一种dna甲基化靶向富集的方法及其应用
阅读说明：本技术 一种dna甲基化靶向富集的方法及其应用 (Method for DNA methylation targeted enrichment and application thereof ) 是由 李小刚 贾鑫淼 肖盟 徐英春 于 2021-01-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种DNA甲基化靶向富集的方法,特异性富集甲基化修饰DNA片段。通过本发明所得到的靶向富集后的DNA可广泛应用于下游诸多分子诊断,如基于检测母体血浆中胎儿游离DNA的无创性产前分子诊断(NITP),病原微生物检测,肿瘤伴随诊断等。(The invention discloses a method for the methylation targeted enrichment of DNA, which specifically enriches methylation modified DNA fragments. The DNA obtained by the invention after targeted enrichment can be widely applied to downstream molecular diagnosis, such as noninvasive prenatal molecular diagnosis (NITP) based on detection of fetal free DNA in maternal plasma, pathogenic microorganism detection, tumor concomitant diagnosis and the like.)
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种DNA甲基化靶向富集的方法及其应用。
背景技术
自从Mander和Metais于1948年发现人体外周血中存在着细胞外游离DNA和RNA后，游离核酸的检测作为一种有效的微创性诊疗手段广泛应用于临床的各个方面，如肿瘤的发生发展、妊娠相关性疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤急救医学等，其检测在疾病的早期诊断、分期、治疗检测、预后判断以及产前分子诊断等方面有着重要意义。
来自美国宾夕法尼亚大学的研究人员便注意到了AID/APOBEC家族DNA脱氨酶的酶促脱氨作用。这种脱氨反应可以实现亚硫酸氢盐的作用，且不会损伤DNA。基于此，研究人员开发了一种全新的表观遗传测序方法ACE-seq(APOBEC-coupled epigeneticsequencing)，而无需亚硫酸氢盐，可在单碱基分辨率条件下进行5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的检测定位，获得高置信度的5hmC图谱。更重要的是，该方法所需DNA样本量比目前的金标准技术少1000倍。ACE-seq方法使用的是一种被称为“APOBEC”的脱氨酶。该脱氨酶可以在有效区分不同胞嘧啶修饰状态的同时，避免损伤DNA。经验证，该方法对胞嘧啶修饰状态的识别性能与亚硫酸氢盐相似。ACE-seq的一个重要特性就是能够稳定的从胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶(5mC)中区分5hmC，这使得5hmC的高可信度分析成为可能。
CN 105648537 B报道了利用鼠Tet氧化酶或其重组酶将甲基胞嘧啶氧化为5-羟甲基胞嘧啶再将5-羟甲基胞嘧啶进行生物素标记进行富集的方法。然而目前Tet氧化酶并不能将5-甲基胞嘧啶完全转化为5-羟甲基胞嘧啶，而且会进一步氧化为5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶，因此该方法存在一定的损失。
其他游离DNA的甲基化富集目前仍未见报道，因此开发更加优良的靶向富集甲基化DNA片段，进而构建甲基化特异片段DNA文库测序在疾病的早期诊断、分期、治疗检测、预后判断以及产前分子诊断等方面有着重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA甲基化靶向富集的方法，特异性富集甲基化修饰DNA片段。
病原微生物含有5-甲基胞嘧啶(5mC)，但不含5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5-醛基胞嘧啶(5fC)，5-羧基胞嘧啶(5caC)，因此通过靶向捕获5mC，能提高DNA样本里面病原微生物的DNA含量。
基于此，本发明提供了一种DNA甲基化靶向富集的方法，该方法是体外方法，其包括如下步骤：
(1)样本DNA片段化；
(2)以胸腺嘧啶DNA糖基化酶处理片段化的DNA，将DNA中5-羧基胞嘧啶切除，通过DNA剪切修复途径，在5-羧基胞嘧啶切除位点加上非甲基化的胞嘧啶；该步的目的是去除DNA本身含有的5-羧基胞嘧啶。
(3)利用转糖酶将带有葡糖基的糖化物共价连接到步骤(2)获得的DNA的5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，形成β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶(5gmC)；
该步可以避免5hmC的干扰，这步对于病原微生物诊断非常重要。
(4)利用双加氧酶处理DNA或者利用其他化学法，将DNA中5-甲基胞嘧啶转变为5-羧基胞嘧啶或者5-醛基胞嘧啶；
(5)将步骤(4)的产物利用化学标记的方法继续富集，之后进行测序。
优选的，步骤(1)所述胸腺嘧啶DNA糖基化酶的用途，用于将DNA中5-羧基胞嘧啶切除；或用于制备将DNA中5-羧基胞嘧啶切除的组合物。(较佳地，所述用途为非治疗性和非诊断性的)。
在另一优选例中，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶包括：全长的胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其保留酶活性的片段或衍生物，如Flag-TDG。
优选的，所述转糖酶包括但不限于βGT、αGT及其重组酶；所述葡糖基的糖化物包括但不限于尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)或其他修饰的糖类。
优选的，本发明提供的双加氧酶的用途，用于将DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)转变为5-羧基胞嘧啶(5caC)；或用于制备将DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)转变为5-醛基胞嘧啶(5fC)的组合物，如图1所示。较佳地，所述用途为非治疗性和非诊断性的。
具体的5mC氧化到5Cac的步骤如下：
如，50ngDNA在50μl溶液中孵育，该溶液包含50mM MOPS缓冲液(pH6.9)，100μM硫酸铁(II)铵，1mMα-酮戊二酸酯，2mM抗坏血酸，1mM二硫苏糖醇，50mM NaCland 5μM NgTET1在37℃下放置1小时。之后，将4U蛋白酶K(New England Biolabs)加入反应混合物中，并在37℃下孵育30分钟。之后纯化产物。
50ngDNA在含有50mM HEPES缓冲液(pH 8.0)，100μM硫酸铁(II)铵，1mMα-酮戊二酸，2mM抗坏血酸，1mM二硫苏糖醇，100mM NaCl，1.2mM ATP和4μM的50μl反应液中孵育mTet1CD在37℃下放置80分钟。之后，将0.8U的ProteinaseK(New England Biolabs)加入反应混合物中，并在50℃保温1小时。之后纯化。
在另一优选例中，所述双加氧酶包括Tet或其他双加氧酶ALKB家族等，所述Tet双加氧酶包括：Tet1、Tet2或Tet3或它们的保留催化结构域并具有催化活性的片段或衍生物，如Tet1CD、Tet2CD或Tet3CD。
优选的，所述化学标记的方法继续富集，具体是通过5caC的羧基和带有伯胺基的生物素修饰小分子形成酰胺建；
如，5caC DNA，加入4-甲氨基苯叠氮化物(10mM)，EDC(2mM)，Mes(pH＝6.0,75mM)37℃孵育1小时。加入150μM生物素修饰的二苯并环辛炔，37℃孵育2小时。
优选的，催化反应式剂包括不限于1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳二亚胺盐酸盐(EDC)催化。
之后通过固相材料包括直径1nm至100um的磁性小球，直径1nm至100um的琼脂糖小球，直径1nm至100um的人工高分子小球，带有表面修饰(链酶亲和素或其他的配体受体，根据配对的小分子修饰进行调整)。
优先的，所述步骤(4)中的建库的方法包括新型单碱基分辨技术进行建库。
所述新型单碱基分辨技术进行建库过程如下：采用商品化甲基化建库试剂盒或者DNA，亚硫酸氢盐测序Qiagen(180502QIAsaq Mehtyl library kit)或者NEB的商品化试剂盒(E7120S NEBNext酶学转化法甲基化建库试剂盒)。
进一步地，本发明还提供了所述方法在微生物菌种分型鉴定中的应用和分子诊断中的应用。
所述分子诊断包括无创性产前分子诊断，病原微生物检测，肿瘤伴随诊断。
更进一步地，本发明还提供了一种DNA靶向富集与检测试剂盒，该试剂盒包括：转糖酶、氧化酶、纯化试剂、引物接头。
有益效果
本发明的试剂盒及其方法通过靶向去除样本DNA中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5-醛基胞嘧啶(5fC)，5-羧基胞嘧啶(5caC)，从而达到特异性地靶向富集甲基化DNA片段，可提高的富集的灵敏度和准确度。通过本发明中试剂盒及方法靶向富集后的DNA可广泛应用于下游诸多分子诊断，如基于检测母体血浆中胎儿游离DNA的无创性产前分子诊断(NITP)，病原微生物检测，肿瘤伴随诊断等等。
附图说明
图1 5mC选择性氧化为5caC示意图；
图2片段化后琼脂糖电泳检测结果；
图3新生隐球菌和哥特隐球菌甲基化分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
一种DNA甲基化靶向富集的方法，该方法是体外方法，其包括如下步骤：
(1)样本DNA片段化；
(2)以胸腺嘧啶DNA糖基化酶处理样本提取得到的DNA，将DNA中5-羧基胞嘧啶切除，通过DNA剪切修复途径，在5-羧基胞嘧啶切除位点加上非甲基化的胞嘧啶；该步的目的是去除DNA本身含有的5-羧基胞嘧啶。
(3)利用转糖酶将带有葡糖基的糖化物共价连接到步骤(2)获得的DNA的5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，形成β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶(5gmC)；
该步可以避免人的5hmC的干扰，这步对于病原微生物诊断非常重要。
(4)利用Tet双加氧酶处理DNA或者利用其他化学法，将DNA中5-甲基胞嘧啶转变为5-羧基胞嘧啶或者5-醛基胞嘧啶；
(5)将步骤(4)的产物利用化学标记的方法继续富集，之后进行建库测序。
实施例2：
1.采用哥特隐球菌(NIH76，ATCC)和新生隐球菌H99(BNCC290220，贝纳生物)的基因组DNA作为模型。
基因组DNA 200ng(真菌基因组DNA提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司，货号:D2300)与质控DNA(CpG methylated pUC19和未甲基化lambda DNA混合于50μL pH 8.0的0.1X TE缓冲液。
2.混合的DNA利用Covaris超声破碎进行片段化240–290bp。
氧化捕获部分
3.50ngDNA在含有50mM HEPES缓冲液(pH 8.0)，100μM硫酸铁(II)铵，1mMα-酮戊二酸，2mM抗坏血酸，1mM二硫苏糖醇，100mM NaCl，1.2mM ATP和4μM的50μl反应液中孵育mTet1CD在37℃下放置80分钟。之后，将0.8U的ProteinaseK(New England Biolabs)加入反应混合物中，并在50℃保温1小时。之后纯化。
4.步骤3的产物5caC DNA，加入4-甲氨基苯叠氮化物(10mM)，EDC(2mM)，Mes(pH＝6.0,75mM)37℃孵育1小时。
5.加入150μM生物素修饰的二苯并环辛炔，37℃孵育2小时，使用QIAquickNucleotide Removal Kit(QIAGEN)纯化。加入100mM DTT，37℃孵育2小时。
直接测序
与二代测序需要的测序接头引物连接(NEB)，具体步骤参照NEBNext EnzymaticMethyl-seq kit(NEB，E7120S)说明进行，按照以下程序进行PCR循环，磁珠纯化后，上机测序。
表1 PCR循环程序
CYCLE STEP
TEMP
TIME
CYCLES
Initial Denaturation
98℃
30seconds
1
Denaturation
98℃
10seconds
4-8*
Annealing
62℃
30seconds
Extension
65℃
60seconds
Final Extension
65℃
5minutes
1
Hold
4℃
生物信息学分析
使用R包软件进行生物信息学分析，经过样品质控，数据过滤，与NCBI的参考基因组比对，进行差异分析以及差异甲基化区域的检测与注释。图3显示，两种菌的甲基化水平和位点明显不同，可作为菌种分型鉴定。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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