阅读说明：本技术 一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法 (Cell membrane chromatographic column preparation method for efficiently screening specific medicines for bacterial infection ) 是由 杨天逸 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法,包括制备全细胞蛋白提取液、制备APTES共价修饰后的硅胶、细胞膜和硅胶键合及湿法装柱四个步骤。本发明以具有活性的败血症细菌细胞膜及受体为固定相,利用细胞膜自身的融合作用和硅胶表面硅羟基(Si—OH)相互吸附制备成细胞膜色谱固定相,该方法最大限度地保持了细胞膜的完整性、膜受体的四级空间结构以及膜受体的生物活性。比现有筛选方法和技术更加精减,制作成本更低,可规模化生产,质量可控,性能优良,成本合理,能填补市场空缺,市场需求大,生产成本低,制备工艺成熟,同时能完全保证生产质量安全,有效地降低了投资门槛和投资风险。(A method for preparing a cell membrane chromatographic column for efficiently screening specific drugs for bacterial infection comprises four steps of preparing a whole cell protein extracting solution, preparing APTES covalently modified silica gel, bonding cell membranes and the silica gel, and filling the column by a wet method. The invention takes the active septicemia bacteria cell membrane and receptor as the stationary phase, and prepares the cell membrane chromatographic stationary phase by utilizing the fusion of the cell membrane and the mutual adsorption of silicon hydroxyl (Si-OH) on the surface of silica gel, and the method furthest maintains the integrity of the cell membrane, the quaternary space structure of the membrane receptor and the biological activity of the membrane receptor. Compared with the existing screening method and technology, the method has the advantages of more precise reduction, lower manufacturing cost, large-scale production, controllable quality, excellent performance, reasonable cost, capability of filling the gap of the market, large market demand, low production cost and mature preparation process, can completely ensure the safety of the production quality, and effectively reduces the investment threshold and the investment risk.)

一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法。

背景技术

细菌感染是致病菌侵入血液系统，并能在血中生长繁殖，产生大量毒素进而引发急性全身性感染。该病危害性大、易导致死亡。因此，快速筛选出引发感染的细菌的特效药，确定抗生素的选择和使用，能减少盲目用药，缩短患者治疗时间。现有技术中由于技术限制，对于快速筛选出引发感染的细菌的特效药还存在较大缺点，不能满足实际需要。

发明内容

为了克服现有技术中存在的如背景所述弊端，本发明提供了采用高表达的败血症细菌细胞膜为主原料，比现有筛选方法和技术更加精减，制作成本更低，可规模化生产，质量可控，性能优良，成本合理，能填补市场空缺，市场需求大，生产成本低，制备工艺成熟，同时能完全保证生产质量安全，有效地降低了投资门槛和投资风险的一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法，其特征在于包括制备全细胞蛋白提取液、制备APTES共价修饰后的硅胶、细胞膜和硅胶键合及湿法装柱四个步骤；所述全细胞蛋白提取液制备中，采用变性裂解液以及非变性裂解液作为试剂，采用离心机、1.5ml离心试管和中部具有一道隔膜的50ml柱形聚乙烯离心试管作用提取工具，经以下几个步骤制得，第一步：把细胞放于1.5ml离心试管中，并加入1ml的PBS细胞洗涤溶液，然后用离心机离心3分钟，弃除上清，离心、弃除上清流程共重复三次，第二步，根据细胞沉淀体积加入预冷的PBS细胞洗涤溶液，进行细胞重悬，第三步，根据离心试管内细胞量加入变性裂解液，震荡15s，第四步，将震荡后裂解液转移于50ml柱形聚乙烯离心试管内，离心机离心30s后，收集管底的裂解液即为全细胞蛋白提取液；所述制备APTES共价修饰后的硅胶中，用有特定蛋白高表达的细胞制备细胞膜层析柱，加入其抑制剂，使用ph7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，以去除非特异性结合的杂质，随后采用ph3.3的磷酸盐缓冲液洗脱缓冲液，收集洗脱液，经浓缩后，高效液相检测；所述细胞膜和硅胶键合中，在真空涡旋的条件下，将细胞膜悬液和硅胶常温下混合反应5 rain，然后冰浴条件下搅拌50 rain，得到的细胞膜．硅胶混悬液，置于4℃冰箱中静置过夜；所述湿法装柱中，采用Waters996．515型液相泵，以PBS缓冲液为流动相将细胞膜．硅胶混悬液装填到细胞膜色谱柱芯中，梯度升速，0．5 min：0．2—1．0 mL／min，然后在O．2 mL／min流速下平衡30 rain，从而得到稳定的柱压；细胞膜色谱柱浸泡在PBS缓冲液中，4℃条件下保存备用。

进一步地，所述制备APTES共价修饰后的硅胶中，硅胶表面含有丰富的硅羟基(Si—OH)，先和(3．氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应后链接上了氨基，然后和戊二醛反应，链接上一个醛基；细胞膜是由丰富的磷脂构成的，因此含有大量氨基；键合了醛基的硅胶和细胞膜上氨基发生氨醛缩合反应，从而使硅胶和细胞膜以共价的方式结合。

进一步地，所述制备APTES共价修饰后的硅胶中，分为如下步骤，（1）精确称取1 g硅胶粉末，量取0．5 mLAPTES一起加入到50 mL甲苯体系中，在N2 保护下，油浴锅中恒温加热回流反应12 h；（2）将混悬液收集并在12009×5 min室温条件下离心，弃上清，留沉淀；沉淀用HEPES 缓冲液(100 mM)清洗3次后80℃恒温烘干，得干燥粉末；（3）干燥粉末加入500mL 5％戊二醛甲醇溶液常温搅拌2 h，此时溶液由白色变成砖红色；在1200Gx 5 min室温条件下离心，弃上清，留沉淀；沉淀用HEPES缓冲液清洗3次；（4）沉淀加入500 mL磷酸钠溶液(100 mM，pH=8)常温搅拌2 h，使反应后的基团展开，混悬液在12009×5 min室温条件下离心，弃上清，留沉淀。沉淀用HEPES缓冲液清洗3次；（5）沉淀在80℃恒温条件下烘干，得干燥砖红色粉末即为APTES共价修饰后的硅胶。

本发明有益效果是：本发明以具有活性的败血症细菌细胞膜及受体为固定相，利用细胞膜自身的融合作用和硅胶表面硅羟基(Si—OH)相互吸附制备成细胞膜色谱固定相，该方法最大限度地保持了细胞膜的完整性、膜受体的四级空间结 构以及膜受体的生物活性。比现有筛选方法和技术更加精减，制作成本更低，可规模化生产，质量可控，性能优良，成本合理，能填补市场空缺，市场需求大，生产成本低，制备工艺成熟，同时能完全保证生产质量安全，有效地降低了投资门槛和投资风险。基于上述，所以本发明具有好的应用前景。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明.

图1是本发明流程框图。

具体实施方式

图1中所示，一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法，包括制备全细胞蛋白提取液、制备APTES共价修饰后的硅胶、细胞膜和硅胶键合及湿法装柱三个步骤；所述全细胞蛋白提取液制备中，采用变性裂解液以及非变性裂解液作为试剂，采用离心机、1.5ml离心试管和中部具有一道隔膜的50ml柱形聚乙烯离心试管作用提取工具，经以下几个步骤制得，第一步：把细胞放于1.5ml离心试管中，并加入1ml的PBS细胞洗涤溶液，然后用离心机离心3分钟，弃除上清，离心、弃除上清流程共重复三次，第二步，根据细胞沉淀体积加入预冷的PBS细胞洗涤溶液，进行细胞重悬，第三步，根据离心试管内细胞量加入变性裂解液，震荡15s，第四步，将震荡后裂解液转移于50ml柱形聚乙烯离心试管内，离心机离心30s后，收集管底的裂解液即为全细胞蛋白提取液。

图1中所示，制备APTES共价修饰后的硅胶中，用有特定蛋白高表达的细胞制备细胞膜层析柱，加入其抑制剂，使用ph7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，以去除非特异性结合的杂质，随后采用ph3.3的磷酸盐缓冲液洗脱缓冲液，收集洗脱液，经浓缩后，高效液相检测；所述细胞膜和硅胶键合中，在真空涡旋的条件下，将细胞膜悬液和硅胶常温下混合反应5 rain，然后冰浴条件下搅拌50 rain，得到的细胞膜．硅胶混悬液，置于4℃冰箱中静置过夜；所述湿法装柱中，采用Waters996．515型液相泵，以PBS缓冲液为流动相将细胞膜．硅胶混悬液装填到细胞膜色谱柱芯中，梯度升速，0．5 min：0．2—1．0 mL／min，然后在O．2 mL／min流速下平衡30 rain，从而得到稳定的柱压；细胞膜色谱柱浸泡在PBS缓冲液中，4℃条件下保存备用。硅胶表面含有丰富的硅羟基(Si—OH)，先和(3．氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应后链接上了氨基，然后和戊二醛反应，链接上一个醛基；细胞膜是由丰富的磷脂构成的，因此含有大量氨基；键合了醛基的硅胶和细胞膜上氨基发生氨醛缩合反应，从而使硅胶和细胞膜以共价的方式结合。制备APTES共价修饰后的硅胶中，分为如下步骤，（1）精确称取1 g硅胶粉末，量取0．5 mLAPTES一起加入到50 mL甲苯体系中，在N2 保护下，油浴锅中恒温加热回流反应12 h；（2）将混悬液收集并在12009×5 min室温条件下离心，弃上清，留沉淀。沉淀用HEPES 缓冲液(100 mM)清洗3次后80℃恒温烘干，得干燥粉末；（3）干燥粉末加入500 mL5％戊二醛甲醇溶液常温搅拌2 h，此时溶液由白色变成砖红色。在1200Gx 5 min室温条件下离心，弃上清，留沉淀。沉淀用HEPES缓冲液清洗3次；（4）沉淀加入500 mL磷酸钠溶液(100mM，pH=8)常温搅拌2 h，使反应后的基团展开，混悬液在12009×5 min室温条件下离心，弃上清，留沉淀。沉淀用HEPES缓冲液清洗3次；（5）沉淀在80℃恒温条件下烘干，得干燥砖红色粉末即为APTES共价修饰后的硅胶。

本发明以具有活性的败血症细菌细胞膜及受体为固定相，利用细胞膜自身的融合作用和硅胶表面硅羟基(Si—OH)相互吸附制备成细胞膜色谱固定相，该方法最大限度地保持了细胞膜的完整性、膜受体的四级空间结 构以及膜受体的生物活性。比现有筛选方法和技术更加精减，制作成本更低，可规模化生产，质量可控，性能优良，成本合理，能填补市场空缺，市场需求大，生产成本低，制备工艺成熟，同时能完全保证生产质量安全，有效地降低了投资门槛和投资风险。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明.因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。