一种核酸恒温扩增定量检测方法
阅读说明：本技术 一种核酸恒温扩增定量检测方法 (Nucleic acid constant-temperature amplification quantitative detection method ) 是由 曹志 单虎 刘盛龙 周士硕 马帅 于 2021-02-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物检测技术领域,具体涉及一种核酸恒温扩增定量检测方法。基于环介导等温扩增方法,在反应体系内添加聚丙烯酰胺或海藻糖,以目标基因拷贝数为横坐标、光强度曲线拐点的时间为纵坐标,拟合得到基因拷贝数与曲线拐点的时间的关系曲线,即标准曲线；根据标准曲线和曲线拐点的时间得到定量检测数据。本发明在建立的病毒和细菌的现场快速高灵敏检测技术的基础上,通过对目标基因不同拷贝数检测光强度曲线的研究,确定基因拷贝数与曲线拐点时间关系的定量曲线,并在反应体系内添加一些表面活性剂或提高体系黏度和热稳定性的化学制剂,来分析它们与定量的相关性,优化定量曲线,最终实现病原的快速简便、灵敏特异和定量的检测。(The invention belongs to the technical field of microbial detection, and particularly relates to a nucleic acid constant-temperature amplification quantitative detection method. Based on a loop-mediated isothermal amplification method, adding polyacrylamide or trehalose into a reaction system, and fitting to obtain a relation curve of the copy number of a target gene and the inflection point time of a curve of light intensity by taking the copy number of the gene as an abscissa and the inflection point time of the curve as an ordinate, namely a standard curve; and obtaining quantitative detection data according to the time of the standard curve and the inflection point of the curve. On the basis of the established on-site rapid high-sensitivity detection technology of viruses and bacteria, the quantitative curve of the relationship between the gene copy number and the inflection point time of the curve is determined through the research on the detection light intensity curves of different copy numbers of target genes, and certain surfactants or chemical agents for improving the viscosity and the thermal stability of the system are added into a reaction system to analyze the correlation between the gene copy number and the inflection point time of the curve and optimize the quantitative curve, so that the rapid, simple, sensitive, specific and quantitative detection of pathogens is finally realized.)
技术领域：
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种核酸恒温扩增定量检测方法。
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)是目前检测病原核酸最为常用的方法，但由于依赖成本昂贵的PCR仪，且耗时费力，难以满足当前病原微生物快速检测与鉴定的需求。核酸恒温扩增技术(Nucleic acid isothermal amplification technology,NAIAT)因其反应温度的单一性、检测程序简单快速、摆脱了高精密的仪器等优势，代表着核酸扩增技术未来发展的新趋势。常见的NAIAT有：环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)、滚环扩增技术(Rolling circle amplification,RCA)、依赖核酸序列型扩增技术(Nucleic acidsequence-based amplification,NASBA)、链置换扩增技术(Strand displacementamplification,SDA)、依赖解旋酶的等温扩增技术(Helicase-dependent isothermal DNAamplification,HDA)等。
近年来，NAIAT被广泛应用到流行疾病病原的检测、食品安全的监测和环境微生物检测等领域，尤其是以LAMP技术的应用最为明显。在美国国立生物技术信息中心(NationalCenter ofBiotechnology Information,NCBI)选择PubMed数据库，当输入“Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP”转换至最佳匹配时可供参考文献有2421篇(截止2020年11月30日)，从相关文献资料分析看出，LAMP是最适合于现场低成本检测的核酸恒温扩增方法。本课题组今年来致力于解决LAMP在实际应用种存在各类问题，如，利用石蜡分割体系有效解决了气溶胶污染问题；将TaqMan探针引入到LAMP技术，从而实现了对扩增产物的直接检测，也就从根本上解决了非特异扩增的问题。当前，LAMP法面临的最大问题就是能否实现绝对定量，临床上的一些病毒检测要求绝对定量，LAMP法将来要走向临床应用，就必须克服这一问题，因为LAMP扩增的过程常呈现“无序化”扩增，产物片段大小不一，至今也没有一个完整的数学模型，也就没有一个数学推导公式来支持LAMP的定量应用，我们在试验中发现对于一些一定浓度的模板，LAMP的重现性非常好，而对于另外一些浓度的模板，则其的重现性变的不规律。如何实现定量检测是当前基于LAMP检测中需要解决的关键科学问题。
发明内容
：本发明要解决的技术问题是LAMP扩增的过程常呈现“无序化”扩增，产物片段大小不一，至今也没有一个完整的数学模型，也就没有一个数学推导公式来支持LAMP的定量应用，所以能否基于LAMP检测实现定量检测是急需解决的问题。
为解决上述问题，本发明提供了一种核酸恒温扩增定量检测方法，在建立的病原现场快速高灵敏检测技术的基础上，通过对目标基因不同拷贝数检测光强度曲线的研究，确定基因拷贝数与曲线拐点时间关系的定量曲线，并在反应体系内添加一些表面活性剂或提高体系黏度和热稳定性的化学制剂，来分析它们与定量的相关性，优化定量曲线，最终实现病原的快速简便、灵敏特异和定量的检测。
为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：一种核酸恒温扩增定量检测方法，基于环介导等温扩增方法，在反应体系内添加一定浓度的聚丙烯酰胺或海藻糖，以目标基因拷贝数为纵坐标、光强度曲线拐点的时间为横坐标，拟合得到基因拷贝数与曲线拐点的时间的关系曲线，即标准曲线；根据标准曲线和曲线拐点的时间得到定量检测数据。
其中，聚丙烯酰胺(Polyacrylamide，PAM)是一种常用的非离子型高分子絮凝剂，PAM分子中的酰胺基具有很高的活性，包括增稠、絮凝和降阻等多种性质，因而在石油开采、水处理、纺织印染、造纸、洗煤、医药、制糖、农业等行业具有广泛的应用，有“百业助剂”、“万能产品”之称。PAM溶于反应体系后，能显著降低溶液的表面张力或界面张力，并能改进溶液的增溶和分散能力，使反应体系的检测重复性显著提高，进而实现“有序化”扩增。
进一步的，在基础反应体内添加1.0％PAM对目标基因的定量检测具有很好的相关性，标准曲线为Y＝－0.2377X+11.303，R2＝0.9907。
海藻糖是天然双糖中最稳定的一类。由于不具有还原性，对热和酸碱都具有非常好的稳定性。海藻糖还具有低吸湿特性和高玻璃化转变温度，这些特性结合海藻糖的工艺稳定性，使其成为一种高蛋白质防护剂和理想的喷雾干燥风味保持剂。其次，海藻糖对生物大分子和生物体的非特异性保护作用，其保护机制一般被认为是机体含有海藻糖的部分强力地束缚水分子，与膜脂质共同拥有结合水或海藻糖本身起到代替膜结合水的功用，从而防止生物体膜和膜蛋白的变性等。基于海藻糖的上述功能，其加入反应体系，使热敏感的酶在高温下稳定性和活性增加，进而提高检测重复性，有助于实现“有序化”扩增。
进一步的，在反应体内添加15％海藻糖对目标基因的定量检测具有很好的相关性，标准曲线为Y＝－0.2072X+12.16，R2＝0.9917。
本发明的有益效果在于：
(1)实现了核酸恒温扩增定量检测，该检测方法具有简便、低成本、定量的特点，可应用于采用恒温扩增检测的各类病原体核酸的定量检测。
(2)给出了聚丙烯酰胺和海藻糖在核酸恒温扩增定量检测方面的应用。
附图说明
图1是反应体内添加1.0％PAM对目标基因的定量检测相关性；
图2是反应体内添加15％海藻糖对目标基因的定量检测相关性。
具体实施方式
：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，均采用分析纯试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配置。
对目标基因检测的设备伯乐CFX Connect实时荧光定量PCR仪，购自Bio-RadLaboratories.Ltd.,California,USA。反应条件：65℃等温扩增，每30s读取数值一次连续读取75min内的荧光值。
急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosis disease,AHPND)阳性及无特定病原(Special pathogen free,SPF)的凡纳滨对虾组织，均由中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海水养殖病害防治重点实验室保存并提供。
反应体系的基础组分：Bst 2.0DNA聚合酶、10×Bst buffer、10mMdNTPs、5M Betaine、100mM MgSO4、350mM MnCl2、3.5mM Caclein、病原的特异性引物以及无RNase/DNase水。其中：
Bst 2.0DNA聚合酶及配套10×Bstbuffer和100mM MgSO4(#M0538L)，购自NEB。
5M Betaine(非盐酸盐)：购买甜菜碱(C5H11NO2，分子量117.15)，分析纯试剂。称取甜菜碱117.15g，用100mL无RNase水溶解后，在专用pH计上用1M HCl调pH至8.0±0.2，加无RNase水定容至200mL。分装冻存于-20℃。
350mM MnCl2：购买无水氯化锰(MnCl2,MW 125.91)或者四水氯化锰(MnCl2·4H2O,MW197.91)，分析纯。称取4.407g无水氯化锰或者6.927g四水氯化锰，溶解于80mL无RNase水中，定容至100mL，分装为2mL/支，冻存于-20℃。
3.5mM Caclein：购买钙黄绿素(C30H26N2O13,MW 622.55)或钙黄绿素钠(Na2C30H26N2O13,MW 666.5)，分析纯。称取43.58mg钙黄绿素，加到6mL DMSO，溶解后，加约14mL无RNase水定容到20mL或者称取46.66mg钙黄绿素钠，溶解到20mL无RNase水中。所配溶液分装为0.5mL/支，冻存于-20℃。
无RNase/DNase水，购自TAKARA。
检测AHPND的特异性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。
实施例1：核酸恒温扩增技术对目标基因定量检测的研究
以AHPND为研究对象，在基础反应体系内分别添加不同浓度的甲醇、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺(PAM)、Triton X-100、Tween 20和海藻糖，通过对目标基因“pirA/B”不同拷贝数的检测光强度曲线研究，确定基因拷贝数与曲线拐点的时间，以目标基因拷贝数为纵坐标、光强度曲线拐点的时间为横坐标，拟合得到基因拷贝数与曲线拐点的时间的关系曲线，并分析其定量的相关性。
具体为：分别将107copies/μL的目标基因进行10倍梯度稀释至102copies/μL，各取1μL作为模板，研究反应体系内分别添加不同浓度的甲醇(2％、4％、6％)、乙醇(2％、4％、6％)、PVP(0.2％、0.5％、1.0％)、PAM(0.2％、0.5％、1.0％)、Triton X-100(0.2％、0.5％、1.0％)、Tween 20(0.2％、0.5％、1.0％)和海藻糖(5.0％、10.0％、15.0％)，通过伯乐CFXConnect实时荧光定量PCR仪来分析梯度拷贝数的目标基因引起的光强度曲线拐点时间的变化，考察基因拷贝数与光强度曲线拐点时间的变化的依赖关系，以此评价添加表面活性剂或提高体系黏度和热稳定性的化学制剂对基因的定量检测的精度、准度与动态范围等技术参数。
结果如表1所示，表明在反应体内添加1.0％PAM和15％海藻糖对基因的定量检测具有很好的相关性，标准曲线分别为Y＝－0.2377X+11.303，R2＝0.9907和Y＝－0.2072X+12.16，R2＝0.9917。(详见表1)
表1核酸恒温扩增技术对目标基因定量检测结果
注：“-”表示此浓度显著抑制扩增反应。
实施例2：核酸恒温扩增定量检测方法在临床样本检测的应用研究
用已建立的恒温扩增仪定量检测方法对临床送检疑似AHPND样本进行检测，同时采用世界动物卫生组织(OIE)《Manual ofDiagnostic Tests forAquaticAnimals》检测AHPND的Taq Man探针实时荧光定量PCR法进行复检，试验均重复3次，根据二者标准曲线计算每微升AHPND DNA的拷贝数。使用t检验方法分别对二者检测结果进行p值分析。
结果如表2、表3所示，反应体内添加1.0％PAM或15％海藻糖时，采用Taq Man探针实时荧光定量PCR法和核酸恒温扩增定量检测方法分别对临床样本的定量检测结果差异不显著(p＞0.05)，表明核酸恒温扩增定量检测方法对临床样本的定量检测具有极好的可重复性。
表2反应体内添加1.0％PAM对临床样本的定量检测结果
注：Taq Man探针实时荧光定量PCR法拟合标准曲线为Y＝－0.2938X+12.834，R2＝0.9991；p＞0.05表示差异不显著，p＜0.05表示差异显著。
表3反应体内添加15％海藻糖对临床样本的定量检测结果
注：Taq Man探针实时荧光定量PCR法拟合标准曲线为Y＝－0.2938X+12.834，R2＝0.9991；p＞0.05表示差异不显著，p＜0.05表示差异显著。
由上述实施例可知，本发明提供了一种核酸恒温扩增定量检测方法，利用该检测方法具有简便、低成本、定量的特点，可应用于采用恒温扩增检测的各类病原体核酸的定量检测。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
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