一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒及其检测方法
阅读说明：本技术 一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒及其检测方法 (Gamma-glutamyl transpeptidase detection kit and detection method thereof ) 是由 冷毅斌 王长乐 敖慧龙 王振平 陈冬琴 于 2020-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒及其检测方法,所述检测盒包括基质缓冲液、酶提取液、底物、标准品和溶解稀释液,其中,基质缓冲液包括三(羟甲基)氨基甲烷和双甘肽,酶提取液为由三(羟甲基)氨基甲烷和盐酸制备的缓冲液,底物为L-γ-谷氨酰-4-硝基苯胺,标准品为对硝基苯胺,溶解稀释液为酸性DMSO。该检测试剂盒采用了一种既不影响γ-GT催化L-γ-谷氨酰-4-硝基苯胺的反应,又能有效溶解对硝基苯胺的溶剂体系,解决了现有技术中只能用纯理论方式计算对硝基苯胺生成量的问题,可以更加准确、直接的确定酶活力,且成本低、误差小。(The invention discloses a gamma-glutamyl transpeptidase detection kit and a detection method thereof, wherein the detection kit comprises a matrix buffer solution, an enzyme extract, a substrate, a standard substance and a dissolving diluent, wherein the matrix buffer solution comprises tris (hydroxymethyl) aminomethane and diglycine, the enzyme extract is a buffer solution prepared from tris (hydroxymethyl) aminomethane and hydrochloric acid, the substrate is L-gamma-glutamyl-4-nitroaniline, the standard substance is p-nitroaniline, and the dissolving diluent is acidic DMSO. The detection kit adopts a solvent system which does not affect the reaction of catalyzing L-gamma-glutamyl-4-nitroaniline by gamma-GT and can effectively dissolve p-nitroaniline, solves the problem that the production amount of the p-nitroaniline can only be calculated by a pure theoretical mode in the prior art, can more accurately and directly determine the enzyme activity, and has low cost and small error.)
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)广泛存在于人体各器官中，是γ-谷氨酰循环中的关键酶，催化GSH降解，具有参与调节组织中谷胱甘肽水平、氨基酸的吸收与排泄、以及肽链中自由氨基酸的酰化等作用。正常人血清γ-GT的活力很低，在急性肝炎、肝癌和梗阻性黄痘等患者的血清中，γ-GT活力显著升高，因而γ-GT活力的测定对于肝胆系统疾病的诊断有一定意义，有助于肝癌的诊断。
市面上有售以L-γ-谷氨酰基-4-硝基苯胺(GPNA)为底物的γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒，生成的显色物质为对硝基苯胺，检测波长为405nm。基于该原理的商品化试剂盒中，测定的结果主要有两种处理方式：
第一，直接以γ-谷氨酰转肽酶为标准品，测定标准曲线，对实验测试结果进行校正。此法的计算方式直接，但以酶作为标准品成本较高，且酶标准品在储存、运输及测定过程中容易部分失活，导致结果出现偏差，影响准确性。
第二种则可以通过测定一段时间内OD值的增加来计算对硝基苯胺的生成量，从而定义样本中的γ-GT酶活。此法以对硝基苯胺作为标准品，化学性质稳定，在405nm处有特征吸收，再通过速率法排除本底干扰，能有效测定出样本中的γ-谷氨酰转肽酶活力，同时具备较好的稳定性和准确性。
但目前市售的改法测试盒中，均没有设置对硝基苯胺标准孔。结果的计算或以对硝基苯胺的摩尔吸光系数进行纯理论转换，又或者直接给出对硝基苯胺的标准曲线进行计算。这样的理论计算，导致无法对实验条件所造成的系统误差进行校正，往往使得计算结果偏离测定真值，缺乏科学性。
究其原因，是因为目前无法找到一种合适的溶剂体系，使其既不会影响γ-GT催化L-γ-谷氨酰-4-硝基苯胺的反应，又能溶解对硝基苯胺，制得较高浓度的对硝基苯胺标准品溶液，从而令标准孔和测定孔的反应体系完全一致，排除试剂体系本身的干扰。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒，具体采用了一种既不影响γ-GT催化L-γ-谷氨酰-4-硝基苯胺的反应，又能有效溶解对硝基苯胺的溶剂体系，解决了现有技术中只能用纯理论方式计算对硝基苯胺生成量的问题。
为了实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：
一种γ-谷氨酰转肽酶的检测试剂盒，包括以下试剂：基质缓冲液、酶提取液、底物、标准品和溶解稀释液；
所述基质缓冲液包括三(羟甲基)氨基甲烷和双甘肽，pH为7.8-8.4；所述酶提取液为由三(羟甲基)氨基甲烷和盐酸制备的缓冲液；所述底物为L-γ-谷氨酰-4-硝基苯胺，所述标准品为对硝基苯胺，所述溶解稀释液为酸性二甲基亚砜(DMSO)。
优选的，在上述技术方案中，所述基质缓冲液中的三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为0.1-0.2mol/L，所述双甘肽的浓度为0.05-0.15mol/L。
优选的，在上述技术方案中，所述酶提取液中的三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为0.08-0.2mol/L。
优选的，在上述技术方案中，所述底物的质量为10-20mg，经溶解稀释液溶解后，底物溶液的浓度为10-20mmol/L。
优选的，在上述技术方案中，所述溶解稀释液中盐酸的含量为0.2-2％。
本发明还提供了一种测定γ-谷氨酰转肽酶活力的方法，具体为使用上述的检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：
S1、用酶提取液处理血清、血浆、组织或细胞样品，得待测样本并检测其总蛋白浓度Cpr；
S2、将底物用溶解稀释液溶解得到底物溶液，再与m倍体积的基质缓冲液混合得到反应工作液；将标准品用溶解稀释液溶解得到一系列不同浓度的标准品溶液，再分别与m倍体积的基质缓冲液混合得到一系列不同浓度的标准品工作液；
S3、酶标板上设置标准孔和测定孔，标准孔中加入V2体积的双蒸水，测定孔中加入V2体积的稀释f倍的待测样本；再向标准孔中加入V3体积的标准品工作液，向测定孔中加入V3体积的反应工作液，混匀；
S4、在温度T下孵育，酶标仪405nm测定两个固定时间点的OD值并计算变化值△A；
S5、绘制标准曲线，并通过以下公式计算酶活，γ-谷氨酰转肽酶活力的计算方式具体如下：
待测样本为组织或细胞样本时，采用式(1)
γ-GT酶活(U/gprot)＝(△A-b)÷a×V1÷V2÷Cpr÷T×f (1)
待测样本为血清或血浆时，，采用式(2)
γ-GT酶活(U/L)＝(△A-b)÷a×V1÷V2÷T×f (2)
其中，a为标准曲线的斜率，b：标准曲线截距，V1＝V3/(m+1)，所述式(1)中酶活的定义为：温度T下，每克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺的酶量为1个活性单位；所述式(2)中酶活的定义为：温度T下，每升液体样本每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺的酶量为1个活性单位。
优选的，在上述技术方案中，步骤S2所述m为2～6，即底物溶液或标准品溶液与基质缓冲液的体积比为1:2～6；更加优选的，所述m等于4。
优选的，在上述技术方案中，步骤S4所述待测样本加样时，应触酶标板底缓慢加样。
优选的，在上述技术方案中，步骤S5所述温度T为37℃，孵育过程具体为：37℃恒温箱中孵育1min，波长405nm处测定OD值，记为A1；再放入37℃恒温箱中准确孵育5min，波长405nm处测定OD值记为A2；△A＝A2-A1。
本发明的有益效果为：1)采用了酸性DMSO和基质缓冲液按比例混合的工作液体系，该反应体系既不影响γ-GT催化L-γ-谷氨酰-4-硝基苯胺的反应，又能溶解对硝基苯胺，使得标准孔和测定孔的反应体系完全一致，排除试剂体系本身的干扰，更加准确、直接的确定酶活力；2)相较于以γ-谷氨酰转肽酶作为标准品的方法，对硝基苯胺作为标准品成本更加低廉，且标准品稳定性更好，更容易存储；3)相较于市面上其他以对硝基苯胺为标准品的试剂盒，本发明中的试剂盒设置了相同反应体系下的标准曲线，使计算结果更加科学准确；4)通过检测前将底物与缓冲液充分混匀，在不影响测定结果的前提下，极大的降低了样本检测过程中的复孔差。
附图说明
图1实施例3中测定的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详述，但不应理解为是对本发明保护范围的限制。
实施例1
一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒，包含以下试剂：
基质液缓冲液：称取1.48g三(羟甲基)氨基甲烷和1.20g双甘肽，用双蒸水溶解并定容至100mL；取其30mL，1瓶，4℃保存。
底物粉剂：称取16mg的L-γ-谷氨酰-4-硝基苯胺粉剂，1支，4℃避光保存。
酶提取液：称取1.21g的三(羟甲基)氨基甲烷，双蒸水定容至100mL，2mol/L盐酸调节PH值至8.0；取其50mL，1瓶，4℃保存。
酸性DMSO：取500μL的浓度为10-12mol/L的浓盐酸，加入到30mLDMSO中，混合均匀后用DMSO定容至50mL；取其10mL，1瓶，4℃保存。
标准品粉剂：称取6.9mg的对硝基苯胺粉剂，1支，4℃避光保存。
实施例2
采用实施例1制备的检测试剂盒进行酶活力检测，具体步骤如下：
(1)样品的处理，不同类型样品的处理方法不同，具体可参考如下方法：
血清(浆)等液体样品：对于此类浑浊样品，需1000×g离心10min，取上清液作为待测样本。
组织样品：准确称取组织重量，按重量体积比为1g：9mL的比例加入酶提取液，冰水浴条件下匀浆，12000×g离心10min，取上清液作为待测样本。另外，此类待测样本需测总蛋白浓度，可用BCA法测蛋白浓度。
(2)反应工作液和标准品工作液的配制：
反应工作液的配制：将16mg的底物粉剂用3mL的酸性DMSO溶解得到底物溶液，然后与基质缓冲液按照1：4的体积比充分混匀。
标准品工作液的配制：标准品粉剂用酸性DMSO溶解得到不同浓度的标准品溶液，然后与基质缓冲液按照1：4的体积比充分混匀。
(3)待测样本的检测
将酶标板划分为标准孔和测定孔，具体的可参考下表：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
A
A
S1
S9
S17
S25
S33
S41
S49
S57
S65
S73
B
B
B
S2
S10
S18
S26
S34
S42
S50
S58
S66
S74
C
C
C
S3
S11
S19
S27
S35
S43
S51
S59
S67
S75
D
D
D
S4
S12
S20
S28
S36
S44
S52
S60
S68
S76
E
E
E
S5
S13
S21
S29
S37
S45
S53
S61
S69
S77
F
F
F
S6
S14
S22
S30
S38
S46
S54
S62
S70
S78
G
G
G
S7
S15
S23
S31
S39
S47
S55
S63
S71
S79
H
H
H
S8
S16
S24
S32
S40
S48
S56
S64
S72
S80
其中，A-H为标准孔，S1-S80为测定孔。
在室温(25-30℃)下，采用酶标板进行检测，具体过程为：向标准孔中加入V2体积的双蒸水，向测定孔中加入V2体积的且稀释f倍的待测样本；再向上述标准孔中加入5×V1体积的不同浓度的标准品工作液，向上述测定孔中加入5×V1体积的反应工作液(V1为底物溶液和标准品溶液的实际上样体积)，酶标仪振板10s混匀；37℃恒温箱中准确孵育1min，波长405nm处测定OD值，记为A1；再放入37℃恒温箱中准确孵育5min，波长405nm处测定OD值记为A2，△A测定孔＝A2-A1。
需要注意的是：
①数据处理时，标准孔不需要求差值，直接取5min测定的OD值做标准曲线即可；②若是大批量的样本，在正式检测前，需挑取1-2例预期差异大的样本，稀释成不同浓度进行预实验，选取OD值在0.2-0.8之间，再进行正式批量试验。
(3)γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活力的计算
待测样本为组织或细胞样本时
γ-GT酶活(U/gprot)＝(△A-b)÷a×V1÷V2÷Cpr÷T×f (1)
待测样本为血清或血浆时
γ-GT酶活(U/L)＝(△A-b)÷a×V1÷V2÷T×f (2)
其中，a：标准曲线的斜率，b：标准曲线截距，式(1)中酶活定义为：37℃条件下，每克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺的酶量为1个活性单位；式(2)中酶活定义为：37℃条件下，每升液体样本每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺的酶量为1个活性单位。
实施例3
采用实施例1中的试剂盒，按实施例2中的检测方法测定各标准孔的OD值，其中，V1是50μL，V2是25μL，检测结果如下：
根据上表数据绘制标准曲线，具体如图1所示。
并在相同反应体系下对人血清、马血清、小鼠血清和10％大鼠肝组织进行了检测，结果如下：
从检测结果中，可以发现测量的结果复孔差比较小；且在反应体系中，对硝基苯胺标准品的OD值线性良好。
本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
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