Crassifolin A在促进线粒体自噬及治疗神经退行性疾病中的应用
阅读说明：本技术 Crassifolin A在促进线粒体自噬及治疗神经退行性疾病中的应用 (Application of Crassifolin A in promoting mitochondrion autophagy and treating neurodegenerative diseases ) 是由 张玉波 肖飞 王国才 潘君平 凌志鹏 李灿杰 尹文静 王子健 于 2021-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种Crassifolin A在促进线粒体自噬及治疗神经退行性疾病中的应用。本发明中通过实验发现,二萜化合物Crassifolin A能明显增强线粒体自噬水平,促进清除受损的线粒体,维持细胞内的稳态,具有潜在的治疗神经退行性疾病以及其他相关疾病的作用,同时Crassifolin A为小分子化合物,容易通过血脑屏障到达脑部发挥作用,且其可以从鸡骨香药材中提取获得,具有药源丰富,容易获得,药物毒副作用低的优势,在治疗神经退行性疾病方面拥有很好的应用前景。(The invention discloses an application of Crassifolin A in promoting mitochondrion autophagy and treating neurodegenerative diseases. Experiments show that the diterpenoid compound Crassifolin A can obviously enhance the autophagy level of mitochondria, promote the removal of damaged mitochondria and maintain the steady state in cells, has the potential effect of treating neurodegenerative diseases and other related diseases, is a small molecular compound, can easily reach the brain through the blood brain barrier to play a role, can be extracted from chicken bone fragrance medicinal materials, has the advantages of rich medicinal sources, easiness in obtaining and low toxic and side effects of medicaments, and has a good application prospect in the aspect of treating neurodegenerative diseases.)
技术领域
本发明属于医药领域，特别涉及一种Crassifolin A在促进线粒体自噬及治疗神经退行性疾病中的应用。
背景技术
神经退行性疾病(ND)是机体神经元结构或功能逐渐丧失而引发的一类疾病，包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿氏病(HD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)等。目前这类疾病致病机制尚不明确且无有效的治愈手段，其主要的机制假说有：胆碱能学说、β-淀粉样蛋白(beta-amyloid,Aβ)毒性学说、氧化应激学说、tau蛋白过度磷酸化学说。在AD中两个比较公认的机制学说：一是Aβ毒性学说，即淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein,APP)经过β分泌酶剪切成Aβ，而过度沉积形成老年斑；二是tau蛋白过度磷酸化学说，即tau蛋白过度磷酸化，失去与微管结合的能力，聚集成神经纤维缠结(NFTs)，导致神经元变性，引起神经元凋亡。目前关于AD作用靶点的研究很多，比如神经胶质细胞、线粒体、细胞代谢、炎症等。而近些年来，细胞自噬与神经退行性疾病和肿瘤之间的研究成为了热点，并为治疗神经退行性疾病提供了新的作用药物靶点。
细胞自噬(autophagy)又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagyrelated gene,Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。目前定义的自噬有三个类型：巨自噬(macro-autophagy)，由双层膜结构的囊泡作为载体，包裹细胞质结构形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体并降解内容物；微自噬(micro-autophagy)，由溶酶体的膜内陷，直接包裹细胞质元件并在其中降解；分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)，细胞内目标蛋白会被分子伴侣蛋白识别并构成复合体，之后被溶酶体膜上受体——溶酶体相关膜蛋白2A(lysosomal-associated membrane protein 2A,LAMP-2A)识别，转运到溶酶体腔内被降解。
细胞自噬的研究是目前生物医学领域热点之一，广泛参与很多疾病发生和发展。诱导或抑制自噬，在疾病治疗上可能有重要的作用。线粒体疾病的研究也与自噬联系在一起，神经退行性疾病如AD的病因以往被认为是损伤的线粒体累积和蛋白质堆积，最终导致神经元退化。因此诱导细胞自噬的发生，清除损伤的线粒体，对于改善AD的症状有很大的帮助，同时也成为治疗AD潜在的药物作用靶点。目前自噬诱导剂主要有：Bredeldin A/Thapsigargin、Carbamazepine/L-690,330/LithiumChloride(氯化锂)、Earle's平衡盐溶液、N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide)、Rapamycin、Xestospongin B/C。现有的自噬诱导剂只是对应自噬信号通路里的某个特定的过程，但对于复杂的自噬信号通路而言显然是远远不够的，故寻找新的自噬诱导剂在神经退行性疾病治疗方面具有潜在的应用前景。
Crassifolin A(JGX-1)是一种二萜类化合物，从大戟科巴豆属植物鸡骨香Crotoncrassifolius Geisel.中分离得到；其中JGX-1化学结构式如下:
目前对于该化合物在自噬诱导剂及神经退行性疾病中的作用尚未有任何相关的报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供Crassifolin A在体外促进细胞线粒体自噬中的应用。
本发明的另一目的在于提供Crassifolin A在制备线粒体自噬诱导剂中的应用。
本发明的再一目的在于提供Crassifolin A在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
Crassifolin A(JGX-1)在体外促进细胞线粒体自噬中的应用。
所述的Crassifolin A(JGX-1)的化学结构式如式(I)所示：
所述的Crassifolin A的有效浓度为5～15μmol/L；优选为10μmol/L。
Crassifolin A在制备线粒体自噬诱导剂中的应用。
所述的Crassifolin A的有效浓度为5～15μmol/L；优选为10μmol/L。
Crassifolin A在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
所述的Crassifolin A能够促进线粒体自噬(增强线粒体自噬水平)，抑制磷酸化Tau的表达，进而实现治疗神经退行性疾病的目的。
所述的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、亨廷顿氏病(Huntington’disease,HD)、肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、不同类型脊髓小脑共济失调(spinalserebellar ataxias)、Pick’病(Pick’s disease)、脑缺血(cerebral ischemia,CI)、脑损伤(brain injury,BI)和癫痫(epilepsy)中的至少一种。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发现了一种二萜化合物Crassifolin A(JGX-1)能明显增强线粒体自噬水平，促进清除受损的线粒体，维持细胞内的稳态，具有潜在的治疗神经退行性疾病以及其他相关疾病的作用，在治疗神经退行性疾病方面拥有很好的应用前景。
(2)本发明中的二萜化合物Crassifolin A(JGX-1)是小分子化合物，容易通过血脑屏障到达脑部发挥作用，该化合物能显著提高线粒体自噬水平。
(3)本发明的二萜化合物Crassifolin A(JGX-1)在提高线粒体自噬的同时，不会导致线粒体的凋亡，可以作用在自噬功能障碍引起的疾病中药物开发，为神经退行性疾病提供潜在的治疗药物。
(4)本发明中的二萜化合物Crassifolin A(JGX-1)可以从鸡骨香药材中提取获得，具有药源丰富，容易获得，药物毒副作用低的优势。
附图说明
图1是Crassifolin A(JGX-1)进行线粒体自噬药物筛选的流式结果图；其中，A为DMSO组；B为阳性对照组(FCCP)(浓度为10μM)；C为JGX-1处理组(浓度为10μM)；D为统计直方图。
图2是Crassifolin A(JGX-1)处理Hela-mt-Keima细胞后，激光共聚焦显微镜下观察到的线粒体自噬情况图；其中，A为阳性对照组(FCCP)(浓度为10μM)；B为JGX-1处理组(浓度为10μM)。
图3为分析Crassifolin A(JGX-1)处理后对SH-SY5Y-Tau-GFP细胞中tau蛋白影响的Westerning Blot结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例中涉及的Crassifolin A(JGX-1)是一种二萜类化合物，其化学结构式如式(I)所示，可以参考文献(李甲桂.鸡骨香的化学成分研究[D].暨南大学,2013.)获得，或可以从大戟科巴豆属植物鸡骨香Croton crassifolius Geisel.中分离得到。
本发明实施例中涉及的Hela细胞和hSY5Y细胞通过ATCC购买获得。
实施例1
(1)Hela-mt-Keima细胞通过流式线粒体自噬药物筛选
来源于珊瑚虫的Keima荧光蛋白具有pH值依赖性的双峰激发光谱，即在440nm和586nm的激发波长分别能够激发中性和酸性pH下的Keima分别发出绿色和红色荧光。鉴于发生自噬的线粒体终会进入酸性的溶酶体中，所以线粒体定位的Keima(mitocondrialKeima,mt-Keima)可指示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体。本实验的具体操作流程如下：
将Hela-mt-Keima细胞按5x104的密度接种于24孔板中，加入1mL含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养24h，24h后分别加入0.1％(v/v)DMSO(二甲基亚砜)，以DMSO(10μM)为溶剂对照组(DMSO)，阳性药对照组为10μM的线粒体解偶联剂(FCCP)(sigma)，实验组为10μM JGX-1+10μM FCCP，每组3个重复，第三天收集细胞1000×g离心3min收集细胞，0.5ml PBS缓冲液重悬，40μm过筛上机，流式收取5x104细胞，记录收集时间，405nm/Qdot605-A，561nm/PE-Texas Red-A，计算MI＝561/405+561。
结果如图1所示：通过流式细胞筛选线粒体自噬，发现JGX-1可以提高线粒体自噬。
(2)Hela-mt-Keima细胞通过共聚焦检测线粒体自噬情况
来源于珊瑚虫的Keima荧光蛋白具有pH值依赖性的双峰激发光谱，即在440nm和586nm的激发波长分别能够激发中性和酸性pH下的Keima分别发出绿色和红色荧光。鉴于发生自噬的线粒体终会进入酸性的溶酶体中，所以线粒体定位的Keima(mitocondrialKeima,mt-Keima)可指示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体。本实验的具体操作流程如下：
将Hela-mt-Keima细胞按1x104的密度接种于12个激光共聚焦细胞培养皿中，加入1mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，5小时后换液是分为溶剂对照组(DMSO)、阳性药对照组(10μM FCCP)、实验组1(10μM JGX-1+10μMFCCP)以及实验组2(10μM JGX-1)，每组3个重复，37℃，5％(v/v)CO2细胞培养箱培养，8小时后于激光共聚焦显微镜下，观察458nm通道(指示中性pH下的Keima)和561nm通道(指示酸性pH下的Keima)激发荧光信号的变化，随机选取3个视野拍照，统计作图。
结果如图2所示：通过共聚焦活细胞成像，发现JGX-1可以提高线粒体自噬。
(3)Westerning Blot
a、用JGX-1(10μmol/L)处理hSY5Y细胞24h后进行细胞收集，BCA方法测定hSY5Y细胞样品蛋白浓度，样品上样量(20μg/10μl)一致；
b、配制分离胶与浓缩胶；
c、电泳：每个加样孔加入10μl样品，80V电压电泳30min，当样品进入分离胶后，电压调至120V电泳60min，直到溴酚蓝进入分离胶底端；
d、转膜：采用湿转的方法，先用甲醇提前3min活化PVDF膜，然后从负极到正极依次为海绵、滤纸、凝胶、PVDF、滤纸、海绵的顺序放置，在预冷的转膜缓冲液已恒流300mA低温电转90min；整个过程都在冰水中；
e、转膜完成后，将膜置于用TBST缓冲液配置的5％(w/v)脱脂奶粉的培养皿中，在室温下封闭90min，之后用TBST缓冲液洗3次，每次5min；
f、一抗孵育：以一抗稀释液稀释一抗LC3B和pTAU(202)(CST公司)，4℃孵育过夜，然后用适量TBST缓冲液在摇床上洗3次，每次10min；
g、二抗孵育：以TBST缓冲液稀释HRP二抗(CST公司)，室温下孵育1h，然后用适量TBST缓冲液在摇床上洗3次，每次10min；
h、化学发光及先用：将新鲜的BeyoECLplus工作液(超敏ECL化学发光试剂盒)滴在膜上，确保工作液覆盖膜上，用ALLIANCE4.7仪器采集荧光信号。
结果如图3所示：通过WB验证JGX-1在hSY5Y细胞提高自噬LC3B表达，抑制磷酸化Tau的表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。