一种金盏银盘活性成分的外用制剂及应用
阅读说明：本技术 一种金盏银盘活性成分的外用制剂及应用 (External preparation of active ingredients of calendula officinalis and application ) 是由 孟庆廷 宗剑飞 厉保秋 于 2021-02-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及中药及天然药物领域,具体涉及一种以鬼针聚炔苷为首的金盏银盘活性成分的外用制剂及其应用。其中金盏银盘活性成分选自鬼针聚炔苷或进一步加入金丝桃苷、大黄素、槲皮素中至少一种。作为外用制剂使用,鬼针聚炔苷或其与金丝桃苷、大黄素、槲皮素任一种、任两种或三种组合使用均具有一定的镇痛作用。本发明的外用制剂对热刺激疼痛、机械刺激疼痛、酸性物质刺激腹膜所致腹痛、炎症性疼痛、缺血性内脏痛等具有良好的镇痛效果。所述镇痛药物为减轻热刺激疼痛、机械刺激疼痛、酸性物质刺激腹膜所致腹痛、炎症性疼痛、缺血性内脏痛,且外用给药更为安全,可避免胃肠道给药的胃肠道刺激作用和静脉注射给药的潜在不良作用。(The invention relates to the field of traditional Chinese medicines and natural medicines, in particular to an external preparation containing active ingredients of a calendula silver disc and taking bidens parviflora as a first component and application thereof. Wherein the active component of herba Sidae Rhombifoliae is selected from bidens Podophyllum alkyne glycoside or further comprises at least one of hyperoside, emodin, and quercetin. The composition can be used as external preparation, and the podophyllum polyyne glycoside or its combination with one, two or three of hyperoside, emodin and quercetin has certain analgesic effect. The external preparation of the present invention has a good analgesic effect on thermal stimulation pain, mechanical stimulation pain, abdominal pain due to stimulation of the peritoneum by an acidic substance, inflammatory pain, ischemic visceral pain, and the like. The analgesic drug can relieve thermal stimulation pain, mechanical stimulation pain, abdominal pain caused by stimulation of acid substances to peritoneum, inflammatory pain and ischemic visceral pain, is safer in external administration, and can avoid gastrointestinal tract stimulation effect of gastrointestinal tract administration and potential adverse effect of intravenous injection administration.)
技术领域
本发明属于中药及天然药物领域，具体涉及一种金盏银盘活性成分的外用制剂及应用。
背景技术
金盏银盘系菊科鬼针草属植物三叶鬼针草Bidens pilosa Linn.或金盘银盏Bidens biternata (Lour.) Merr. Et Sherff的全草，又名铁筅帚、千条针、金盘银盏、鬼针草、婆婆针。《中药大辞典》、《中华本草》记载金盏银盘具有疏表清热、解毒、散瘀作用，用于治疗治流感、乙脑、咽喉肿痛、肠炎、痢疾、黄疸、肠痈、小儿惊风、疳积、疮筋疥痔等。后续的现代研究发现鬼针草属植物主要含金丝桃苷、异奥卡宁-7-O-葡萄糖甙、奥卡宁、大黄素、海生菊甙、槲皮素、聚乙炔及聚炔苷等化合物（李 勇，蒋海强，张清华.金盏银盘化学成分的分离与鉴定. 食品与药品.2012年第14卷第07期：270页；李斌, 刘昕, 熊杰,赖学文, 王少军, 刘波, 陈杰, 张忠立. 金盏银盘化学成分的分离与鉴定. 江西中医药.2011 年10 月第10 期总42 卷第346 期：51页），具有抑菌、保护心血管、抗炎镇痛、抗干眼、抗衰老等多种药理活性，常用于感冒、阑尾炎、痢疾、胃痛、高胰岛素血症等疾病的防治。
在金盏银盘的活性成分中，金丝桃苷、大黄素、槲皮素等具有广泛的药理活性，例如金丝桃苷具有抗炎、镇痛、抗氧化、保护心肌和肝脏、抗肿瘤等作用（王丽敏, 王跃新, 朱秋双, 杨玉, 白雪, 刘明远. 金丝桃苷对荷瘤小鼠肿瘤抑制作用研究. 黑龙江医药科学.2010年 第2期: 62-63页）；大黄素具有抗炎、抑菌、保肝、抗癌、保护肾脏、泻下、保护胰腺、利尿、利胆、降低内毒素等作用（张斯时. 大黄素的药理作用研究概况.中国医药导报.2006年 第23期: 12-14页）；槲皮素具有抗肿瘤、抗氧化、抗感染、免疫抑制、心血管保护、抗炎和血糖调节等多种药理作用（骆明旭, 罗丹, 赵万红. 槲皮素药理作用研究进展. 中国民族民间医药杂志.2014年第17期:12-14页）。其中的奥卡宁具有抗血小板聚集作用（王敬伟,张永威, 李新霞, 李琳琳, 王烨, 骆新, 王丽凤, 毛新民. 奥卡宁的提取分离及抗血小板聚集作用研究. 新疆医科大学学报. 2018年 第12期: 1535-1538页.）。
金盏银盘中的聚炔苷化合物被成为鬼针聚炔苷(bipinnatpolyacetylenicloside，BPC)，化学名为2-β-D-吡喃葡萄糖基-1，13-二羟基-3(反)，11(反)-十三碳二烯-5，7，9-三炔，属于聚炔类化合物（刘建军, 陈飞虎, 许慧, 王晓宇, 林梅英, 汤文建, 张群林. 鬼针聚炔苷对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用.）。该活性成分最早由山东中医药大学王建平等发现并确证结构。1992年发表在《中国化学快报》。2011年江西中医学院李斌等报道了金盏银盘中提取分离得到了鬼针聚炔苷（李斌, 刘昕, 熊杰, 赖学文, 王少军, 刘波, 陈杰, 张忠立. 金盏银盘化学成分的分离. 江西中医药.2011年 第10期: 51-53页）。1997、2012年王建平、刘建军等分别研究报道了鬼针聚炔苷对对白血病细胞的体外抑制作用和对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用（王建平,张玲. 鬼针草提取成分对白血病细胞的体外抑制作用. 《中药材》1997年 第5期 247-249页；刘建军, 陈飞虎, 许慧, 王晓宇, 林梅英, 汤文建, 张群林. 鬼针聚炔苷对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用.）。从金盏银盘中提取分离鬼针聚炔苷的制备工艺通常采用乙醇提取（李斌, 刘昕, 熊杰, 赖学文, 王少军, 刘波, 陈杰, 张忠立. 金盏银盘化学成分的分离. 江西中医药.2011年 第10期: 51-53页；CN201110294966.7）。
迄今为止，业内对金盏银盘活性成分的研究已有大量报道，但对不同活性成分的不同药理作用研究尚不全面，对金盏银盘外用制剂及其精制成分制剂的研究报道较少，且对其镇痛作用的研究也较少。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的包括：
首先是提供一种金盏银盘活性成分的制剂，具体来说是金盏银盘活性成分的外用制剂，以减少非必需成分引起的副作用。
这一金盏银盘活性成分的外用制剂，活性成分为鬼针聚炔苷或鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任一种或任两种或三种的组合，即活性成分包括：鬼针聚炔苷；鬼针聚炔苷、金丝桃苷组合；鬼针聚炔苷、大黄素组合；鬼针聚炔苷、槲皮素组合；鬼针聚炔苷、金丝桃苷、大黄素组合；鬼针聚炔苷、金丝桃苷、槲皮素组合；鬼针聚炔苷、大黄素、槲皮素组合；鬼针聚炔苷、金丝桃苷、大黄素、槲皮素组合。
其中，当外用制剂活性成分为鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任一种组合时，外用制剂中鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任一种的重量份比为1:（4～12），优选为1: 8。
其中，当外用制剂活性成分为鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任两种组合时，外用制剂中金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任两种的重量份比为1:（1～4），优选为1:1。当外用制剂中金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任两种的重量份比为1:1时，优选的鬼针聚炔苷与该制剂中金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任一种的重量份比优选为1: 6。
其中，当外用制剂活性成分为鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分组合时，外用制剂中金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分的重量份比优选为1:2:1。鬼针聚炔苷与该制剂中金丝桃苷的重量份比优选为1: 4。
上述外用制剂中活性成分均具有镇痛作用。因此，上述外用制剂中活性成分的重量份比仅为优选的配比，使用时可以在确保不同活性成分达到镇痛剂量的前提下按照任意配比组合使用。
上述金盏银盘活性成分的外用制剂可以选自软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、外用乳液、外用混悬液等，其中上述金盏银盘活性成分的外用制剂除活性成分外，还含有外用制剂的必要辅料，包括至少一种透皮吸收促进剂，如氮酮类透皮吸收促进剂，如月桂氮卓酮；如醇类透皮吸收促进剂，如丙二醇、甘油、聚乙二醇等，如二甲基亚砜及其同系物类透皮吸收促进剂。当外用制剂为凝胶制剂时，上述必要辅料还包括凝胶基质，如卡波姆、羧甲基纤维素钠、卵磷脂中的一种或两种。当凝胶基质为卵磷脂时，技术人员应知，应当先采用有机溶剂溶解制备，后加入水，使其成为低粘度液体。当外用制剂为软膏剂或乳膏剂时上述必要辅料还包括单硬脂酸甘油酯、白凡士林、硬脂酸、吐温80、十二烷基硫酸钠、羟苯乙酯中的至少一种。
本发明的目的之二是提供一种金盏银盘活性成分的新应用，具体来说是，金盏银盘活性成分在制备外用镇痛药物中的应用。其中所述镇痛药物包括对热刺激疼痛、酸性物质刺激腹膜所致疼痛、炎症性疼痛、机械刺激疼痛及缺血性内脏痛。其中金盏银盘活性成分至少选自鬼针聚炔苷，还可以进一步含有金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任一种或任两种或三种。
其中，当活性成分为鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任一种组合时，外用制剂中鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任一种的重量份比为1:（4～12），优选为1: 8。
其中，当活性成分为鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任两种组合时，外用制剂中金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任两种的重量份比为1:（1～4），优选为1:1。当外用制剂中金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任两种的重量份比为1:1时，优选的鬼针聚炔苷与该制剂中金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分中任一种的重量份比为1: 6。
其中，当活性成分为鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分组合时，外用制剂中金丝桃苷、大黄素、槲皮素三种成分的重量份比为1:2:1。鬼针聚炔苷与该制剂中金丝桃苷重量份比为1:4。
上述外用制剂中活性成分均具有镇痛作用，活性成分的重量份比与不同活性成分发挥活性的剂量水平范围有关。因此，上述外用制剂中活性成分的重量份比仅为优选的配比,，使用时可以在确保不同活性成分达到镇痛剂量的前提下按照任意配比组合使用。
发明人经过研究发现，金盏银盘活性成分之一的鬼针聚炔苷在外用给药时对多种疼痛模型包括炎症性疼痛、热刺激疼痛、机械刺激疼痛、癌症疼痛等均具有一定的镇痛作用。由于金丝桃苷、大黄素、槲皮素也具有镇痛作用，发明人进一步研究显示，鬼针聚炔苷与金丝桃苷、大黄素、槲皮素组合使用具有更好的镇痛作用。本发明又提供了一种金盏银盘活性成分的外用制剂，与口服或注射给药相比具有给药方便，安全性高的优点；本发明另一方面提供了金盏银盘活性成分鬼针聚炔苷的新活性，从而为疼痛的治疗提供了新的药物。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。以下具体实施例仅用于解释和说明本发明的技术方案，而不是限制本发明的保护范围。
实施例1 鬼针聚炔苷外用制剂的制备
配方：
鬼针聚炔苷10g；
单硬脂酸甘油酯14 g；
白凡士林20 g；
硬脂酸20 g；
液状石蜡20 g；
甘油28 g；
十二烷基硫酸钠2 g；
羟苯乙酯0.2g；
蒸馏水96 g。
按照配方比例称量取原辅料，将配方量的单硬脂酸甘油酯、白凡士林、硬脂酸和液状石蜡混合后加热熔化作为油相，加入配方量鬼针聚炔苷，搅拌均匀85 ℃保温。另取配方量甘油与十二烷基硫酸钠、羟苯乙酯、蒸馏水混合加热溶解作为水相，85 ℃保温。搅拌下将水相缓慢加入油相中，搅拌混匀至冷却作为鬼针聚炔苷软膏剂。
实施例2 鬼针聚炔苷、金丝桃苷外用制剂的制备
配方：
鬼针聚炔苷2g；
金丝桃苷 16 g
单硬脂酸甘油酯14 g；
白凡士林20 g；
硬脂酸20 g；
液状石蜡20 g；
甘油28 g；
十二烷基硫酸钠2 g；
羟苯乙酯0.2g；
蒸馏水96 g。
按照配方比例称量取原辅料，将配方量的单硬脂酸甘油酯、白凡士林、硬脂酸和液状石蜡混合后加热熔化作为油相，加入配方量鬼针聚炔苷、金丝桃苷，搅拌均匀85 ℃保温。另取配方量甘油与十二烷基硫酸钠、羟苯乙酯、蒸馏水混合加热溶解作为水相，85 ℃保温。搅拌下将水相缓慢加入油相中，搅拌混匀至冷却作为鬼针聚炔苷/金丝桃苷复方软膏剂。
实施例3鬼针聚炔苷、大黄素外用制剂的制备
配方：
鬼针聚炔苷2g；
大黄素 16 g
单硬脂酸甘油酯14 g；
白凡士林20 g；
硬脂酸20 g；
液状石蜡20 g；
甘油28 g；
十二烷基硫酸钠2 g；
羟苯乙酯0.2g；
蒸馏水96 g。
按照配方比例称量取原辅料，将配方量的单硬脂酸甘油酯、白凡士林、硬脂酸和液状石蜡混合后加热熔化作为油相，加入配方量鬼针聚炔苷、大黄素，搅拌均匀85 ℃保温。另取配方量甘油与十二烷基硫酸钠、羟苯乙酯、蒸馏水混合加热溶解作为水相，85 ℃保温。搅拌下将水相缓慢加入油相中，搅拌混匀至冷却作为鬼针聚炔苷/大黄素复方软膏剂。
实施例4鬼针聚炔苷、槲皮素外用制剂的制备
配方：
鬼针聚炔苷1g；
槲皮素 9 g
单硬脂酸甘油酯14 g；
白凡士林20 g；
硬脂酸20 g；
液体石蜡20 g；
甘油28 g；
十二烷基硫酸钠2 g；
羟苯乙酯0.2g；
蒸馏水96 g。
按照配方比例称量取原辅料，将配方量的单硬脂酸甘油酯、白凡士林、硬脂酸和液体石蜡混合后加热熔化作为油相，加入配方量鬼针聚炔苷、槲皮素，搅拌均匀85 ℃保温。另取配方量甘油与十二烷基硫酸钠、羟苯乙酯、蒸馏水混合加热溶解作为水相，85 ℃保温。搅拌下将水相缓慢加入油相中，搅拌混匀至冷却作为鬼针聚炔苷/槲皮素复方软膏剂。
实施例5鬼针聚炔苷、金丝桃苷、槲皮素外用制剂的制备
鬼针聚炔苷 2g；
金丝桃苷 12g；
槲皮素 12g；
单硬脂酸甘油酯10g；
白凡士林20g；
硬脂酸20g；
液状石蜡10g；
三乙醇胺8g；
月桂氮卓酮6g；
尼泊金乙酯0.2；
蒸馏水99.8 g。
按照配方比例称量取原辅料，将配方量的单硬脂酸甘油酯、白凡士林、硬脂酸和液体石蜡混合后加热熔化作为油相，加入配方量鬼针聚炔苷、金丝桃苷、槲皮素，搅拌均匀80℃保温；将配方量的三乙醇胺、月桂氮卓酮、尼泊金乙酯混合搅拌均匀80 ℃保温，作为水相；将水相趁热边搅拌边加入至油相，加入蒸馏水；继续搅拌至完全乳化，冷却作为鬼针聚炔苷/金丝桃苷/槲皮素复方乳膏。
实施例6鬼针聚炔苷、金丝桃苷、大黄素外用制剂的制备
鬼针聚炔苷 2g；
金丝桃苷 12g；
大黄素 12g；
单硬脂酸甘油酯10g；
白凡士林20g；
硬脂酸20g；
液状石蜡10g；
三乙醇胺8g；
月桂氮卓酮6g；
尼泊金乙酯0.2；
蒸馏水99.8 g。
按照配方比例称量取原辅料，将配方量的单硬脂酸甘油酯、白凡士林、硬脂酸和液体石蜡混合后加热熔化作为油相，加入配方量鬼针聚炔苷、金丝桃苷、大黄素，搅拌均匀80℃保温；将配方量的三乙醇胺、月桂氮卓酮、尼泊金乙酯混合搅拌均匀80 ℃保温，作为水相；将水相趁热边搅拌边加入至油相，加入蒸馏水；继续搅拌至完全乳化，冷却作为鬼针聚炔苷/金丝桃苷/大黄素复方乳膏。
实施例7鬼针聚炔苷、大黄素、槲皮素外用制剂的制备
鬼针聚炔苷 2g；
大黄素12g；
槲皮素 12g；
单硬脂酸甘油酯10g；
白凡士林20g；
硬脂酸20g；
液状石蜡10g；
三乙醇胺8g；
月桂氮卓酮6g；
尼泊金乙酯0.2；
蒸馏水99.8 g。
按照配方比例称量取原辅料，将配方量的单硬脂酸甘油酯、白凡士林、硬脂酸和液体石蜡混合后加热熔化作为油相，加入配方量鬼针聚炔苷、大黄素、槲皮素，搅拌均匀80 ℃保温；将配方量的三乙醇胺、月桂氮卓酮、尼泊金乙酯混合搅拌均匀80 ℃保温，作为水相；将水相趁热边搅拌边加入至油相，加入蒸馏水；继续搅拌至完全乳化，冷却作为鬼针聚炔苷/大黄素/槲皮素复方乳膏。
实施例7鬼针聚炔苷、金丝桃苷、大黄素、槲皮素外用制剂的制备
鬼针聚炔苷2g；
金丝桃苷8g；
大黄素16g；
槲皮素8g；
卡波姆940 10g，
甘油50g，
吐温80 2g；
乙醇70g；
羟苯乙酯0.5g；
蒸馏水1000g。
按照配方比例称量取原辅料，取配方量的卡波姆940、甘油、吐温80与250ml蒸馏水混合搅拌均匀，放置过夜，使其充分溶胀；取处方量羟苯乙酯、乙醇、金丝桃苷、大黄素、槲皮素混合搅拌均匀，加入凝胶基质中，加余量蒸馏水搅匀，作为鬼针聚炔苷/金丝桃苷/大黄素/槲皮素复方凝胶剂。
实施例8鬼针聚炔苷外用对小鼠热板疼痛模型的镇痛作用研究
1实验目的
以小鼠热板疼痛模型研究鬼针聚炔苷外用对单纯热刺激所致疼痛（不伴随其他炎症刺激）的镇痛作用
2 方法
2.1实验动物：健康雌性昆明小鼠，体重18~22 g。
2.2 动物模型及分组给药
水浴锅调整温度保持55±0.5℃，热板置水浴锅上待温度达到55±0.5℃时使用。将小鼠置热板上测定小鼠接触热板至舔足或跳足所需的反应潜伏期。按照标准选择反应潜伏期高于5s低于30s的小鼠24只，并记录该反应潜伏期作为基础反应潜伏期。
将造模合格的小鼠随机分为4组，即模型组、鬼针聚炔苷低(0.25mg/d)、中(0.5mg/d)、高剂量组(1.0 mg/d)，6只/组，背部备皮。模型组备皮部位涂抹二甲基亚砜（DMSO），鬼针聚炔苷组均涂抹鬼针聚炔苷DMSO混液。各组每日1次，连续给药7日。
2.3 指标及考察
各组于末次给药2h按照2.2项下方法再次测定反应潜伏期，并记录该反应潜伏期作为给药后反应潜伏期。热反应阈值增长值(s)=药后反应潜伏期-基础反应潜伏期。
2.4 统计分析
组间比较采用ANOVA分析，p<0.05视为差异显著。
3 结果
各组小鼠基础反应潜伏期、药后反应潜伏期及热反应阈值增长值统计结果见表1。经多组间ANOVA比较，各组小鼠基础反应潜伏期差异不显著(p>0.05)。鬼针聚炔苷各剂量组药后反应潜伏期、热反应阈值增长值均显著高于DMSO组（p<0.01）。其中鬼针聚炔苷组药后反应潜伏期、热反应阈值增长值呈剂量依赖性升高。鬼针聚炔苷高、中剂量组药后反应潜伏期均显著高于低剂量组（p<0.01）。鬼针聚炔苷高、中剂量组热反应阈值增长值均显著高于低剂量组（p<0.05或p<0.01）。
表1 鬼针聚炔苷外用实验各组小鼠热反应阈值（s）
实施例9鬼针聚炔苷外用对小鼠醋酸扭体模型的镇痛作用研究
1实验目的
以小鼠醋酸扭体模型研究鬼针聚炔苷外用对常用腹痛模型即酸性化学物质刺激腹膜所致疼痛的镇痛作用。探索醋酸扭体50%以上抑制率的鬼针聚炔苷剂量。
2 方法
2.1实验动物：健康昆明小鼠，雌雄不拘，体重18~22 g。
2.2 动物模型及分组给药
24只小鼠随机分为4组， 6只/组，雌雄各半，即模型组、鬼针聚炔苷低(0.25mg/d)、中(0.5mg/d)、高剂量组(1.0 mg/d)，背部备皮。模型组备皮部位涂抹二甲基亚砜（DMSO），鬼针聚炔苷组均涂抹鬼针聚炔苷DMSO混液。各组每日1次，连续给药7日。末次给药后2h，各组小鼠腹腔注射0. 7%冰醋酸，0.2ml/只。
2.3 指标及考察
考察各组小鼠腹腔注射冰醋酸后15min内的扭体次数，扭体抑制率(%)=（DMSO组扭体次数-给药组扭体次数）/ DMSO组扭体次数x100%。
2.4 统计分析
组间比较采用ANOVA分析，p<0.05视为差异显著。
3 结果
各组小鼠扭体次数及扭体抑制率结果见表2。经多组间ANOVA比较，鬼针聚炔苷各剂量组扭体次数均显著低于DMSO组（p<0.01），其中中剂量组扭体次数低于低剂量组，扭体抑制率高于低剂量组，两组差异不显著(p=0.091，p=0.065)；高剂量组扭体次数显著低于低剂量组（p<0.01）；高剂量组高剂量组扭体抑制率达到50%以上，显著高于中（p<0.05）和低剂量组（p<0.01）。
表2 鬼针聚炔苷外用实验各组小鼠扭体次数及扭体抑制率
实施例10 鬼针聚炔苷外用对小鼠福尔马林炎性疼痛模型的镇痛作用研究
1实验目的
以小鼠足底注射福尔马林诱发炎症，研究鬼针聚炔苷外用对足底炎症小鼠疼痛行为的镇痛作用。
2 方法
2.1实验动物：健康昆明小鼠，雄性，体重18~22 g。
2.2 动物模型及分组给药
24只小鼠随机分为4组， 6只/组，即模型组、鬼针聚炔苷低(0.25mg/d)、中(0.5mg/d)、高剂量组(1.0 mg/d)，背部备皮。模型组备皮部位涂抹二甲基亚砜（DMSO），鬼针聚炔苷组均涂抹鬼针聚炔苷DMSO混液。各组每日1次，连续给药7日。末次给药后2h，各组小鼠右后爪足底皮下注射福尔马林(浓度5%，注射体积10μL)。
2.3 指标及考察
考察各组小鼠福尔马林注射后第0-10min（第一相）和第10-45min（第二相）两个时相内舔或咬右后爪的时间即舔足时间。
2.4 统计分析
组间比较采用ANOVA分析，p<0.05视为差异显著。
3 结果
各组小鼠第一相和第二相时间段内舔或咬右后爪的时间结果见表3。经多组间ANOVA比较，鬼针聚炔苷中、高剂量组第一相舔足时间显著低于DMSO组(p<0.05)；鬼针聚炔苷三组间第一相舔足时间差异不显著（p>0.05）。鬼针聚炔苷中、高剂量组第二相舔足时间显著低于DMSO组(p<0.01)，其中鬼针聚炔苷高剂量组第二相舔足时间显著低于中、低剂量组（p<0.01）。
表3 鬼针聚炔苷外用实验各组小鼠第一相和第二相舔足时间(s)
实施例11鬼针聚炔苷外用对小鼠机械刺激疼痛模型的镇痛作用研究
1实验目的
以小鼠尾根压痛模型研究鬼针聚炔苷外用对小鼠单纯机械刺激疼痛（不伴随炎症刺激）的镇痛作用。
2 方法
2.1实验动物：健康昆明小鼠，雄性，体重18~22 g。
2.2 动物模型及分组给药
取小鼠固定身体及尾部，与距尾根1cm处行压力刺激，小鼠因尾根压痛嘶叫时对应压力为机械刺激疼痛阈值。筛选机械刺激疼痛阈值低于300g的小鼠24只，随机分为4组，6只/组，即模型组、鬼针聚炔苷低(0.25mg/d)、中(0.5mg/d)、高剂量组(1.0 mg/d)，背部备皮。模型组备皮部位涂抹二甲基亚砜（DMSO），鬼针聚炔苷组均涂抹鬼针聚炔苷DMSO混液。各组每日1次，连续给药7日。末次给药后2h，再次固定身体及尾部测定机械刺激疼痛阈值。
2.3 指标及考察
比较各组给药后机械刺激疼痛阈值(M1)及给药前(M0)、后（M1）的机械刺激疼痛阈值差值（DM）
2.4 统计分析
组间比较采用ANOVA分析，p<0.05视为差异显著。
3 结果
各组小鼠给药前机械刺激疼痛阈值M0、给药后机械刺激疼痛阈值M1、给药前后机械刺激疼痛阈值差值DM测定结果及统计结果见表4。各组小鼠M0组间差异不显著(p>0.05)。鬼针聚炔苷高剂量组M1显著高于DMSO组和鬼针聚炔苷低剂量组（p<0.01）。鬼针聚炔苷中、高剂量组DM显著高于DMSO组（p<0.01）。
表4 鬼针聚炔苷外用实验各组小鼠机械刺激疼痛阈值 (g)
实施例12 鬼针聚炔苷外用对大鼠缺血性内脏痛模型的镇痛作用研究
1实验目的
以大鼠肠系膜血管结扎诱导缺血性内脏痛，研究鬼针聚炔苷外用对缺血性内脏痛的镇痛作用。
2 方法
2.1实验动物：健康SD小鼠，雄性，体重180~200 g。
2.2 动物模型及分组给药
大鼠24只，随机分为4组，6只/组，即模型组、鬼针聚炔苷低(0.25mg/d)、中(0.5mg/d)、高剂量组(1.0 mg/d)，背部备皮。模型组备皮部位涂抹二甲基亚砜（DMSO），鬼针聚炔苷组均涂抹鬼针聚炔苷DMSO混液。各组每日1次，连续给药7日。大鼠末次给药后6h，麻醉后手术暴露肠系膜，每只大鼠结扎3根肠系膜血管，关闭腹腔，预防性注射抗生素避免术后感染。
2.3 指标及考察
观察各组大鼠术后1h内舔舐腹部或外阴、腹部收缩或伸展身体及全身或肋部收缩的次数，作为缺血性内脏痛评分。
2.4 统计分析
组间比较采用ANOVA分析，p<0.05视为差异显著。
3 结果
各组大鼠缺血性内脏痛评分结果见表5。鬼针聚炔苷中、高剂量组内脏痛评分显著低于DMSO组（p<0.01），其中高剂量组内脏痛评分显著低于低剂量组（p<0.01）。
表5 鬼针聚炔苷外用实验各组大鼠结扎后1h内内脏痛评分
实施例13 鬼针聚炔苷复方对小鼠醋酸扭体模型的镇痛作用研究
1实验目的
以小鼠醋酸扭体模型研究鬼针聚炔苷复方外用对常用腹痛模型即酸性化学物质刺激腹膜所致疼痛的镇痛作用。
2 方法
2.1实验动物：健康昆明小鼠，雌雄不拘，体重18~22 g。
2.2 动物模型及分组给药
30只小鼠随机分为5组， 6只/组，雌雄各半，即模型组、鬼针聚炔苷组、鬼针聚炔苷/金丝桃苷复方组、鬼针聚炔苷/大黄素复方组、鬼针聚炔苷/槲皮素复方组。各组小鼠背部备皮。模型组备皮部位涂抹二甲基亚砜（DMSO），鬼针聚炔苷组涂抹鬼针聚炔苷DMSO混液（按鬼针聚炔苷计剂量为0.25mg/d）、鬼针聚炔苷/金丝桃苷复方组涂抹DMSO混液（按鬼针聚炔苷计剂量为0.25mg/d、按金丝桃苷计剂量为2.00 mg/d）、鬼针聚炔苷/大黄素复方组涂抹DMSO混液（按鬼针聚炔苷计剂量为0.25mg/d、按大黄素计剂量为2.00 mg/d）、鬼针聚炔苷/槲皮素复方组涂抹DMSO混液（按鬼针聚炔苷计剂量为0.25mg/d、按槲皮素计剂量为2.00mg/d）。各组每日1次，连续给药7日。末次给药后2h，各组小鼠腹腔注射0. 7%冰醋酸，0.2ml/只。
2.3 指标及考察
考察各组小鼠腹腔注射冰醋酸后15min内的扭体次数，扭体抑制率(%)=（DMSO组扭体次数-给药组扭体次数）/ DMSO组扭体次数x100%。
2.4 统计分析
组间比较采用ANOVA分析，p<0.05视为差异显著。
3 结果
各组小鼠扭体次数及扭体抑制率统计结果见表6。组间比较表明，给药组扭体次数均显著低于DMSO组（p<0.01），其中鬼针聚炔苷/金丝桃苷复方组、鬼针聚炔苷/槲皮素复方组扭体次数显著低于鬼针聚炔苷组（p<0.01）。鬼针聚炔苷/金丝桃苷复方组、鬼针聚炔苷/槲皮素复方组扭体抑制率高于50%。
表6 鬼针聚炔苷复方外用实验各组小鼠扭体次数及扭体抑制率
实施例14 鬼针聚炔苷复方对小鼠热板疼痛模型的镇痛作用研究
1实验目的
以小鼠热板疼痛模型研究鬼针聚炔苷复方外用对单纯热刺激所致疼痛（不伴随其他炎症刺激）的镇痛作用
2 方法
2.1实验动物：健康雌性昆明小鼠，体重18~22 g。
2.2 动物模型及分组给药
水浴锅调整温度保持55±0.5℃，热板置水浴锅上待温度达到55±0.5℃时使用。将小鼠置热板上测定小鼠接触热板至舔足或跳足所需的反应潜伏期。按照标准选择反应潜伏期高于5s低于30s的小鼠12只，并记录该反应潜伏期作为基础反应潜伏期。
将造模合格的小鼠随机分为2组，6只/组，即模型组、鬼针聚炔苷复方组（鬼针聚炔苷0.25mg/d、金丝桃苷1 mg/d、大黄素2 mg/d、槲皮素1 mg/d），背部备皮。模型组备皮部位涂抹二甲基亚砜（DMSO），鬼针聚炔苷复方组均涂抹鬼针聚炔苷复方活性成分的DMSO混液。各组每日1次，连续给药7日。
2.3 指标及考察
各组于末次给药2h按照2.2项下方法再次测定反应潜伏期，并记录该反应潜伏期作为给药后反应潜伏期。热反应阈值增长值(s)=药后反应潜伏期-基础反应潜伏期。
2.4 统计分析
组间比较采用t检验，p<0.05视为差异显著。
3 结果
各组小鼠基础反应潜伏期、药后反应潜伏期及热反应阈值增长值统计结果见表7。两组基础反应潜伏期差异不显著（p>0.05），鬼针聚炔苷复方组药后反应潜伏期及热反应阈值增长值均显著高于DMSO组（p<0.01）。
表7 鬼针聚炔苷外用实验各组小鼠热反应阈值（s）
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