一种检测食品中冠状病毒的基因芯片制备方法
阅读说明：本技术 一种检测食品中冠状病毒的基因芯片制备方法 (Preparation method of gene chip for detecting coronavirus in food ) 是由 许嘉欣 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：一种检测食品中冠状病毒的基因芯片制备方法,包括RNA提取、RNA标记、预杂交与杂交、图像采集和分析四个步骤；所述RNA提取分为匀浆、两相分离、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀五个分步骤；所述RNA标记分为配制缓冲液BN、配制退火混合液、配制RT混合液三个分步骤；所述预杂交与杂交分为预杂交、杂交、洗膜、膜封闭、加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶、洗膜六个分步骤；所述图像采集和分析分为图象和数据采集、数据分析两个分步骤。本发明使基因芯片的探针密度大大提高,减少试剂的用量,能实现标准化和批量化大规模生产,实际应用中,可以同时出12个结果其中包含检测6个样品,2组平行的结果.检测结果只需18个小时.为无公害食品提供了理想检测手段。(A method for preparing gene chip for detecting coronavirus in food comprises RNA extraction, RNA labeling, prehybridization and hybridization, image acquisition and analysis; the RNA extraction comprises five sub-steps of homogenizing, two-phase separation, RNA precipitation, RNA cleaning and RNA precipitation redissolving; the RNA marking comprises three steps of preparing a buffer solution BN, preparing an annealing mixed solution and preparing an RT mixed solution; the prehybridization and hybridization are divided into six steps of prehybridization, hybridization, membrane washing, membrane sealing, addition of streptavidin coupled alkaline phosphatase and membrane washing; the image acquisition and analysis are divided into two sub-steps of image and data acquisition and data analysis. The invention greatly improves the probe density of the gene chip, reduces the dosage of the reagent, can realize standardized and mass large-scale production, and in practical application, 12 results including 6 samples can be simultaneously obtained, and 2 groups of parallel results can be obtained, and the detection result only needs 18 hours, thereby providing an ideal detection means for pollution-free food.)
技术领域
本发明涉及生物芯片制备方法技术领域，特别是一种检测食品中冠状病毒的基因芯片制备方法。
背景技术
基因芯片（Genechip，又称DNA芯片），其是基于分子杂交的原理，而产生的一种发明、高通量的基因测定方法。现有技术主要分为二种类型：（1）固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。（2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测.这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。
发明内容
为了克服现有微生物培养箱因结构所限存在的弊端，本发明提供了把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，能实现标准化和批量化大规模生产， 实际应用中，可以同时出12个结果其中包含检测6个样品，2组平行的结果.检测结果只需18个小时.为无公害食品提供了理想检测手段的一种检测食品中冠状病毒的基因芯片制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测食品中冠状病毒的基因芯片制备方法，其特征在于包括RNA提取、RNA标记、预杂交与杂交、图像采集和分析四个步骤；所述RNA提取分为匀浆、两相分离、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀五个分步骤；所述RNA标记分为配制缓冲液BN、配制退火混合液、配制RT混合液三个分步骤；所述预杂交与杂交分为预杂交、杂交、洗膜、膜封闭、加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶、洗膜六个分步骤；所述图像采集和分析分为图象和数据采集、数据分析两个分步骤。
进一步地，所述RNA提取的匀浆中，直接在3.5cm直径的培养盘中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞,裂解时用枪吸打几次；两相分离中，匀浆后样品于15到30°C孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离；RNA沉淀中，将水相转移到新离心管中，水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA；RNA清洗中，移去上清液,每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75%乙醇,清洗RNA沉淀、振荡后,4°C、7,500 × g离心5分钟；重新溶解RNA沉淀中，去除乙醇溶液,空气中干燥RNA沉淀5-10分钟。
进一步地，所述RNA标记的配制缓冲液BN中，取50μL的10X RT缓冲液，1μL的1 MDTT和50 μL的dNTP混合液,混匀,保存于–20 °C；配制退火混合液中，每个总RNA样品如下配制于一个灭菌PCR管中；配制RT混合液中，当退火混合液70 °C孵育时即可配制RT混合液。
进一步地，所述预杂交与杂交的预杂交中，分为三步，a, 在杂交管中加入5mL的灭菌水将芯片膜彻底润湿,在下一步中配制GEAprehyb时杂交管保持倒放.温浴GEAhyb杂交液至60 °C试剂瓶上下颠倒几次使组分完全溶解.加热sheared salmon sperm DNA 至100 °C、5分钟后立刻放至冰中冷却；b: 配制GEAprehyb；C: 弃去杂交管中的水,2 ml的GEAprehyb溶液，轻轻转动几秒，确定管盖已旋紧,放杂交管在杂交仪中，60 °C下转速6 rpm预杂交1.5小时。
进一步地，所述预杂交与杂交的杂交中，分为两步，a:配制GEAhyb混合液:变性的cDNA探针全部加入0.75 ml预热的GEAprehyb中,混匀,放在at 60 °C待用;b:弃去杂交管中的GEAprehyb溶液,加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中,60 °C下6 rpm杂交过夜。
进一步地，所述预杂交与杂交的洗膜中，a: 将杂交管中的GEAhyb混合液倒进一个新管中保存,用洗液1洗膜两次,每次加5ml洗液1,60 °C 30到40 rpm旋转15分钟;b: 用洗液2洗膜两次,每次加5ml洗液2,60 °C 30到40 rpm旋转15分钟。
进一步地，所述预杂交与杂交的膜封闭中，最后一次洗膜后,弃去洗液,立刻加入1.5 ml GEAb封闭液Q,在杂交仪中30到40 rpm孵育40分钟；加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶(AP)中，包括配制1X缓冲液F、 配制结合混合液，弃去杂交管中的GEA封闭液Q,加入2 ml结合缓冲液,在杂交仪中轻轻摇动孵育10分钟。
进一步地，所述预杂交与杂交的洗膜中，先洗膜4次，然后加入3ml缓冲液G温和震荡分钟;倒掉,再用3ml缓冲液G重复洗一次。
进一步地，所述图像采集和分析的图象和数据采集中，X-射线胶片曝光后,将胶片上的图象用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。
进一步地，所述图像采集和分析的分析中，使用芯片配套软件GEArray Analyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。
本发明有益效果是：本发明把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，能实现标准化和批量化大规模生产， 实际应用中，可以同时出12个结果其中包含检测6个样品，2组平行的结果.检测结果只需18个小时.为无公害食品提供了理想检测手段的一种检测食品中冠状病毒.基于上述，所以本发明具有好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明.
图1是本发明流程框图。
具体实施方式
图1中所示，一种检测食品中冠状病毒的基因芯片制备方法，包括RNA提取、RNA标记、预杂交与杂交、图像采集和分析四个步骤；所述RNA提取分为匀浆、两相分离、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀五个分步骤；所述RNA标记分为配制缓冲液BN、配制退火混合液、配制RT混合液三个分步骤；所述预杂交与杂交分为预杂交、杂交、洗膜、膜封闭、加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶、洗膜六个分步骤；所述图像采集和分析分为图象和数据采集:、数据分析两个分步骤。
图1中所示，本发明操作步骤如下。（1）RNA提取：（1）匀浆：直接在3.5cm直径的培养盘中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞,裂解时用枪吸打几次；加入TRIZOL试剂的量取决于培养盘的面积(每10 cm2加1 ml)而不是培养细胞的数量。（2） 两相分离：匀浆后样品于15到30°C孵育5分钟,以便核酸蛋白复合体完全解离，操作中，每1 ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧试管管盖手动剧烈振荡管体15秒后,然后15到30°C孵育2到3分钟，4°C 下、12,000 × g离心15分钟，离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相，RNA全部被分配于水相中，水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。（3）RNA沉淀:将水相转移到新离心管中，将水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇，混匀后15到30°C孵育10分钟后,于4°C 、12,000 × g 离心10分钟，此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。（4）RNA清洗：移去上清液,每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75%乙醇,清洗RNA沉淀，振荡后,4°C、7,500 × g离心5分钟。（5）重新溶解RNA沉淀：去除乙醇溶液,空气中干燥RNA沉淀5-10分钟,操作中，不能真空离心干燥，且注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性，部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6，溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次,然后55到60°C孵育10分钟，获得的RNA溶液保存于-70°C。
图1中所示，RNA标记：采用的材料如下：无RNA酶的H2O、10×RT缓冲液(SuperArrayBioscience, Catalog Number L-04)、RNA酶抑制剂,RNase Inhibitor (Promega, CatNo. N2511)、MMLV逆转录酶,MMLV Reverse Transcriptase (Promega Cat. No. M1701)、缓冲液A(SuperArray Bioscience, Catalog Number L-04)、生物素标记dUTP ,Biotin-16-dUTP (Roche Cat. No.1-093-070)、DTT、dNTP混合液 (dATP,dCTP,dGTP和0.5 mM dTTP各5mM)。RNA标记步骤如下（a）配制缓冲液BN：取50μL的10X RT缓冲液,1μL的1 M DTT和50 μL的dNTP混合液,混匀,保存于–20 °C。（b）配制退火混合液:每个总RNA样品如下配制于一个灭菌PCR管中:包括总RNA 5.0 μg、缓冲液A 3 μl、无RNA酶的H2O， 加至总体积为10 μl；上述溶液用枪轻轻吸打混合均匀,离心至管低；混合液放于70 °C水浴锅中孵育3分钟,立刻放在42 °C水浴中孵育2分钟。（c） 配制RT混合液:当退火混合液70 °C孵育时即可配制RT混合液。RT 混合液：缓冲液BN：4 μl、Biotin-16-dUTP：2 μl、无RNA酶的H2O：2 μl、RNaseInhibitor：1 μl、MMLV Reverse Transcriptase：1 μl、总体积：10 μl、RT混合液42 °C孵育1分钟,然后进行下一步骤。
图1中所示，预杂交与杂交。（1）预杂交:（a） 在杂交管中加入5mL的灭菌水将芯片膜彻底润湿,在下一步中配制GEAprehyb时杂交管保持倒放,温浴GEAhyb杂交液至60 °C试剂瓶上下颠倒几次使组分完全溶解,加热sheared salmon sperm DNA 至100 °C,5分钟后立刻放至冰中冷却。（b） 配制GEAprehyb:在预热的GEAhyb杂交液中加入热变性的salmonsperm DNA至终浓度为100 μg/ml.每张芯片准备3 ml的GEAprehyb，将GEAprehyb溶液放于60 °C待用。(c)弃去杂交管中的水,2 ml的GEAprehyb溶液,轻轻转动几秒,确定管盖已旋紧,放杂交管在杂交仪中60 °C下转速6 rpm预杂交1.5小时。（2）杂交:配制GEAhyb混合液:变性的cDNA探针全部加入0.75 ml预热的GEAprehyb中,混匀,放在at 60 °C待用。弃去杂交管中的GEAprehyb溶液,加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中,60 °C下6 rpm杂交过夜。（3）洗膜:a. 如下配制:洗液1: 2X SSC, 1 % SDS (每升含100 ml 20X SSC和50 ml 20 %SDS)洗液2: 0.1X SSC, 0.5 % SDS (每升含5 ml 20X SSC和25 ml 20% SDS)每杂交管各配制10 ml,60 °C温浴；b. 将杂交管中的GEAhyb混合液倒进一个新管中保存,用洗液1洗膜两次,每次加5ml洗液1,60 °C 30到40 rpm旋转15分钟；c. 用洗液2洗膜两次,每次加5ml洗液2,60 °C 30到40 rpm旋转15分钟。化学发光检测，化学发光检测试剂盒Chemiluminescent Detection Kit (SuperArray Bioscience, Catalog Number D-01)GEA封闭液Q5X 缓冲液FAP缓冲液GCDP-Star 化学发光底物。（4）膜封闭:最后一次洗膜后,弃去洗液,立刻加入1.5 ml GEAb封闭液Q,在杂交仪中30到40 rpm孵育40分钟。（5)加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶(AP):配制1X缓冲液F:用水将5X 缓冲液F稀释5倍.(每杂交管准备18ml的1X缓冲液F)；配制结合混合液:AP:1X 缓冲液F(1:7,500) 混合.(每杂交管配制2ml结合缓冲液).弃去杂交管中的GEA封闭液Q,加入2 ml结合缓冲液,在杂交仪中轻轻摇动孵育10分钟。(6)洗膜:洗膜4次:加入4ml的1×缓冲液F温和振荡5分钟,弃去1×缓冲液F.加入3ml缓冲液G温和震荡分钟;倒掉,再用3ml缓冲液G重复洗一次。
图1中所示，图像采集和分析.加入1.0 ml CDP-Star化学发光底物至杂交管中,室温孵育2分钟。取出膜,放在一张滤纸上以去除多余的CDP-Star溶液,然后用干净的塑料膜两面包住,驱除气泡,用X-射线胶片曝光。图象采集和数据分析（1） 图象和数据采集:X-射线胶片曝光后,将胶片上的图象用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。运行ScanAlyze软件,将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据,将此原始数据储存为Microsoft Excel文件。（2）数据分析使用芯片配套软件GEArray Analyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算.每张芯片都点有负对照(PUC18DNA和空白)已经管家基因,包括β-actin, GAPDH, Cyclophilin A和核糖体蛋白L13a.原始数据将首先被减掉背景最小值,继而用管家基因来进行校正,校正后的数据用来进行样品间基因转录的相对丰度分析。
本发明把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，能实现标准化和批量化大规模生产， 实际应用中，可以同时出12个结果其中包含检测6个样品，2组平行的结果.检测结果只需18个小时.为无公害食品提供了理想检测手段的一种检测食品中冠状病毒。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明.因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。