤及/或神经炎症相关的神经退行性疾病作用的药物组合物，可接受的盐为盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或对甲苯磺酸盐。
本发明所述的组合物在制备治疗与神经元损伤及/或神经炎症相关的神经退行性疾病的药物中的应用。所述与神经元损伤及/或神经炎症相关的神经退行性疾病包括帕金森病或阿尔茨海默病。
一种具有治疗神经元损伤及/或神经炎症相关的神经退行性疾病作用的药物制剂，它包括石杉碱甲或其药学上可接受的盐和地氯雷他定或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体。药物制剂剂型包括普通片剂、普通胶囊剂、缓释片或胶囊、分散片、咀嚼片、口腔崩解片、滴丸、脂质体、液体制剂等。作为优选单位制剂中含石杉碱甲0.1～0.2mg，含地氯雷他定 20～40mg。
本发明通过药效学试验证明，本发明的复方药物组合物可用于阿尔茨海默型痴呆症的预防和治疗，并且由石杉碱甲和地氯雷他定联合使用在疗效上具有协同作用。下面是本发明复方药物组合物的部分药效学试验及结果。细胞试验证明本石杉碱甲与地氯雷他定联合给药能够协同保护神经元及抑制小胶质细胞介导的神经炎症，同时，复方药物组合物较单用石杉碱甲与地氯雷他定对阿尔茨海默型痴呆症ICV-STZ大鼠的空间学习记忆功能的改善作用更优。特别是石杉碱甲或其药学上可接受的盐和地氯雷他定或其药学上可接受的盐的摩尔比为1： 150时产生的协同作用最佳，可取得预料不到的技术效果。
附图说明
图1为石杉碱甲与地氯雷他定联合给药能够协同保护SH-SY5Y细胞免受链脲佐菌素 (Streptozocin，STZ)的损伤，且二者摩尔质量比值为1:150时效果最优。###代表P<0.001VS DMSO组，***代表P<0.001 VS STZ组，&代表P<0.05 VS地氯雷他定组。单因素方差分析。
图2为石杉碱甲与地氯雷他定联合给药能够协同抑制LPS引起的神经炎症，且二者摩尔质量比值为1:150时效果最优。###代表P<0.001 VS DMSO组，**代表P<0.001 VS LPS组，&代表P<0.005 VS地氯雷他定组。单因素方差分析。
图3为地氯雷他定与石杉碱甲联合给药能够协同改善ICV-STZ AD模型大鼠的认知障碍。###代表P<0.001 VS空白组，代表***代表P<0.001 VS模型组，@@代表P<0.005 VS模型组+ 石杉碱甲。单因素方差分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
试验实施例1：地氯雷他定(Desloratadine)与石杉碱甲(Huperzine-A)联合给药协同保护 SH-SY5Y细胞。
本发明在SH-SY5Y细胞中检测地氯雷他定及/或石杉碱甲联合给药对链脲佐菌素引起的细胞损伤的保护作用，实验表明单用地氯雷他定及石杉碱甲均具有保护神经元的作用，但相比于地氯雷他定或石杉碱甲单独给药，当地氯雷他定与石杉碱甲联合以1:150的摩尔比给药时能更好的拮抗STZ引起的神经凋亡，达到更好的神经保护作用。
1、实验原理
本实验基于链脲霉素(Streptozocin，STZ)广泛用作体内及体外氧化应激介导的凋亡，故予以SH-SY5Y细胞STZ处理以在体外模拟AD状态下的神经元，本发明的发明人将STZ及不同浓度的地氯雷他及/或石杉碱甲定加入SH-SY5Y细胞培养液中共同孵育一定时间，然后通过MTT检测法测定细胞活力变化，以此评价地氯雷他定及/或石杉碱甲对SH-SY5Y细胞的保护作用。
本实验通过MTT检测法评价地氯雷他定及/或石杉碱甲的神经保护作用，其原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
2、实验材料与方法
1)用于诱导细胞损伤的STZ购于Sigma公司，细胞培养试剂均购于Gibco公司，SH-SY5Y 细胞来源于ATCC，细胞液地氯雷他定及石杉碱甲均购自Sigma公司。
2)MTT试验：SH-SY5Y细胞以105个/孔的浓度以100ul接种于96孔板中，待细胞过夜贴壁后同于予以0.8mM STZ及的不同浓度的地氯雷他定及/或石杉碱甲孵育24小时，后移去原有培养基每孔加入MTT于37℃孵育4小时，MTT终浓度为0.5mg/ml。最后移除孔内原有培养基后加入100ul DMSO以溶解甲瓒，并在酶标仪上，在490nm波长处读吸光值。
3、实验结果
结果如图1所示，实验表明地氯雷他定及石杉碱甲单独给药均具有保护神经元的作用，但相比于单用地氯雷他定或石杉碱甲，地氯雷他定与石杉碱甲联合给药能更好的拮抗STZ引起的神经凋亡，达到更好的神经保护作用。
试验实施例2：地氯雷他定(Desloratadine)与石杉碱甲(Huperzine-A)联合给药协同抑制 LPS引起的神经炎症。
本发明在BV2细胞中通过予以STZ诱导神经炎症，并通过检测胞内炎症因子转录水平以评估地氯雷他定及/或石杉碱甲对神经炎症的作用，实验表明地氯雷他定及石杉碱甲单独给药均具有抑制神经炎症的作用，但相比于单用地氯雷他定或石杉碱甲，当地氯雷他定与石杉碱甲联合以1:150的摩尔比给药时能取得很好的拮抗LPS引起的神经炎症反应。
1、实验原理
本实验基于BV2细胞能够被LPS激活从而上调炎症因子的转录水平引起神经炎症。本发明的发明人将LPS及不同浓度的地氯雷他定及/或石杉碱甲加入BV2细胞培养液中共同孵育一定时间，然后将细胞培养液去除，洗净细胞并裂解提取细胞中RNA，并通过PT-PCR实验检测相关炎症因子(IL-6)的转录水平。
本实验细胞内炎症因子(IL-6)的转录水平通过RT-PCR检测，其原理是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以 cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段，后通过对目的片段水平的检测从而反映出目的基因转录水平。
2、实验材料与方法
BV2细胞中的总RNA采用RNAiso plus进行抽提，将培养基吸出后用预冷的PBS洗涤两遍，每孔加入1mL RNAiso，向完全裂解的细胞或组织中加入200μL三氯甲烷，剧烈晃动15s后室温静置5min，于4℃，12000rpm离心15min，取400μL上层液体于新的1.5mL EP 管中。再加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀后室温静置10min，再于4℃，12000rpm离心 10min。倒掉上清，每管加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，再于4℃，13000rpm离心10min。弃上清并敞开盖子等待沉淀完全干燥，之后每管加入30μLDEPC水于55-60℃助溶10min，最后用分光光度计测量总mRNA浓度。取1μg mRNA将其反转录成cDNA，反转录程序为 37℃，15min；85℃，5s终止反应。得到的cDNA采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒并用 BIO-RAD CFX connect real-timesystem机器进行检测。实时定量PCR的程序为95℃，10s，接着进行43个循环的95℃，10s；60℃，20s；72℃，10s及80℃，1s，读板，72℃延伸10min，再从50℃到95℃，每0.5℃读板一次，最后10℃，10min结束程序。
3、实验结果
结果如图2所示，地氯雷他定及石杉碱甲单独给药均可降低炎症因子IL-6的转录水平，但相比于单用地氯雷他定或石杉碱甲，地氯雷他定与石杉碱甲联合给药能进一步降低炎症因子的转录，说明地氯雷他定与石杉碱甲联合给药可协同抑制LPS引起的神经炎症，且当地氯雷他定与石杉碱甲联合以1:150的摩尔比给药时能更好的拮抗炎症反应。
试验实施例3：地氯雷他定(Desloratadine)与石杉碱甲(Huperzine-A)联合给药协同改善 ICV-STZ AD模型鼠的认知功能障碍
为了进一步明确地氯雷他定与石杉碱甲联合用药的抗AD药效，本发明通过灌胃给药给予ICV-STZ AD模型大鼠地氯雷他定及/或石杉碱甲，然后通过水迷宫实验评估单独及/或联合给药对AD模型大鼠认知功能障碍改善作用。结果表明地氯雷他定与石杉碱甲联合用药能够协同改善AD模型大鼠的认知功能障碍。
1、实验原理
研究证明双侧侧脑室注射STZ可引起持久的能量代谢障碍，广泛的氧化应激反应和tau 蛋白高度磷酸化等类似AD的病理改变，并最终也会导致认知功能的障碍，因此被认为是合适散发型的AD模型而得到广泛的运用。
Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)实验是一种强迫实验动物游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力。该实验被广泛应用于动物学习记忆及认知能力的评估。
2、实验材料与方法
1)SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(8周龄)购买于中国维通利华公司。大鼠在标准条件下饲养(12/12小时明暗循环，足够水和食物，22℃的恒温，60％的湿度)。动物用地氯雷他定购买于中国安耐吉公司。动物用石杉碱甲购买于中国源叶公司。
2)本实验将购置40只SD大鼠平均随机分为4组，每组10只。第一组为空白组，不手术给予溶剂；第二组为模型组，接受ICV-STZ损伤并给予溶剂；第三组为地氯雷他定给药组，接受ICV-STZ损伤并给予地氯雷他定(20mg/kg/day)，第四组为石杉碱甲给药组，接受 ICV-STZ损伤并给予石杉碱甲(0.1mg/kg/day)。第五组为联合给药组，接受ICV-STZ损伤并给予地氯雷他定(20mg/kg/day)+石杉碱甲(0.1mg/kg/day)。所用溶剂为6％吐温80和生理盐水，灌胃给药。所有大鼠均在12/12小时明暗循环，22℃，湿度60％的标准环境下饲养，给予充足的食物和水分。实验动物在手术前先预给药2周，然后进行手术造模，造模完成后继续给药21天，然后进行动物行为学实验。具体手术步骤如下所述，用10％水合氯醛(含1％硫酸阿托品)麻醉大鼠，然后固定于立体定向仪上，用75％酒精消毒表皮后正中做失状切口，用3％过氧化氢清理骨膜，按坐标(前囟后0.8mm，矢状缝左右旁开1.5mm，脑表面下 3.5mm)用小电钻钻开颅骨，用微量注射器插入脑中进行注射，每侧注射10mL STZ，约3 mg/kg，STZ用人工脑脊液配置(147mM NaCl，2.9mM KCl，1.6mM MgCl2，1.7mM CaCl2和2.2mM葡萄糖，pH 7.3)，注意避光，现用现配。所有的微量注射以2mL/min的速度进行注射，注射完成后，针头留置于脑内保持2分钟，以防药物外流。
3)Morris水迷宫实验：本发明参照文献进行水迷宫实验，简单介绍如下：Morris水迷宫仪器为一个直径为1.5米，深60厘米的圆形水池；我们将水池分为四个象限，其中一个象限的水池液面下1.5厘米有一个直径为10厘米的平台，我们训练大鼠寻找并记忆平台所在位置；我们让实验大鼠每天进行三次训练，持续四天的时间；在三次训练中我们分别将大鼠面向池壁于三个除平台所在的象限中置于水中，然后给实验鼠60秒钟时间去寻找平台位置，如果 60秒钟内不能找到平台，我们会将大鼠置于平台之上；不管是哪种情况下站到平台之上的大鼠都会让它在平台上放置10秒钟时间以帮助它记忆平台位置；记录大鼠寻找到平台的时间作为实验鼠记忆力的评价指标，每天取三次训练的结果取平均值，四天时间每组大鼠潜伏期的线形图见图3a。在第五天，在三次训练之后，大鼠会进行平台寻找实验；在这次实验中，潜于水面下的平台被撤除，然后让大鼠在水池中持续60秒钟去寻找平台，记录大鼠穿越平台所在位置次数同样作为评价大鼠记忆力的指标，第五天三组大鼠穿台次数的柱状图见图3b。
3、实验结果：
潜伏期实验结果如图3a所示：前四天的训练期间，ICV-STZ AD模型大鼠的潜伏期明显高于空白大鼠，而20mg/kg/day地氯雷他定或0.1mg/kg/day石杉碱甲给药的模型鼠的潜伏期明显比未给药的模型鼠短，且地氯雷他定与石杉碱甲联合给药的模型鼠潜伏期更短并接近空白组水平；穿台实验的结果如图3b所示：在第五天撤去平台后，模型组大鼠穿越平台所在位置的次数明显少于空白组鼠，而20mg/kg/day地氯雷他定或0.1mg/kg/day石杉碱甲给药的模型鼠穿越平台所在位置的次数明显比模型组大鼠多，且地氯雷他定与石杉碱甲联合给药的模型鼠平台穿过次数更多并接近空白组水平。这些结果说明地氯雷他定与石杉碱甲联合给药可协同改善ICV-STZ AD模型大鼠的认知功能障碍。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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