具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例一

本实施例涉及一种体外环境中细胞的捕获方法。

本实施例的细胞捕获方法是在体外环境中对从受试者身体上所获取的体液、或混合有体液的混合液体内的细胞进行捕获采集，以可由所采集的细胞进行相应的后续培养、检测等操作。

整体设计上，本实施例的体外环境中细胞捕获方法基于细胞承载介质的不同，而包括如下的s1和s2两个部分，其中，s1部分涉及直接对体液中的一大类、也即血液中的细胞进行捕集，而s2部分则涉及对体液中除血液外的其它种类，以及混合有体液的混合液体中的细胞进行捕集。需要说明的是，一般的对于血液之外的其它体液，其例如可包括有尿液、腹水以及胸腔积液，而所述的混合有体液的混合液体则多指受试者手术中所得到的手术冲洗液，其例如可为腹腔冲洗液或膀胱镜检测灌洗液等。

基于此，详细而言本实施例的细胞捕获方法主要包括：

对于s1，也即体液为血液时，所述的细胞捕获方法包括对血液进行抗凝处理，将具有细胞采集区的采样器的采集区浸泡于血液中进行细胞捕集，或者，血液进行红细胞裂解去除红细胞，再去除白细胞，并将具有细胞采集区的采样器的采集区浸泡于血液中进行细胞捕集。

对于s2，也即体液不为血液，或者进行细胞捕集的是混合有体液的混合液体，此时所述的细胞捕获方法则包括如下的步骤：

步骤s21.离心所述体液并获得沉淀物；

步骤s22.向步骤s21最终获得的沉淀物中加入完全培养液，混合均匀得到沉淀悬浮液；

步骤s23.将具有细胞采集区的采样器的采集区浸泡于步骤s22的悬浮液中，并整体放置于摇床上于恒温环境下进行吸附，以由所述采集区捕集细胞。

其中，具体点的上述的步骤s21进一步的又可包括有如下的步骤：

步骤s211.取一部分体液或混合液体室温离心；

步骤s212.离心后去除上清液，留下沉淀物；

步骤s213.再取一部分体液与步骤s212中的沉淀物混合，室温离心；

步骤s214.重复步骤s212和步骤s213，直至所有体液离心完成；

步骤s215.在步骤s214中最后一次离心后，去除上清液，留下最终获得的沉淀物。

其中，需要注意的是，作为对本发明所涉及的体液含义的更为广泛的说明，本实施例细胞捕获方法中所述的体液，一般指从患有某种症状的受试者(包含未进行治疗或已处于治疗中的受试者)、或是疑似患有某种症状的受试者体内获取的流体样本，且特别的，受试者的症状或疑似症状优选的为可通过对其体液内的细胞进行分析以获得所需的判断信息。上述受试者一般为哺乳动物，其例如包括狗、猫、牛、养、啮齿类或灵长类动物，而啮齿类动物例如可是鼠，灵长类例如可是人。

而作为一种较为普遍的实施情形，本实施例中以上的受试者是人类，并且此时也需要指出的是，由受试者体内所获取的体液一般包括血液、淋巴液、唾液、黏液、痰、脓、尿液、粪便、肠胃分泌物，以及耳蜗液、滑膜液、脑脊液、泪液、玻璃体液和精液、阴道分泌物、乳腺分泌物等。本实施例中后续将具体以从人体尿液中进行细胞捕获为例对该捕获方法进行具体说明。

本实施例作为优选的实施方式，上述s2部分中，各离心步骤与吸附步骤均可在低吸附离心管中进行。而为保证采样器上采集区对细胞的采集效果，在进行步骤s23之前，一般也优选的可再对步骤s22的悬浮液进行吹打混均处理。

另外，作为优选的实施方式，还需说明的是上述步骤s211和步骤s213中的离心操作可采用水平离心机进行，步骤s22中则可于立体摇床上进行吸附，其可保证吸附液与采集区充分接触，相较于采用水平摇床可避免吸附数量低的情况。而且在步骤s23中每吸附设定阈值时间，可选择将采样器翻转一次，以使采集区整个外周壁面上均可较好的接触悬浮液，从而有利于提高细胞捕获的成功率。上述设定阈值时间根据实际采用情况进行选取便可，且一般的基于本实施例的捕获方法其在30min左右。

在由采样器捕获完成后，一般为保证细胞能够稳定的被吸附在采集区表面，故应选择对采样区上所捕获的细胞进行固定处理。为此，本实施例中在吸附完成后，即选择将采样器的采集区置于预冷的固定溶液中进行细胞固定。该固定溶液采用现有常规的可进行细胞固定的低温溶液便可，根据检测情形由操着者选择。

下面将具体以由人体获取的尿液作为体液而捕获膀胱上皮细胞为例，对本实施例的细胞捕获采集过程进行进一步的说明。

此时，获取尿液的人体、也即受试者为肿瘤患者。并且在进行捕获时，低吸附管采用2.0ml的低吸附EP管和50ml的低吸附EP管两种，两种低吸附EP管的具体信息分别为：Protein LoBind Tube 2.0ml,Eppendorf Tubes,Order no.：0030108132；Protein LoBindTube 50ml,Eppendorf Tubes,Order no.：0030122240。

此外，水平离心机采用生物检测、试验普遍采用的离心机便可，立体摇床可采用上海器仁仪器仪表有限公司的型号为QR-24的摇床，恒温吸附时的恒温环境则可通过恒温孵箱获得，且恒温孵箱可采用上海一恒科学仪器有限公司的型号为BPH-9162的孵箱。

在该具体采集示例中，进行细胞捕获的采样器可采用本申请人的采样针产品，并随采样针配备有采集时使用的硅胶塞。除了以上器件，在具体采集过程中还会使用到移液枪与配套枪头，以及留置针等，其均采用对应的常规器件即可。另外，针对于由尿液中进行细胞的捕获，所采用的完全培养液具体为L-15完全培养液，其包含成分为L-15细胞培养基+10％FBS胎牛血清。

在进行具体捕获时，需要指出获取的尿液样本一般应在2小时内进行离心处理、并进行细胞的吸附。具体过程如下：

一、吸附液准备

第一步，将获取的尿液先倒一部分至1个50ml低吸附离心管中，室温离心，离心力500g，离心时间5min；

第二步，倒掉上清，剩余约1-2ml，小心不要碰到沉淀；

第三步，再将剩余尿液样品加入至第二步的离心管中，室温离心，离心力500g，离心时间5min；

第四步，重复以上第二步和第三步，直至所有尿液样品离心完成，以此使所有尿液中的细胞汇集于同一离心管中，使得细胞损失量最小。

第五步，最后一次离心完成后，倒掉上清，并小心不要碰到沉淀。

第六步，沿管壁加入配好的L-15完全培养液1.0ml，轻轻吹打混匀，然后将沉淀悬浮液转入准备好的2.0ml EP管中；

第七步，再吸取0.5ml L-15完全培养液加入到第五步中的50ml离心管内，洗涤离心管，然后转入到第六步中的2.0ml EP管中，并适当补加L-15完全培养基，使终体积在2.0ml，然后吹打混匀。

二、恒温吸附

第一步，将准备好的吸附液再次吹打混匀；

第二步，将采样针通过留置针穿过硅胶塞，硅胶塞套在装有吸附液的低吸附管上，使采样针上的采集区浸泡在吸附液中。然后整体放置在3D摇床上进行吸附，37℃条件下吸附30min，且吸附过程中每5min翻转一次采样针，完成膀胱上皮细胞的吸附。

吸附结束后，将采样针的采集有细胞的采集区部分放入4℃预冷的甲醇中固定5min。经固定后的采样针即可放入病理分析前处理试剂盒的保存液中按要求进行运输或保存。

实施例二

本实施例涉及对实施例一所捕获的膀胱上皮细胞进行检测。

本实施例的对所捕获的膀胱上皮细胞的检测，其具体为通过对捕获的细胞进行免疫荧光染色以进行细胞蛋白的检测。而且具体来说，该通过免疫荧光染色进行细胞蛋白的检测方法具体包括有如下的步骤：

a.将捕获有细胞的采样器的捕集区放入封闭液进行封闭；

b.封闭结束后，将采样器的采集区放入清洗液中浸泡；

c.将清洗后的采样器的采集区放入一抗抗体染色液中进行染色，染色后将采样器的采集区进行清洗；

d.将清洗后的采样器的采集区放入二抗抗体染色液中进行染色，染色后将采样器的采集区进行清洗；

e.将清洗后的采样器的采集区放入核染液中进行孵育染色，染色后将采样器的采集区进行清洗；

f.将清洗后的采样器固定在夹持装置上，并采用带相机的荧光显微镜对采样器的采集区进行拍照镜检，由膀胱上皮细胞识别判据对捕获结果进行判读。

其中，以对捕获的表达EpCAM的膀胱上皮细胞、或膀胱癌标志物CK20进行染色及判读为例，其中，检测时需要准备的试剂和相关仪器设备如下：

试剂：

质控品：

三色质控品：染色后带有蓝绿信号和蓝红信号的两种细胞；

CK20/P53质控品：染色后带有蓝绿紫信号的细胞。

器材：

镊子、计时器、移液枪及枪头(200μL)、离心管架。

镜检设备：

带黑白相机的正置荧光显微镜(例如Axio Imager,Carl Zeiss AG)；

荧光显微镜滤光片设置：例如蔡司滤光片49(蓝色)；52(绿色)；64(紫色)；50(红色)；

采样器夹持装置(可采用本申请人已授权专利CN205133584U中的旋转检测台)。

结合于上述的步骤a至步骤f，具体检测过程如下：

将采样器的采样区一端放入封闭液中，开始封闭，计时20-120min，例如30min，记录封闭起止时间。在封闭时间结束之前打开清洗液，颠倒混匀，封闭结束后将采样器的采样区放入浸泡1-15min，例如1min，取出前手指搓转采样器3-5次。

在严格避开日光和灯光的条件下，进行下述染色过程：

1.在采样器的采样区封闭时间内取出一抗抗体染色液，用200μL移液枪轻轻吹打混匀；

2.将采样器的采样区放入一抗抗体染色液，计时20min-24h，例如60min，记录染色起止时间；

3.在一抗抗体染色结束之前打开3管新的清洗液，颠倒混匀，一抗染色结束后将采样器的采样区依次放入其中；

4.在一抗抗体染色液染色时间结束之前，打开二抗抗体染色液，用200μL移液枪轻轻吹打混匀；

5.将采样器的采样区放入二抗抗体染色液，计时20-120min，例如60min，记录染色起止时间；

6.在二抗抗体染色结束之前打开3管新的清洗液，颠倒混匀，二抗抗染色结束后将采样器的采样区依次放入其中；

7.取出核染液，用200μL移液枪轻轻吹打混匀，将采样器的采样区放入其中计时孵育1-15min，例如5min，记录起止时间；

8.在核染结束前打开一管新的清洗液，核染结束后将采样器的采样区放入其中浸泡。

染色后进行结果的判读，且判读流程具体为打开显微镜程序，校准或跳过校准，并将染色后的采样器固定在夹持装置上，再通过显微镜粗准焦螺旋调节，使采样器的采样区移动到离物镜约5mm处，打开显微镜荧光，切到绿色通道，移动显微镜手柄使绿色荧光打到采样器的采样区的中央区域，产生强烈反光，放下挡板保护眼睛，切换到蓝色荧光通道通过目镜在镜下找到采样器的采样区的轮廓，移到视野中央，切换绿色通道，当发现疑似细胞形态的目标时，切换通道观察绿色、蓝色信号重合情况。如果重合拉出拉杆点击预览，调整曝光时间(见判读标准)，保证在不过曝的状态下拍摄照片。

观察拍摄照片的红色通道，如果红色信号不存在，或者红色信号较弱且着色均匀无明显边界，则该发现是一个CTC，如果红色信号存在且具有细胞形态，则该发现是一个血细胞相关的目标物。缓慢移动采样器，检查每个视野(仅读取位于中心的细胞)，避免重复计数，直至镜检完毕，此时可将采样器的采样区放回保存管中，-20℃保存。

其中，(1)判读标准的一种示例如下：

拍摄时的推荐曝光时间(III档光源)：

染色结果:

(2)识别上皮细胞的判据例如可是：

应该有细胞的形态；

细胞可以是多态的(大个细胞、不规则的细胞形状、几个细胞聚集或重叠等)；

核染结果为阳性；

CD45为阴性；

CK和/或EpCAM为阳；

细胞直径≥4μm；

核的着色情况能够显著区分于CK/EpCAM的着色情况。

识别CK20阳性上皮细胞的判据：满足上述上皮细胞判据的同时，还应满足P53和/或CK20为阳性。

(3)无法判读的情况为：

有显著的细胞形态，核非常大(CTCs通常核比较大)，然而，

CK/EpCAM，CD45完全没有信号，或者，

全部阳性(CK/EpCAM和CD45均阳性)；

目标物尺寸像细胞，位于血块上或大的染料块上。

本实施例的细胞检测方法配合于实施例一中的体外细胞采集，能够对采集的细胞进行所需的相关检测，而能够提供一种更为有效的细胞诊断途径。

实施例三

本实施例涉及对孕妇外周血中的胎儿细胞进行捕获及检测。

本实施例的细胞捕获方法基于实施例一中的s1部分，其具体是对一定量孕妇外周血进行胎儿细胞的捕获采集，且在捕获时，首先将采集的外周血进行抗凝处理，然后将具有细胞采集区的采样器的采集区浸泡于血液中进行细胞捕集。或者，也可对血液进行红细胞裂解去除红细胞，再去除白细胞，再将具有细胞采集区的采样器的采集区浸泡于血液中进行细胞捕集。上述捕集时间在10-60min之间。

捕集完成后，对采集区上捕获的细胞进行固定处理，也即将采集区置于预冷的固定液中进行细胞固定。采集区上固定的细胞可以通过免疫荧光染色的方法进行蛋白水平的检测，以及提取捕获细胞的DNA并进行全基因组扩增，而进行包括但不限于数字PCR、荧光定量PCR和二代测序的基因检测。

具体来说，以上通过免疫荧光染色进行细胞蛋白的检测方法具体包括有如下的步骤：

a.将捕获有细胞的采样器的捕集区放入封闭液进行封闭；

b.封闭结束后，将采样器的采集区放入清洗液中浸泡；

c.将清洗后的采样器的采集区放入一抗抗体染色液中进行染色，染色后将采样器的采集区进行清洗；

d.将清洗后的采样器的采集区放入二抗抗体染色液中进行染色，染色后将采样器的采集区进行清洗；

e.将清洗后的采样器的采集区放入核染液中进行孵育染色，染色后将采样器的采集区进行清洗；

f.将清洗后的采样器固定在夹持装置上，并采用带相机的荧光显微镜对采样器的采集区进行拍照镜检，由胎儿细胞识别判据对捕获结果进行判读。

其中，以对捕获的分别表达CD71、GPA、CD36、HbF、TER119、HLA-G、CD14等蛋白的胎儿细胞(胎儿有核红细胞和滋养层细胞)进行染色及判读为例，其中，检测时需要准备的试剂和相关仪器设备如下：

试剂：

质控品：

三色质控品：染色后带有蓝绿信号和蓝红信号的两种细胞；

CK20/P53质控品：染色后带有蓝绿紫信号的细胞。

器材：

镊子、计时器、移液枪及枪头(200μL)、离心管架。

镜检设备：

带黑白相机的正置荧光显微镜(例如Axio Imager,Carl Zeiss AG)；

荧光显微镜滤光片设置：例如蔡司滤光片49(蓝色)；52(绿色)；64(紫色)；50(红色)；

采样器夹持装置(可采用本申请人已授权专利CN205133584U中的旋转检测台)。

结合于上述的步骤a至步骤f，具体检测过程如下：

将采样器的采样区一端放入封闭液中，开始封闭，计时20-120min，例如30min，记录封闭起止时间。在封闭时间结束之前打开清洗液，颠倒混匀，封闭结束后将采样器的采样区放入浸泡1-15min，例如1min，取出前手指搓转采样器3-5次。

在严格避开日光和灯光的条件下，进行下述染色过程：

1.在采样器的采样区封闭时间内取出一抗抗体染色液，用200μL移液枪轻轻吹打混匀；

2.将采样器的采样区放入一抗抗体染色液，计时20min-24h，例如60min，记录染色起止时间；

3.在一抗抗体染色结束之前打开3管新的清洗液，颠倒混匀，一抗染色结束后将采样器的采样区依次放入其中；

4.在一抗抗体染色液染色时间结束之前，打开二抗抗体染色液，用200μL移液枪轻轻吹打混匀；

5.将采样器的采样区放入二抗抗体染色液，计时20-120min，例如60min，记录染色起止时间；

6.在二抗抗体染色结束之前打开3管新的清洗液，颠倒混匀，二抗抗染色结束后将采样器的采样区依次放入其中；

7.取出核染液，用200μL移液枪轻轻吹打混匀，将采样器的采样区放入其中计时孵育1-15min，例如5min，记录起止时间；

8.在核染结束前打开一管新的清洗液，核染结束后将采样器的采样区放入其中浸泡。

染色后进行结果的判读，使用荧光显微镜进行观察、拍照。观察拍摄照片的红色通道，如果红色信号不存在，或者红色信号较弱且着色均匀无明显边界，再观察绿色通道和紫色通道，判断是否为目标细胞。如果红色信号存在，则排除其为目标细胞。缓慢移动采样器，检查每个视野(仅读取位于中心的细胞)，避免重复计数，直至镜检完毕。此时可将采样器的采样区放回保存管中，-20℃下保存。

其中，(1)判读标准的一种示例如下：

拍摄时的推荐曝光时间(III档光源)：

染色结果:

(2)识别胎儿细胞的判据例如可是：

应该有细胞的形态；

细胞可以是多态的(大个细胞、不规则的细胞形状、几个细胞聚集或重叠等)；

核染结果为阳性；

CD45为阴性；

CD14/CD71/CD36为阳性；

GPA阳性(为有核红细胞)或者HLA-G阳性(为滋养层细胞)

细胞直径≥4μm；

核的着色情况能够显著区分于CD14/CD71/CD36的着色情况。

与实施例二相同的，本实施例的细胞检测方法配合于实施例一中的体外细胞采集，也能够对采集的细胞进行所需的相关检测，而可提供一种更为有效的细胞诊断途径。

实施例四

本实施例涉及对所捕获的细胞的检测，所述细胞例如可是前述所捕获的膀胱上皮细胞或胎儿细胞，且本实施例的检测具体为提取捕获细胞的DNA并进行全基因组扩增，而进行包括但不限于数字PCR、荧光定量PCR和基因二代测序的基因检测。

本实施例的细胞检测所涉及的基因检测则一般包括如下的步骤：

步骤a.将采集器捕获有细胞的采集区剪成若干段置于PCR管中；

步骤b.向PCR管中加入细胞裂解液进行细胞裂解，裂解后进行酶灭活；

步骤c.加入预扩增反应混合液进行基因扩增；

步骤d.对PCR扩增的基因产物进行纯化回收；

步骤e.对回收的基因产物进行数字PCR、荧光定量PCR或基因二代测序检测。

其中，具体来说对于本实施例的细胞基因检测，此时以采集的是循环上皮细胞为例，PCR扩增例如可采用江苏亿康基因科技有限公司的单细胞全基因组扩增试剂盒，并且对扩增产物进行回收则可采用北京天根生化科技有限公司的PCR产物回收试剂盒，而对于其它诸如细胞裂解、数字PCR、荧光定量PCR或者基因二代测序等则可参见现有技术中应用的相关技术手段，本实施例不再对其进行赘述。

同样的，本实施例的细胞检测方法配合于实施例一中的体外细胞采集，亦能够对采集的细胞进行所需的相关检测，从而也能够提供一种更为有效的细胞诊断途径。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。