具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明。

实施例1

采用BLI技术计算式(II)和胰蛋白酶之间的结合和解离常数，计算亲和力(K_D)，判断两者之间的相互作用强度，包括以下方案：

ForteBio Octet Red 96分析检测：(1)SA传感器(ForteBio)预湿：将新的SA传感器放入PBS中预湿5-10min；(2)仪器平衡：将SA传感器在配体缓冲液中进行平衡；(3)固化：将目的蛋白(胰蛋白酶)固化到SA传感器上；(4)平衡：固化过目的蛋白的传感器在分析缓冲液中进行平衡；(5)结合：将带有目的蛋白的传感器分别浸入不同浓度的式(II)的溶液中，进行结合；(6)解离：将结合到靶蛋白上的分析物解离下来；(7)数据分析：实时收集的数据利用ForteBio Data Analysis软件进行数据分析，计算式(II)与胰蛋白酶的亲和力(K_D)。

基于BLI技术计算式(II)与胰蛋白酶之间的亲和力，不同浓度的式(II)与胰蛋白酶相互作用的结果见图1，详细的结合、解离动力学数据见表1。结果显示：式(II)与胰蛋白酶的结合常数(Kon)为5.89×10³ 1/Ms，解离常数(Koff)为1.26×10^-1 1/s，亲和力(K_D)为2.15×10^-5M。

表1式(II)与胰蛋白酶的亲和常数

实施例2

式(II)和胰蛋白酶的分子对接：基于殷赋科技云计算平台分子对接服务模块(http://www.yinfotek.com/dock)，采用柔性对接机制，允许式(II)和胰蛋白酶构象自由变化，精确计算对接结果，探讨式(II)与胰蛋白酶的结合位点和结合模式，包括以下方案：

研究对象：牛胰蛋白酶分辨率最高的晶体结构4i8h。

分子对接模拟：系统分析胰蛋白酶潜在的结合口袋，图2和图3中的S1和S2分别表示系统在4i8h晶体中探测到的2个潜在结合位点。式(II)在S1和S2位点的结合能量分别为-43.352474和-49.774826kcal/mol，对接构象评分值分别为-48.811569和-50.864765。打分值的绝对值越大代表式(II)与该位点的结合能力越强。S1位点打分值低于对应的S2位点打分值，推测式(II)倾向于结合在S2位点，属于中等程度的结合。该结合离胰蛋白酶的活性中心较近，推测可能对胰蛋白酶的活性产生别构影响。

式(II)在S2的最佳结合构象如图4所示。式(II)的C-3位羟基可与胰蛋白酶氨基酸残基ASN74和ILE73形成氢键。除此之外，式(II)还可与胰蛋白酶氨基酸残基TYR151、HIS40及TYR39形成范德华力及疏水作用力。

实施例3

式(II)体外对胰蛋白酶酶解能力的影响，包括以下步骤。

选择脑源性肌酸激酶(CK-BB)作为底物，采用凝胶电泳技术测定蛋白酶的酶解能力：(1)用裂解缓冲液准备15μg/ml的CK-BB溶液，加入式(II)母液或者配制母液的溶媒DMSO，使得式(II)的浓度为12.5μM或者50μM，溶媒的浓度为0.6％；(2)吸取上述溶液40μl至PCR管中，加入4μl的胰蛋白酶溶液(Trypsin:CK-MM＝1:25)，在PCR仪器(Biosafter)中孵育25min(25℃)，对于不消化的样品，加入4μl的TNC缓冲液(50mM Tris–HCl,50mM NaCl,10mMCaCl₂,pH 8.0)；(3)孵育结束后，立刻加入20X蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)，并继续在冰上孵育10min；(4)上述样品随后加入适量的样品缓冲液，90℃变性10min，然后SDS-PAGE凝胶电泳分离；(5)凝胶银染后，采用Tanon 4100凝胶电泳图像分析系统对蛋白条带进行灰度分析。

结果显示：不加胰蛋白酶的情况下，溶媒DMSO组和式(II)组蛋白底物的灰度值没有明显的差异，说明各组蛋白底物的加样保持均一；加了胰蛋白酶的情况下，蛋白底物可观察到被明显酶解，条带灰度值的相对丰度降低一半以上，说明胰蛋白酶的酶解功能正常发挥；与DMSO组相比，式(II)组底物蛋白条带的相对丰度明显下降，说明其可提高胰蛋白酶的酶解能力(图5A)。12.5μM和50μM的式(II)可分别提高酶解能力达15.6％(图5B)和29.8％(图5C)。

实施例4

式(II)体外对胰蛋白酶活性的影响，包括以下步骤。

实验材料：式(II)(上海源叶生物科技有限公司)，胰蛋白酶测试盒(南京建成生物工程研究所)，牛胰蛋白酶(江苏凯基生物技术股份有限公司)。

胰蛋白酶酶活标准曲线的绘制：(1)用试剂盒中的试剂二将稀释好的5个不同浓度的胰蛋白酶(200mg/ml、100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml以及12.5mg/ml)作为待测样本，按照试剂盒说明书提供的步骤加样、混匀及孵育，见表2；(2)空白管反应液调零；(3)253nm处1cm石英比色皿，读取混匀后测定管30s的吸光度值A1，20min后再次读取吸光度值A2，求两次吸光度差值(△A＝A2-A1)。记录下各个数值，描绘胰蛋白酶的标准曲线。

表2肌酸激酶酶活标准曲线的绘制

式(II)体外对胰蛋白酶酶活的影响：(1)取100mg/ml的胰蛋白酶作为待测样本，式(II)5个不同浓度作为药液(对照药液为50％的DMSO水溶液)按照表3加样、混匀及孵育；(2)空白管反应液调零；(3)253nm处1cm石英比色皿，读取混匀后测定管和对照管30s的吸光度值A1，20min后再次读取吸光度值A2，求两次吸光度差值(△A＝A2-A1)；(4)根据胰蛋白酶标准曲线，计算胰蛋白酶的浓度。

表3化合物对肌酸激酶酶活的影响

胰蛋白酶浓度标准曲线：胰蛋白酶在12.5mg/ml～200mg/ml区间呈现较好的线性，线性回归方程为：Y＝0.002X-0.0193(R²＝0.9979，n＝3)，其中X是酶浓度(mg/ml)，Y代表吸光度OD₂₅₃值。

如表4所示，式(II)可剂量依赖性地增加胰蛋白酶的浓度，即增加了胰蛋白酶的活性；与溶剂对照组(0.3％DMSO)相比，25μM(P<0.05)、50μM(P<0.05)及100μM(P<0.05)的式(II)可显著增加胰蛋白酶的活性，增加的幅度分别达到7.17％、13.91％和9.03％；不过，式(II)的浓度超过50μM后，激活胰蛋白酶的能力开始下降，两者之间呈倒“U”的关系。

表4式(II)对胰蛋白酶活性的影响(均值±标准差，n＝5)

注：单因素方差分析，*P<0.05vs.0.3％DMSO，**P<0.01vs.0.3％DMSO。

实施例5

式(II)体内对胰腺外功能分泌不足的影响，包括以下步骤。

实验动物：Wistar大鼠50只，雄性，180-200g，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2013-0006，饲养于标准动物房。

实验材料和仪器：式(II)(南京欣厚生物科技有限公司)，胰酶胶囊(SolvayPharma)，二氯二丁基锡(DBTC)(Sigma)，胰蛋白酶和胰脂肪酶测试盒(Solarbio)，粪弹力蛋白酶(FE-1)ELISA试剂盒(武汉华美生物科技有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。多功能酶标仪(Spectramax M5,Molecular Devices，美国)。

实验分组、造模和给药：所有大鼠在18-24℃的实验室喂养7天，自由饮食，适应1周。随机分为6组，每组10只。即：对照组、模型组、胰酶组(150mg/kg)、式(II)低剂量组(25mg/kg)、式(II)中剂量组(50mg/kg)和式(II)高剂量组(100mg/kg)。模型组及给药组大鼠尾静脉缓慢注射DBTC溶液(7mg/kg，DBTC溶于含20％乙醇、40％甘油和40％二甲基亚砜的溶液中)，对照组尾静脉注射相同体积的溶媒。造模2周后，灌胃给予式(II)和阳性药胰酶，每天1次，共4周；对照组灌胃给予1％羧甲基纤维素钠水溶液。

实验取材和指标分析：实验的最后3天，称量各组大鼠的体重及摄食量，肉眼观察大鼠的毛发色泽及粪便情况，并收集粪便。采用如下评分标准对大鼠粪便进行评分：粪便成形、质硬、表面干燥(计1分)；粪便成形、质软、表面含有较多水分(计2分)；便溏、质软、容易粘附(计3分)。采集的新鲜粪便称重后，按照ELISA试剂盒说明书测定粪便中FE-1的含量。最后，麻醉大鼠处死，开腹切取十二指肠，用2ml的提取液冲洗肠管，收集并合并提取液，10000rpm，4℃离心10min，取上清液按照试剂盒说明书测定十二指肠内胰蛋白酶和胰脂肪酶的活性。

结果显示(表5)：与对照组相比，模型组动物毛发无光泽、发黄、稀疏，体重(P<0.01)和摄食量(P<0.01)明显降低，并且出现了明显的腹泻症状(P<0.01)。与模型组相比，阳性药胰酶组动物的体重(P<0.01)和摄食量(P<0.01)明显升高，腹泻程度明显减轻(P<0.01)，趋向接近对照组动物的状态。式(II)中剂量(P<0.05)和高剂量组(P<0.01)可明显逆转模型动物体重和摄食量的降低，并能明显改善其稀便的状况。式(II)低剂量组和模型组相比，各项指标均没有统计学差异。

表5式(II)对胰腺外分泌不足模型大鼠体重、摄食量和腹泻的影响(均值±标准差，n＝10)

注：单因素方差分析，^#P<0.05，^##P<0.01vs.对照组；*P<0.05，**P<0.01vs.模型组。

胰腺外分泌不足(表6)：模型动物采用了DBTC注射法，其可以导致胆管上皮细胞破坏，引起胰胆管堵塞，慢性炎症可导致胰腺纤维化，致使胰腺外分泌不足，动物出现消化不良。胰蛋白酶、脂肪酶和FE-1是常用来反应胰腺外分泌功能的三个生化指标，与对照组相比，模型组动物十二指肠内胰蛋白酶(P<0.01)和脂肪酶(P<0.01)的活性明显下降，粪便中FE-1(P<0.01)的含量明显降低。与模型组相比，阳性药组动物十二指肠内胰蛋白酶(P<0.01)和脂肪酶(P<0.01)的活性明显升高，粪便中FE-1(P<0.01)的含量明显增加。高剂量的式(II)可明显逆转模型动物十二指肠内胰蛋白酶(P<0.01)和脂肪酶(P<0.05)活性的下降，提高模型动物粪便中FE-1(P<0.05)的含量；此外，中剂量的式(II)对模型动物十二指肠内胰蛋白酶(P<0.05)的活性也有明显的改善作用；式(II)低剂量组和模型组相比，各项指标均没有统计学差异。

表6式(II)对模型大鼠十二指肠内胰蛋白酶、脂肪酶和FE-1的影响(均值±标准差，n＝10)

注：单因素方差分析，^#P<0.05，^##P<0.01vs.对照组；*P<0.05，**P<0.01vs.模型组。

脂肪酶活性定义：37℃下每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位；胰蛋白酶活性定义：37℃下每分钟催化253nm处吸光值增加0.001为一个酶活单位。