代谢新化学实体肝cyp450亚型酶的筛选方法
阅读说明：本技术 代谢新化学实体肝cyp450亚型酶的筛选方法 (Method for screening liver CYP450 subtype enzyme for metabolizing new chemical entity ) 是由 李明 于 2020-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种代谢新化学实体肝CYP450亚型酶的筛选方法,其首先建立包含缓冲液、肝微粒体、第一底物、MgCl-2、抑制剂和NADPH的筛选体系,在筛选体系中进行新化学实体亚型酶的筛选反应,筛选反应分为加抑制剂组和不加抑制剂组,同时以第一底物进行验证试验,验证试验也分为加抑制剂组和不加抑制剂组,根据亚型酶筛选反应和验证试验的结果,对亚型酶筛选结果进行综合判断。本发明代谢新化学实体肝CYP450亚型酶的筛选方法能够有效减少假阴性与假阳性的发生率,保证筛选结果的可靠性。(The invention discloses a screening method of a liver CYP450 subtype enzyme for metabolizing a new chemical entity, which comprises the steps of firstly establishing a buffer solution, liver microsomes, a first substrate and MgCl 2 And the screening reaction of the new chemical entity subtype enzyme is carried out in the screening system, the screening reaction is divided into an inhibitor adding group and an inhibitor not adding group, meanwhile, a first substrate is used for carrying out a verification test, the verification test is also divided into the inhibitor adding group and the inhibitor not adding group, and the subtype enzyme screening result is comprehensively judged according to the subtype enzyme screening reaction and the result of the verification test. The screening method for metabolizing the new chemical entity liver CYP450 subtype enzyme can effectively reduce the incidence of false negative and false positive and ensure the reliability of the screening result.)
技术领域
本发明涉及肝CYP450酶代谢表型体外快速筛选技术领域，具体的是一种代谢新化学实体肝CYP450亚型酶的筛选方法。
背景技术
新化学实体代谢研究是其研发过程的重要内容，与新化学实体研发的速度和质量有密切关系。因而，新化学实体药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。
体外代谢法的试验周期较短且代谢条件可控，便于对代谢结果的评价。肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。因此，肝微粒体体外温孵法成为普遍的体外代谢研究方法。
现有技术中，采用肝微粒体进行的亚型酶的筛选方法，其精确度较低，容易造成假阳性或假阴性，并且缺乏验证试验，其结果的可靠性低。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种代谢新化学实体肝CYP450亚型酶的筛选方法，其能够减少假阴性与假阳性的发生率，保证筛选结果的可靠性。
本发明公开了一种代谢新化学实体肝CYP450亚型酶的筛选方法，包括如下步骤：
步骤一、建立筛选体系：
在包含缓冲液、肝微粒体、第一底物、MgCl2、抑制剂和NADPH的反应体系中，以第一底物的代谢率为参照，筛选出最适反应条件，其中，所述抑制剂以其对降解第一底物的酶出现明显抑制作用时的浓度为最适浓度；
步骤二、亚型酶筛选反应和验证试验：
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、新化学实体、MgCl2、抑制剂混合，再加入NADPH启动筛选反应，反应终止后，检测加抑制剂组的新化学实体在体系中的含量；
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、新化学实体、MgCl2、抑制剂溶媒混合，再加入NADPH启动验证反应，反应终止后，检测不加抑制剂组的新化学实体在体系中的含量；
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、第一底物、MgCl2、抑制剂混合，再加入NADPH启动验证反应，反应终止后，检测加抑制剂组的第一底物在体系中的含量；
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、第一底物、MgCl2、抑制剂溶媒混合，再加入NADPH启动验证反应，反应终止后，检测不加抑制剂组的第一底物在体系中的含量；
步骤三、亚型酶筛选结果判断：
若不加抑制剂组的第一底物被代谢，加抑制剂组的第一底物未被代谢，且，不加抑制剂组的新化学实体被代谢，加抑制剂组的新化学实体不被代谢，说明降解第一底物的酶参与新化学实体的代谢。
作为优选，所述步骤一中最适反应条件的筛选方法为：
采用正交试验法，选用Tris缓冲液，以反应终止后第一底物在体系中的含量最低时的反应条件为最适反应条件，筛选出肝微粒体、第一底物、MgCl2和NADPH的最适浓度及最适反应时间；
在肝微粒体、第一底物、MgCl2和NADPH的最适浓度及最适反应时间下，采用Tris缓冲液和PBS缓冲液做平行试验，以反应终止后第一底物在体系中含量最低的一组中所采用的缓冲液为最佳的缓冲液；
采用单因素试验法，在肝微粒体、第一底物、MgCl2和NADPH的最适浓度、最适反应时间及最适缓冲液下，筛选抑制剂的最适反应浓度，以抑制剂对降解第一底物的酶出现明显抑制作用时的浓度为抑制剂的最适浓度。
进一步优选，所述抑制剂最适浓度的筛选中，需要对抑制剂特异性进行验证，所述抑制剂特异性的验证方法为：
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、第一底物、MgCl2、抑制剂混合，再加入NADPH启动反应，反应终止后，检测第一底物在体系中的含量；
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、第二底物、MgCl2、抑制剂混合，再加入NADPH启动反应，反应终止后，检测第二底物在体系中的含量；
其中，所述抑制剂与降解第一底物的酶相对应；
若第一底物和第二底物均未被代谢，说明抑制剂能够抑制降解第二底物的酶，此时应当降低抑制剂的浓度，至抑制剂能够明显抑制降解第一底物的酶，而不抑制降解第二底物的酶。
进一步优选，所述步骤“采用正交试验法，选用Tris缓冲液，以反应终止后第一底物在体系中的含量最低时的反应条件为最适反应条件，筛选出肝微粒体、第一底物、MgCl2和NADPH的最适浓度及最适反应时间”中，所述第一底物系列浓度的选择方法为：确认降解第一底物的酶的Km值，Km值即酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的第一底物浓度，选择1/3Km值和3Km作为第一底物系列浓度的两个端点值。
进一步优选，所述步骤“采用单因素试验法，在肝微粒体、第一底物、MgCl2和NADPH的最适浓度、最适反应时间及最适缓冲液下，筛选抑制剂的最适反应浓度，以抑制剂对降解第一底物的酶出现明显抑制作用时的浓度为抑制剂的最适浓度”中，所述抑制剂系列浓度的选择方法为：确认抑制剂的Ki值，Ki值为50％的酶被抑制剂结合时对应的游离抑制剂的浓度，选择2Ki值和4Ki值作为抑制剂系列浓度的两个端点值。
作为优选，所述步骤二中新化学实体在体系中的含量的检测方法为：反应终止后，采用LC-MS/MS测定。
本发明的有益效果如下：
本发明对筛选体系中肝微粒体、第一底物浓度、抑制剂浓度、反应时间进行了验证与优化，有效减少了假阴性与假阳性的发生率，提高了新化学实体代谢肝CYP450亚型酶鉴定结果的可靠性，为促进新药研发提供可靠的依据。
本发明在对新化学实体代谢肝CYP450亚型酶筛选时，同时设置了筛选试验和多项验证试验，确保了筛选结果的可靠性，当出现阴性结果时，能够快速判断其阴性结果的原因。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例公开了一种代谢新化学实体肝CYP450亚型酶的筛选方法，其首先建立筛选体系，在筛选体系中进行亚型酶筛选反应和验证试验，根据亚型酶筛选反应和验证试验的结果，对亚型酶筛选结果进行判断。
试验中，新化学实体和第一底物原型成分的测试均是采用LC-MS/MS测定。使用LC-MS/MS检测前，需要对LC-MS/MS进行优化和方法学验证，具体参照《药典》9012中记载的内容。
本实施例代谢新化学实体肝CYP450亚型酶的筛选方法，其具体步骤如下：
步骤一、建立筛选体系：
本实施例要建立的筛选体系，其能够对肝CYP450酶的主要亚型酶进行筛选。在筛选体系的建立中，选取肝CYP450酶的主要亚型对应的特异性底物和相应的抑制剂，对每个底物都建立一个筛选体系。即，对选取的底物所对应的肝CYP450亚型酶的最适筛选条件进行筛选。
每个底物筛选体系的建立方法是相同的，以下以第一底物为例，作详细阐述：
1.采用正交试验法，选用Tris缓冲液，以反应终止后第一底物在体系中的含量最低时的反应条件为最适反应条件，筛选出肝微粒体、第一底物、MgCl2和NADPH的最适浓度和最适反应时间。其中NADPH用于启动反应，在肝微粒体、第一底物和MgCl2溶解于Tris缓冲液中后，再加入NADPH。所述第一底物即为：与所述抑制剂对应酶的特异性底物。
肝微粒体系列浓度设置为0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL。
第一底物系列浓度的选择方法为：确认降解第一底物的酶的Km值，Km值即酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的第一底物浓度。试验中所用的底物都是现有技术中既定的底物，其Km值也是公知的，Km值只需查阅已公开的文献即能得到。但由于Km值为试验数据，在不同的文献中会有差异，取查阅到的Km值中的一个中位数作为本实施例采纳的Km值，再选择1/3Km值和3Km作为第一底物系列浓度的两个端点值。
NADPH和MgCl2的系列浓度均设置为10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L。NADPH和MgCl2最适浓度的选择依据为：在确保反应最大程度发生的前提下，选择最小浓度。
反应时间考察5min、10min、20min、30min、45min、60min。反应时间的选择依据为：使第一底物的原型成分减少80％以上，以达到减少80％的时间点作为最适反应时间。
2.在肝微粒体、第一底物、MgCl2和NADPH的最适浓度和最适反应时间下，采用Tris缓冲液和PBS缓冲液做平行试验，反应终止后，比较Tris缓冲液组和PBS缓冲液组中第一底物在体系中的含量，以最低的一组中所采用的缓冲液为最佳的缓冲液。
3.采用单因素试验法，在肝微粒体、第一底物、MgCl2和NADPH的最适浓度、最适反应时间，以及最适缓冲液下，筛选抑制剂的最适反应浓度。抑制剂与降解第一底物的酶相对应。
抑制剂的最适反应浓度的筛选依据为：以抑制剂对降解第一底物的酶出现明显抑制作用时的浓度为抑制剂的最适浓度。即反应终止后，加抑制剂组的第一底物的量明显高于不加抑制剂组的第一底物的量，即说明降解第一底物的酶被抑制剂明显抑制。
抑制剂系列浓度的选择方法为：确认抑制剂的Ki值。Ki值为50％的酶被抑制剂结合时对应的游离抑制剂的浓度。试验中所用的抑制剂是现有技术中既定的，其Ki值也是公知的。Ki值只需查阅已公开的文献即能得到。但由于Ki值为试验数据，在不同的文献会有差异，取查阅到的Ki值中的一个中位数作为本实施例采纳的Ki值，选择2Ki值和4Ki值作为抑制剂系列浓度的两个端点值。
在抑制剂最适浓度的筛选中，还需要对抑制剂特异性进行验证，验证方法为：
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、第一底物、MgCl2、抑制剂混合，再加入NADPH启动反应，反应终止后，检测第一底物在体系中的含量；
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、第二底物、MgCl2、抑制剂混合，再加入NADPH启动反应，反应终止后，检测第二底物在体系中的含量；
比较反应前和反应终止后第一底物在体系中的含量，若第一底物在体系中的含量未减少，说明第一底物未被代谢，若第一底物含量明显减少，说明第一底物被代谢。
比较反应前和反应终止后第二底物在体系中的含量，若第二底物在体系中的含量未减少，说明第二底物未被代谢，若第二底物含量明显减少，说明第二底物被代谢。
第一底物被代谢而第二底物未被代谢，则说明抑制剂只抑制降解第一底物的亚型酶。
若第一底物和第二底物均未被代谢，说明抑制剂能够抑制降解第二底物的亚型酶，此时应当降低抑制剂的浓度，至抑制剂能够明显抑制降解第一底物的亚型酶，而不抑制降解第二底物的亚型酶。
换言之，对抑制剂最适浓度的筛选主要包括单因素试验法筛选出一个初步的最适浓度，再以初步的最适浓度进行抑制剂特异性验证，根据抑制剂特异性验证结果，对初步的最适浓度进行调整，从而得到最终的最适浓度，此最终的最适浓度为本实施例采纳的抑制剂最适浓度。
4.经过上述的筛选和调整过程，得到筛选体系的最适反应条件，最适反应条件包括最适反应时间、最适缓冲液种类、肝微粒体最适浓度、第一底物最适浓度、MgCl2最适浓度、抑制剂最适浓度和NADPH最适浓度。
筛选体系中NADPH用于启动反应，需要在其他成分混合好后再加入。反应终止时加入终止剂乙腈来终止反应。
本实施例筛选体系中，若肝微粒体浓度过高，会造成代谢能力过强，从而造成假阳性结果；若肝微粒体浓度过低，会造成代谢能力太弱，从而造成假阴性结果。若第一底物浓度过高，则肝微粒体对第一底物的代谢不明显，出现假阴性结果；若第一底物浓度过低，则抑制剂对酶产生的抑制效果不明显，出现假阳性结果。若抑制剂浓度太高，则抑制能力太强，出现假阳性结果；若抑制剂浓度太低，则抑制效果不明显，出现假阴性结果。NADPH用于对体系供能，满足反应需求即可，若浓度太高，造成浪费。反应时间若太长，可能出现假阳性结果，反应时间若太短，可能出现假阴性结果。本实施例筛选了最佳的反应条件，避免了假阳性和假阴性结果的出现。
阳性即该亚型酶参与新化学实体代谢。阴性即该亚型酶不参与新化学实体代谢。
步骤二、亚型酶筛选反应和验证试验：
参与NCE代谢的肝CYP450亚型酶一般包括多个。在亚型酶筛选反应和验证试验中，采用步骤一中的筛选体系对主要的亚型酶依次进行筛选，获取参与NCE代谢的肝CYP450亚型酶。每个肝CYP450亚型酶的筛选反应和验证试验步骤都是相同的，以下以降解第一底物的肝CYP450亚型酶为例，作详细阐述：
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、新化学实体、MgCl2、抑制剂混合，再加入NADPH启动筛选反应，达到反应时间后，加入终止剂终止反应，再采用LC-MS/MS测定新化学实体在体系中的含量，得到加抑制剂组的新化学实体的代谢结果。
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、新化学实体、MgCl2、抑制剂溶媒混合，再加入NADPH启动验证反应，达到反应时间后，加入终止剂终止反应。采用LC-MS/MS测定新化学实体在体系中的含量，得到不加抑制剂组的新化学实体的代谢结果。其中，抑制剂是溶解在抑制剂溶媒中的，不加抑制剂时，需要加入同等的抑制剂溶媒，以确保反应结果的准确性。
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、第一底物、MgCl2、抑制剂混合，再加入NADPH启动验证反应，达到反应时间后，加入终止剂终止反应。采用LC-MS/MS检测加抑制剂组的第一底物在体系中的含量，得到加抑制剂组的第一底物的代谢结果。
在最适反应条件下，将缓冲液、肝微粒体、第一底物、MgCl2、抑制剂溶媒混合，再加入NADPH启动验证反应，达到反应时间后，加入终止剂终止反应。采用LC-MS/MS检测不加抑制剂组的第一底物在体系中的含量，得到不加抑制剂组的第一底物的代谢结果。
在进行筛选试验时，由于酶活、试剂误差、人为操作等因素，容易对筛选结果造成影响，通过设置验证试验，避免了假阴性和假阳性的检测结果，使得筛选结果准确、可靠。
最适缓冲液为Tris缓冲液或PBS缓冲液的一种，选用步骤一中筛选得到的最适缓冲液。
步骤三、亚型酶筛选结果判断：
本实施例中用到的底物都是现有技术中既定的，其在筛选体系中的代谢结果也是可预知的。因此，若所用的底物在筛选体系中的代谢结果达到预期值，则认为此次筛选没有问题，试验成功，接受新化学实体的筛选反应结果。
步骤二中反应终止后，比较不加抑制剂组和加抑制剂组的第一底物在体系中的含量，若不加抑制剂组比加抑制剂组低一半，则表示，不加抑制剂组的第一底物被代谢，而加抑制剂组的第一底物未被代谢。
步骤二中反应终止后，比较不加抑制剂组和加抑制剂组的新化学实体在体系中的含量，若不加抑制剂组比加抑制剂组低一半，则表示，不加抑制剂组的新化学实体被代谢，而加抑制剂组的新化学实体未被代谢。
若加抑制剂组的第一底物被代谢，则不论加抑制剂组的新化学实体是否被代谢，均不接受筛选反应结果。
若不加抑制剂组的第一底物未被代谢，则不论加抑制剂组的新化学实体是否被代谢，均不接受筛选反应结果。
上述不接受筛选反应结果的原因是：第一底物和抑制剂是关联同一个酶，抑制剂必然可以抑制该降解第一底物的酶，因此加抑制剂组的第一底物必然是不能被代谢的，同样的不加抑制剂组的第一底物必然是可以被代谢的。
若不加抑制剂组的第一底物被代谢，加抑制剂组的第一底物未被代谢，则考量新化学实体的代谢结果，具体如下：
若不加抑制剂组的新化学实体被代谢，加抑制剂组的新化学实体也被代谢，说明降解第一底物的酶对新化学实体不起作用，即说明降解第一底物的酶不参与新化学实体的代谢，该酶不是本实施例所要筛选的代谢肝CYP450亚型酶。
若不加抑制剂组的新化学实体被代谢，加抑制剂组的新化学实体不被代谢，说明降解第一底物的酶参与新化学实体的代谢，该酶是本实施例所要筛选的代谢肝CYP450亚型酶。
若不加抑制剂组的新化学实体和加抑制剂组的新化学实体均不被代谢，则表明新化学实体不经过肝CYP450亚型酶代谢。
若不加抑制剂组的新化学实体不被代谢，加抑制剂组的新化学实体被代谢，试验结果违背常理，考虑不接受实验结果，重复试验。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
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