具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.临床样本核酸提取

采用QIAGEN公司的QIAamp MinElute Virus Spin Kit试剂盒进行样本总核酸的提取，参照说明书对实验方案进行一定调整，具体操作步骤如下：

起始量500μL的咽拭子/痰液/肺泡灌洗液等临床样本，平衡至室温，使用前充分混匀。

加入浓度为50mg/mL的溶菌酶10μL，充分混匀，37℃孵育15min。溶菌酶来源为Sigma-Aldrich公司的溶菌酶干粉，货号L6876-1G，将溶菌酶干粉溶解于10mM Tris-HCl,pH8.0，使终浓度为50mg/ml。

加入62.5μL QIAGEN蛋白酶与500μL Buffer AL，振荡混匀15s，保证最终的液体是均一的；56℃孵育15min，短暂离心。

加入625μL无水乙醇，振荡混匀15s，室温静置5min，短暂离心。

将上述样本转移至吸附柱中，8000rpm离心1min，弃废液。

更换收集管，加入500μL Buffer AW1，8000rpm离心1min。

更换收集管，加入500μL Buffer AW2，8000rpm离心1min。

更换收集管，加入500μL无水乙醇，8000rpm离心1min。

更换收集管，14000rpm空转3min。

将吸附柱放入一个新的1.5mL EP管中，开盖，室温干燥5min。

向吸附柱中加入40μL Buffer AVE到吸附柱膜的中央，室温静置5min，14000rpm离心1min。

用移液器将洗脱液吸出，再次加入到吸附柱膜的中央，室温静置5min，14000rpm离心1min，所得液体即为样本总核酸，立即进行下一步实验或于-20℃保存。

2.cDNA合成与磁珠纯化

2.1反转录一链合成(NEBNext Ultra II RNA First Strand Synthesis Module)

12.5μL提取的总核酸+1.5μL随机引物(NEBNext Ultra II RNA First StrandSynthesis Module试剂中自带引物)，吹打混匀，短暂离心，65℃反应5min，热盖105℃，反应完立即置于冰上。

配置第一链合成反应体系：

在冰上用移液器混匀后，将样本放入PCR仪开始反应。

反应条件：

2.2第二链合成(NEBNext Ultra II Non-Directional RNA Second StrandSynthesis Module)

配置第二链合成反应体系：

在冰上用移液器混匀后，16℃反应1h，不热盖(盖子温度<40℃)。

2.3磁珠纯化

加入144μL(1.8×)Agencourt AMPure XP磁珠于80μL反应产物中，移液器吹吸混匀，室温孵育5min。

短暂离心，将离心管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，小心吸取丢弃上清。

保持离心管于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，静置30s，小心吸取丢弃上清。

再次加入200μL新鲜配制的80％乙醇，静置30s后小心吸取丢弃上清，使用小量程移液器尽量吸干管底液体，室温干燥约5min，直至磁珠表面无反光、无开裂。

将离心管从磁力架上取下，加入20μL无核酸水洗脱DNA，用移液器轻轻吹吸混匀，室温孵育5min。

短暂离心，将离心管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，将18μL上清液吸出即为DNA。

使用Qubit 3.0对纯化后核酸的dsDNA浓度进行定量。

3.BGI测序平台DNA文库构建与测序

采用MGIEasy酶切DNA文库制备试剂套装进行样本DNA文库构建(实验流程参照试剂说明书)，采用PE100测序策略在BGISEQ-500测序仪上进行测序，每个样本预估分配100Mreads数据量。

4.测序结果分析

使用Centrifuge软件对BGISEQ-500测序数据进行宏基因组比对分析，设置比对命中的最短长度为60bp，比对数据库为Centrifuge自带的nt数据库。比对结果使用Pavian进行可视化分析。

实施例

在健康人咽拭子中，人为地加入一种不同浓度的特定病原，分别开展基于上述方法的宏基因组病原检测和荧光定量PCR法病原检测，结果发现该方法的检测结果与荧光定量PCR法结果具有较高的一致性，且检测获得的病原序列数，与样本中的病原浓度和荧光定量PCR的Ct值均具有较高的相关性。

在此基础上，在健康人咽拭子中同时加入多种不同种类的病原，该方法同样也能同时检测出这几种病原，证明了该方法可以实现对咽拭子中不同类型病原的同时检测，有望进一步推广应用于咽拭子样本的病原宏基因组检测。

实验具体步骤以及结果如下：

通过在咽拭子中加入已知浓度病原的模拟样本进行宏基因组测序检测。采集了7例健康人咽拭子样本，将其混合后，加入已知浓度并梯度稀释的病毒(人腺病毒55型、甲型H1N1流感病毒)、细菌(金黄色葡萄球菌CICC 21600、肺炎克雷伯菌KBJ001(本实验室保存临床分离株))、真菌(烟曲霉Af293)5种不同种类的呼吸道病原，分别建立呼吸道单病原与多病原模拟样本。

对模拟样本进行本发明方法的核酸提取与建库测序，同时对上述样本采用实时荧光定量PCR法对上述病原进行检测，评估DNA/RNA共测序的方法对不同类型病原体的检测效果，分析不同浓度及不同物种对宏基因组测序病原体检测结果的影响。

结果表明，针对单病原样本，本发明方法检测到的目标病原序列数，与样本中原始病原浓度及荧光定量PCR检测Ct值之间，均呈现出一定的线性关系；针对多病原样本，本发明方法在5例不同稀释梯度的多病原样本中均检出了5种目标病原序列，证明了该方法可以实现对样本中多种不同类型病原的同时检测，也为急性呼吸道感染病原监测提供了一种新的方法。

1.健康人混样咽拭子荧光定量PCR检测

对健康人咽拭子混样后，使用荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、甲型流感病毒、人腺病毒、烟曲霉、人六个物种，荧光定量PCR结果如图1所示。

红色曲线为阳性对照扩增曲线，绿色曲线为样本扩增曲线。由图中可知，健康人混样咽拭子中，金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、甲型流感病毒、人腺病毒、烟曲霉均未出现扩增，但样本中宿主(人)基因出现扩增曲线，说明样本中含有宿主核酸，但金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、甲型流感病毒、人腺病毒、烟曲霉5种病原的荧光定量PCR检测结果均为阴性。

2.单病原模拟样本的建立与荧光定量PCR检测

将金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、烟曲霉、甲型流感病毒、人腺病毒5种模拟病原梯度稀释后加入健康人咽拭子中，每种病原设置7个梯度，共计35例样本。对上述样本进行核酸提取，并进行对应病原的荧光定量PCR检测，结果如表1所示。烟曲霉的最低检测限为10³稀释倍数，金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌的最低检测限为10⁴稀释倍数，甲型流感病毒的最低检测限为10⁵稀释倍数，人腺病毒在7个稀释倍数下均能检测到。对模拟样本病原稀释倍数与Ct值绘制散点图，可见病原稀释倍数与Ct值之间具有一定的线性关系(图2)。

表1单病原模拟样本中病原荧光定量PCR检测Ct值

3.多病原模拟样本的建立与荧光定量PCR检测

参照单病原模拟样本Ct值，在健康人咽拭子中同时加入5种不同稀释倍数的模拟病原，建立5份多病原样本(表2)。对多病原样本中每种病原含量进行荧光定量PCR检测，结果如表3所示。样本1、2、3、4中均同时检出5种病原，且Ct值随稀释倍数的增大而增大。样本5中5种病原均未检出，考虑由于样本中病原核酸含量低于荧光定量PCR检测限所致。

表2多病原模拟样本中病原浓度

表3多病原模拟样本中病原荧光定量PCR检测Ct值

4.模拟样本测序结果

对选取的30例模拟样本进行本发明方法的宏基因组测序(表4)。30例模拟样本的平均序列数为42,455,255条，平均宿主序列占比为68.27％。对样本中金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、烟曲霉、甲型流感病毒、人腺病毒5种病原的序列数进行统计，结果如表5所示。在单病原模拟样本中，病原序列数随稀释倍数增加而呈减少趋势。在多病原样本中，5例样本均同时检出了预添加的5种病原的序列。

表4 32例测序样本信息

表5样本中不同病原检出序列数

为评估病原稀释浓度与病原基因组测序深度间的关系，以金黄色葡萄球菌单病原样本为例，将样本中金黄色葡萄球菌序列与金黄色葡萄球菌参考基因组ATCC 27217进行比对，得到5个样本对金黄色葡萄球菌基因组的测序深度，并将测序深度值绘制成折线图(图3)。由图中可知，样本SA-0和SA-1的所有位点的测序深度均大于1，而样本SA-2、SA-3、SA-4的测序深度的平均值小于1，说明当样本中病原浓度较大时，通过宏基因组测序方法可以检测到病原体基因组的完整序列，但随着病原浓度的减小，病原的测序深度也会随之减小，只能检测到部分基因组序列片段，无法获得完整的基因组信息。另外，我们观察到测序深度与病原稀释倍数之间并不是呈线性变化的，当样本中病原浓度较高时，测序深度随病原浓度降低而明显降低，但当样本中病原浓度较低时，测序深度随病原浓度变化不显著，此时想要获取更高的测序深度则需要进一步增加测序数据量。

对比例1

Carrier RNA验证实验：

为验证添加Carrier RNA对核酸提取与建库的影响，设计以下五个样本：

样本1：纯水+加carrier RNA，进行核酸提取与建库；

样本2：临床样本+不加carrier RNA，进行核酸提取与建库；

样本3：临床样本+加carrier RNA进行核酸提取，提取后增加一步RNase消化后进行建库；

样本4：临床样本+加carrier，进行核酸提取与建库，做到末端修复步骤停止；

样本5：临床样本+加carrier，进行核酸提取与建库，做到接头连接步骤停止；

在以下四个时间节点(均为建库中的环节，按时间先后顺序)留取部分样本进行琼脂糖电泳质检，左一为2000bp DNA marker：

1：物理超声进行片段打断后

2：磁珠片段筛选完

3：PCR纯化后

4：原始核酸

结果见图4：原始核酸均可见片段较大，物理打断后片段大多集中于100-1000bp区间，磁珠片段筛选完后片段更为集中，但在PCR后，可见1，3，4，5号片段均出现异常的大于2000bp的大片段，而2号的片段大小仍为500bp左右，属于文库的正常片段。1号为纯水+加carrier RNA，3号临床样本+加carrier RNA进行核酸提取，提取后增加一步RNase消化，说明引起异常大片段的主要原因是Carrier RNA，且RNase消化也不能去除Carrier RNA。4号和5号样本是不同时间节点的同一个样本，说明加入Carrier RNA的样本会出现异常大片段，且这一问题出现在末端修复这一环节。2号样本PCR纯化后的电泳图像说明，不加入Carrier RNA的样本同样也可以成功建库。基于上述结果，本方案在核酸提取过程中删去了加Carrier RNA这一环节。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。